Summary
Ce protocole décrit une technique de différenciation endothéliale de cellules progénitrices cardiaque. Il se concentre particulièrement sur comment la concentration sérique et la densité cellulaire-ensemencement affectent le potentiel de différenciation endothéliale.
Abstract
Progéniteurs cardiaques (CPCs) peuvent avoir un potentiel thérapeutique pour la régénération cardiaque après une blessure. Dans le cœur des mammifères adult, CPCs intrinsèques sont extrêmement rares, mais élargis CPC pourraient être utiles pour la thérapie cellulaire. Une condition préalable à leur utilisation est leur capacité à se différencier de manière contrôlée dans les diverses lignées cardiaques à l’aide de protocoles définis et efficaces. En outre, lors de l’expansion in vitro , CPCs isolement de patients ou modèles précliniques de maladies peuvent offrir des outils de recherche fructueux pour l’étude des mécanismes des maladies.
Les études en cours permet d’identifier les CPCs différents marqueurs. Cependant, tous ne sont exprimés chez les humains, qui limite l’impact translationnelle de certaines études précliniques. Protocoles de différenciation qui s’appliquent quelle que soit l’expression technique et marqueur d’isolation permettra l’expansion normalisée et l’amorçage des SCD fins de thérapie cellulaire. Nous décrivons ici que l’amorçage des SCD dans des conditions de densité faible et une concentration faible sérum fœtal (SVF) facilite la différenciation endothéliale de CPCs. à l’aide de deux différentes sous-populations de souris et rat CPCs, nous montrons que la laminine est un plus substrat approprié que la fibronectine, à cet effet sous le protocole suivant : après mise en culture pour 2 ou 3 jours en moyenne, y compris les suppléments qui maintenir multipotentialité et avec 3,5 % FBS, SCD sont ensemencées sur laminin à < 60 % confluence et cultivées dans milieu sans supplément avec de faibles concentrations de FBS (0,1 %) pendant 20 à 24 heures avant la différenciation dans le milieu de la différenciation endothéliale. CPCs étant une population hétérogène, les concentrations sériques et temps d’incubation devrez peut-être être ajustée en fonction des propriétés de la sous-population de CPC respectif. Compte tenu de cela, la technique peut être appliquée à d’autres types de CPCs ainsi et fournit une méthode utile pour étudier le potentiel et les mécanismes de différenciation et comment ils sont touchés par la maladie lors de l’utilisation de CPCs isolées de modèles de maladies respectives.
Introduction
Des études récentes soutiennent l’existence de progéniteurs cardiaques résidents (CPCs) dans le cœur des mammifères adultes1,2,3, et CPC pourraient constituer une source utile pour la thérapie cellulaire après lésion cardiaque4, 5. en outre, CPCs élargis peuvent fournir un modèle fructueux pour le dépistage des drogues et l’étude des mécanismes de la maladie quand isolées de patients atteints de cardiomyopathie rare, ou contre les maladies modèles6,7.
SCD isolé du cœur adultes possède des souches/progénitrices cellule caractéristiques1,2,3,8 car ils sont multipotentes, clonogéniques, et ont la capacité d’auto-renouvellement. Cependant, il y a beaucoup de populations différentes (void) des SCD présentant des profils de différents marqueurs de surface, y compris, par exemple, c-kit, Sca-1 et autres, ou récupérée par les techniques d’isolation différents (tableau 1). Plusieurs protocoles de culture et de la différenciation ont été établies1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Ces protocoles varient principalement en ce qui concerne le facteur de croissance et de la teneur en sérum, qui sont ajustés selon le dessein de la culture et qui peut conduire à des différences dans les résultats, y compris l’efficacité de la différenciation.
Techniques d’isolement basé sur le marqueur :
Les CPC peuvent être isolés basé sur un marqueur de surface spécifique expression1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Des études antérieures suggèrent que le c-kit et Sca-1 peuvent être les meilleurs marqueurs pour isoler les résidents SCD1,11,14,19,20. Car aucun de ces marqueurs est vraiment spécifique pour les CPC, combinaisons de différents marqueurs sont généralement appliqués. Par exemple, tandis que la SCD expriment des niveaux faibles de c-kit21, c-kit s’exprime également par d’autres types de cellules, y compris les mastocytes22, cellules endothéliales23et de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques24. Un autre problème est le fait que pas tous les marqueurs sont exprimés dans l’ensemble de toutes les espèces. C’est le cas pour Sca-1, qui se déclare chez la souris mais pas chez les humains25. Par conséquent, en utilisant les protocoles qui sont indépendants des marqueurs de l’isolement peut être avantageuse au vu des essais cliniques et études à l’aide d’échantillons humains.
Techniques d’isolement indépendant du marqueur :
Il y a plusieurs techniques majeurs d’isolement de la CPC, qui dépendent principalement de l’expression du marqueur de surface, mais qui peut être affinée par la sélection consécutive des sous-fractions de marqueurs positifs spécifiques si nécessaire (voir également tableau 1). (1) la technique de population (SP) de côté a initialement été caractérisée chez une population primitive de cellules souches hématopoïétiques, basé sur la capacité d’efflux de la teinture d’ADN Hoechst 3334226 par ATP-binding cassette (ABC) transporteurs27. Les cellules cardiaques de SP ont été isolés par différents groupes et signalés d’exprimer une variété de marqueurs avec quelques différences mineures entre les rapports2,8,13,14. (2) cellules de fibroblaste unité formant colonie (UFC-Fs) ont été définis initialement basé sur une cellule stromale mésenchymateuse (CSM)-comme le phénotype. MSCs isolés sont cultivées sur la vaisselle pour induire la formation de colonies. Tel formatrices MSC-comme UFC-Fs peut être isolé du cœur adult et sont capables de se différencier en lignées cardiaque15. (3) Cardiosphere-dérivés des cellules (CDC) sont de simples cellules provenant d’amas de cellules issues de biopsies tissulaires ou explants28,29,30,31. Il a été démontré récemment que pour la plupart la CD105+/CD90 fraction de cellules /c-kit– –pièces cardiomyogénique et potentiel régénératif32.
Ici, à l’aide de SP-CPCs isolés de souris, nous fournissons un protocole pour l’induction efficace de lignée endothéliale basée sur une étude antérieure au SCD de rat et souris SP-SCD33. Le protocole contient des adaptations spécifiques à la culture et technique de l’expansion en ce qui concerne la densité de la cellule, le contenu du sérum du milieu et le substrat. Il peut être appliqué non seulement aux souris SP-SCD, mais aux différents types de CPC dans le but d’induire un commutateur sort d’une amplification à un CPC endothéliales-commis, que ce soit en vue de la transplantation de ces cellules ou leur utilisation pour des études mécanistiques in vitro .
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Protocol
L’utilisation de souris aux fins de l’isolement cellulaire a été conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et avec la loi de Protection animale Suisse et a été approuvée par les autorités cantonales suisses.
Remarque : L’isolement de Sca-1+/CD31– SP-CPC du coeur de souris se faisait essentiellement comme décrit précédemment34 avec quelques modifications. Pour le matériel et les réactifs utilisés, consultez la Table des matières. Pour toutes les expériences, SP-CPCs cardiaques isolés de souris ont été amplifiés, repiquées et utilisées de manière semblable ligne cellulaire. Passages 7-20 ont été utilisées pour cette étude.
1. préparation du tissu
Remarque : Toutes les expériences à l’aide de la souris doivent effectuer selon les lignes directrices et les règlements. Ce protocole utilise quatre souris. Plaques de culture qui sont de 100 mm de diamètre sont décrits comme P100 et plaques de culture qui sont de 60 mm de diamètre sont décrits comme P60 pour les parties suivantes du protocole.
- Injecter chaque souris avec 200 mg/kg de pentobarbital par voie intrapéritonéale (i.p.) et attendez qu’il est complètement anesthésié en vérifiant sa réponse aux pieds de pincement.
- Essuyer la poitrine avec l’éthanol à 70 %. Couper la peau et la paroi thoracique avec des ciseaux pour exposer la cavité thoracique.
- Soulever le cœur avec une pince et le couper à la base à l’aide de ciseaux. Mettre le coeur dans un P100 avec 25 mL (5 mL pour P60) de froide saline tamponnée au phosphate (PBS) (trois à cinq cœurs par P100) ou un ou deux cœurs par P60.
- Pomper le cœur avec une pince à éjecter le sang hors des cavités (Figure 1 a).
- Mettre le coeur dans un P100 avec 25 mL (5 mL pour P60) de PBS froid pour le lavage. Supprimer les oreillettes à l’aide de petits ciseaux. Couper le coeur en deux pièces longitudinales et les laver à nouveau dans du PBS glacee (25 mL/P100, 5 mL/P60).
- Transférer les morceaux dans un nouveau P100 avec 25 mL (5 mL pour P60) de PBS froid. Couper les morceaux en petits morceaux à l’aide de petits ciseaux (Figure 1 b). Ajouter une goutte de collagénase de 1 mg/mL B dilué dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et émincer les petits morceaux soigneusement avec une lame de rasoir stérile (Figure 1).
2. la digestion
- Ajouter 10 mL (2,5 mL pour P60) de la solution de B de collagénase de 1 mg/mL dans le plat à partir de l’étape 1.6.
- Mettre la solution de collagènase B contenant les morceaux de cœur hachées dans un incliné (30° environ) P100 (ou P60) dans un incubateur à 37 ° C (Figure 1).
- Incuber les morceaux de cœur hachée pour un maximum de 30 min ; homogénéiser en les passant à plusieurs reprises grâce à une pipette Pasteur toutes les 10 min pendant l’incubation (Figure 1E).
Remarque : Il est important pour ne pas dépasser 30 min d’incubation au total pour l’étape 1.3.
3. filtration
- Ajouter 10 mL (5 mL pour P60) de HBSS froide additionné de 2 % BF pour les morceaux de coeur émincé et homogénéisé.
NOTE : HBSS additionné de 2 % FBS désaltère collagénase activité B. - Filtrer les morceaux de cœur sur 100 µm filtre pour enlever les tissus non digérés et centrifuger à 470 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) (Figure 1F, filtres jaunes).
- Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 5 mL (3 mL pour P60) de tampon de lyse des globules rouges et incuber le granule pendant 5 min avec agitation occasionnels sur la glace.
- Ajouter 10 mL (5 mL pour P60) de PBS (pour arrêter la réaction de lyse) et filtrer l’échantillon à travers un filtre de 40 µm à exclure des cellules plus grandes, y compris des cardiomyocytes résiduelles (Figure 1F, filtres bleu).
- Centrifuger le tube à 470 x g pendant 5 min à RT (sans frein). Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 1 mL de DMEM dont 10 % FBS.
- Compter les cellules dans une partie aliquote avec un hémocytomètre. Remettre en suspension les cellules avec DMEM dont 10 % FBS, visant à une concentration finale de cellule de 1 x 106 cellules/mL.
NOTE : Environ 5 x 106 cellules de cardiomyocyte et érythrocytes-appauvri peuvent être estimées par la souris. - Distribuer les cellules dans les deux tubes (Figure 2) : dans le tube A, ajouter 1,5 mL pour Hoechst 33342 souiller avec vérapamil ; dans le tube B, ajouter 18,5 mL pour la coloration de Hoechst 33342 et procéder à la tache et trier des cellules cardiaques de SP (mesures 4.1 et 4.2) par cytométrie en flux.
4. le tri des cellules cardiaques SP par cytométrie en flux
NOTE : Vérapamil inhibe l’efflux de Hoechst en bloquant la multirésistance activité de transporteur ABC (MDR). Hoechst 33342 est un colorant de liaison à l’ADN qui permet de détecter le cycle cellulaire, tel qu’il est en corrélation avec le contenu en ADN dans les cellules vivantes. Hoechst 33342-extrusion de cellules s’affichent dans la partie basse de Hoechst sur les deux canaux d’émission (450 nm, Hoechst bleu ; 650 nm, rouge de Hoechst), c'est-à-dire annuler le Hoechst rétention d’eau « population principale », ce qui leur donne leur nom « côté la population ». SP, les cellules sont plus riches en cellules ayant des propriétés de progéniteurs et montrent une forte expression de pharmaco-résistante transporteurs ABC (comme MDR1 et ABCG2). Hoechst 33342 est écrit comme Hoechst pour les parties suivantes du protocole. Il est important de protéger les matériaux sensibles à la lumière des résultats idéaux.
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Coloration avec Hoechst en présence et en absence du vérapamil
- Ajouter le vérapamil (avec une concentration finale de 83,3 µM) et Hoechst (avec une concentration finale de 5 µg/106 cellules) à la solution de la cellule. Pour tube A, utilisez vérapamil et Hoechst ; pour tube B, réservée aux Hoechst. Incuber dans un bain d’eau (à 37 ° C) pendant 90 min et change les tubes toutes les 20 min (Figure 1).
- Centrifuger les tubes à 470 x g pendant 5 min à RT. jeter le surnageant et remettre chaque culot en suspension dans HBSS (1 x 106 cellules/mL).
- Prendre un 1.5 mL aliquote pour salissures unique et le contrôle négatif du tube B (Figure 2) : (i) l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-conjugué anti-Sca-1 ; (ii) allophycocyanin (APC)-conjugué anti-CD31 ; (iii) nonstained des cellules (témoin négatif).
Remarque : Isotype contrôles sont utilisés ici pour mettre en place le protocole d’isolement. - Tubes de centrifugation A et B et les aliquotes de coloration unique et négatif de contrôle à 470 x g pendant 5 min à RT pour le lavage de Hoechst et de vérapamil.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension les boulettes du tube A et (iii) le témoin négatif dans 250 µL de HBSS et conservez-les sur la glace dans l’obscurité jusqu’au tri.
- Resuspendre le culot du tube B dans 200 µL de HBSS et le culot (i, ii) les aliquotes de coloration unique dans 100 µL de HBSS. Ajouter conjugué FITC anti-Sca-1 (0,6 µg/107 cellules) et APC conjugué anti-CD31 (0,25 µg/107 cellules). Incuber les boulettes pendant 30 minutes sur la glace et les secouer de temps en temps dans l’obscurité.
- Ajouter 2 mL de HBSS aux tubes. Centrifuger les tubes à 470 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension les granules tous les 1 ml de HBSS et centrifuger comme ci-dessus. Jeter le surnageant. Resuspendre le culot des aliquotes de coloration unique dans 200 µL de HBSS. Resuspendre le culot du tube B dans HBSS (20 x 106 cellules/mL).
- Conserver les échantillons sur la glace et l’abri de la lumière jusqu’au tri.
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Tri par cytométrie en flux
- Préparer stérile de 1,5 mL tubes avec 500 µL de HBSS dont 2 % de tri FBS.
- Colorer les cellules avec 7-aminoactinomycine D (7-AAD) (0,15 µg/106 cellules) sur la glace pendant 10 min pour exclure les cellules mortes.
- Trier le SP cardiaque en utilisant les paramètres suivants : exciter Hoechst à l’aide d’une excitation de 350 nm (UV), émission de fluorescence avec un filtre passe-bande à 450/50 nm (Hoechst bleu) et un filtre passe-bande à 670/30 nm (Hoechst rouge) de percevoir et utiliser une taille de gicleur de 100 µm et la pression de 15 lb/po2.
- Pour analyse, inscrivez 5 x 105 événements pour les tri des échantillons et 1 x 105 événements pour le contrôle négatif, contrôle de vérapamil et single-coloration des échantillons.
Remarque : Le cardiaque SP est d’environ 0,5 % - 2 % (Figure 1 H) mais peut varier entre les laboratoires et les isolats. La Sca-1+/CD31– fraction est d’environ 1 % à 11 % du total PS cardiaque (Figure 1I) mais peut varier entre les laboratoires et les isolats. SCA-1+/CD31– SP-SCD est écrites comme SP-CPC pour les parties suivantes du protocole.
5. primaire Culture des isolés SP-SCD
NOTE : Les trois différents types de médias ont été utilisés dans le présent protocole. Ils sont dénommés moyen 1 (selon Noseda et al.) 8, moyen 2 et 3 moyennes et sont décrits dans la Table des matières au sujet de leur composition.
- Réchauffer en moyenne 1 à 37 ° C avant utilisation et refroidir le centrifuger à 4 ° C. Centrifuger les tubes tris à 4 ° C et 470 x g pendant 6 min et remettre en suspension les cellules en moyen 1.
- Mettre les cellules sur un plat de P60 perméable au gaz avec 4 mL de milieu 1. Changer le support tous les 3 jours jusqu'à ce que les cellules ont atteint 70 % - 80 % confluence.
NOTE : Étape 5.2 peut prendre environ 2-3 semaines.
6. l’expansion et la différenciation des SP-SCD
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Culture cellulaire
- Culture 3 x 105 SP-SCD dans 8 mL de milieu 1 dans une fiole de T75.
- Incuber SP-SCD à 37 ° C, avec 5 % de CO2 jusqu’au confluent de 70 à 80 %, changeant le milieu chaque 2-3 jours.
Remarque : Le nombre de cellules doit être modifié selon le type de CPCs utilisé, le temps de doublement et la taille des cellules.
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SP-CPC croissance et la viabilité sous différents taux sériques
- La culture SP-CPCs pendant 2-3 jours dans des flacons de T75 avec 8 mL de milieu 1. Aspirer le support avec précaution et rincer doucement avec 5 mL de tiède (37 ° C) HBSS.
- Traiter les cellules avec 5 mL d’EDTA-trypsine pendant 5 min dans un incubateur à cellules, ajouter 5 mL de milieu 1 d’arrêter l’activité de la trypsine et transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 mL.
- Centrifuger les cellules à 470 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Remettre en suspension les cellules moyen 1 ou 2 Medium (milieu d’induction de lignée) et plaque 2,5 x 105 SP-SCD sur P60 plats avec 3 mL de milieu contenant des concentrations sériques différents.
- Recueillir le milieu du plat de marche 6.2.4 pour la collection de cellules mortes dans un tube de 15 mL après 2 jours de culture en moyenne 1 ou 2 moyennes.
- Trypsinize des cellules adhérentes comme au point 6.2.2 et récupérer la suspension cellulaire dans le tube de 15 mL d’étape 6.2.5. Centrifuger les cellules à 840 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer le surnageant et ajouter 1 mL de moyen 1 ou 2 de moyenne pour le comptage des cellules. Détachant SP-SCD avec le bleu trypan (0,4 %) et le comte trypan blue positifs (morts) et trypan blue négatif (viable) cellules.
Remarque : La viabilité de cellules (étape 6.2.7) est administrée par le nombre de bleu trypan cellule négative par rapport au nombre total de cellules.
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Induction de la différenciation endothéliale
- Précouche une plaque de culture (6 puits) 10 µg/ml de laminine (LN) ou la fibronectine (FN).
- Préparer une solution de substrat contenant 10 µg/mL de LN ou FN avec F12 medium (ou PBS). Ajouter 2 mL de solution de substrat dans chaque puits. Maintenir la plaque pendant 30 min à 37 ° C.
- Aspirer la solution de la plaque et ajouter 2 mL de PBS dans chaque puits jusqu'à l’utiliser.
- Aspirez le milieu des cellules de l’étape 6.1.2, rincez-les délicatement avec 5 mL de tiède (37 ° C) HBSS, traitez-les avec 5 mL d’EDTA-trypsine pendant 5 min dans un incubateur à cellules, ajouter 5 mL de milieu 1 d’arrêter l’activité de la trypsine et transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 mL.
- Centrifuger les cellules à 470 x g pendant 5 min à RT. aspirer le surnageant et ajouter 2 Medium pour le comptage des cellules.
- Cellules4 graines 8 x 10 / bien sur la plaque de revêtement avec 3 mL de milieu 2 et le maintenir à 37 ° C pendant 20 à 24 h. changement du milieu à 3 mL de milieu 3.
Remarque : Nous recommandons d’utiliser un milieu contenant une concentration sérique — et sans suppléments — pour la premier 20 à 24 heures. Nous avons recommandé à l’aide de < confluence de cellule de 60 % (c.-à-d., le nombre de cellules de l’étape 6.3.4 doit être adaptée en fonction du taux de taille et la croissance cellulaire). - La culture des cellules pendant 21 jours et changer le support tous les 3 jours.
- Vérifier la nature endothéliale de cellules différenciées par leur coloration avec un marqueur endothélial tels que von Willebrand Factor (vWF) et performante la microscopie de fluorescence.
- Laver les cellules avec 1 mL de PBS et fixer les cellules en formaldéhyde de 3,7 % pendant 2 min à température ambiante.
- Permeabilize les cellules avec 0,1 % Triton X FD2O (ou PBS) pendant 30 min et bloquez-le avec 10 % de sérum de chèvre pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber les cellules avec l’anticorps d’anti-von Willebrand factor (1/100) pendant 48 h à 4 ° C
- Laver les cellules 3 x 1 ml de PBS, pendant 10 minutes chaque fois. Incuber les avec l’anticorps secondaire Alexa Fluor 546 chèvre anti-lapin (1/500) pendant 1 heure à ta dans l’obscurité.
- Lavez à nouveau 3 x, pour 10 min chacun, avec 1 mL de PBS. Tacher les noyaux cellulaires avec 4'6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate (DAPI ; 1/500) pendant 5 min à la RT dans l’obscurité.
- Laver les cellules 3 x, de 5 min chacun, avec 1 mL de PBS. Monter les cellules et les stocker à 4 ° C
Remarque : Les conditions de culture (substrat, milieu, réactifs complémentaires et concentration de FBS) des étapes 6.1 et 6.3 sont décrits à la Figure 3.
- Précouche une plaque de culture (6 puits) 10 µg/ml de laminine (LN) ou la fibronectine (FN).
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Test de formation de tube
- Préparer une matrice de la membrane basale (p. ex., Matrigel, désormais dénommé matrice) plaque.
- Dégelez la matrice à 4 ° C durant la nuit.
- Recouvrir une plaque à 96 puits avec 100µl de la matrice sur la glace.
Remarque : Il est important d’éviter les bulles dans la matrice. Les plaques doivent être couché sur la glace pour éviter la gélification de la matrice. - Maintenir la plaque à 37 ° C pendant 30 min.
- Aspirer le milieu des cellules (à l’issue de l’étape 6.3.5), délicatement rincer les cellules avec 5 mL de tiède (37 ° C) HBSS et traitez-les avec la trypsine-EDTA pendant 5 min dans l’incubateur de la cellule. Ajouter 3 moyen pour arrêter l’activité de la trypsine et transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 mL.
- Centrifuger les cellules à 470 x g pendant 5 min à RT. aspirer le surnageant, ajouter 1 mL de milieu 3 et pipette doucement.
- Les cellules du filtre avec une passoire de cellule 35 µm, si les cellules sont regroupées.
- Compter les cellules et 2 x 103 à 4 x 103 cellules dans 100 µL de milieu 3 dans chaque matrice revêtu bien des graines. Maintenir la plaque à 37 ° C dans un incubateur à cellules pendant 16 h.
- Prenez une photo avec un microscope en champ lumineux à un grossissement de X 2.
Remarque : Dans le cas d’une trypsinisation incomplète, prolonger le temps d’exposition à la trypsine-EDTA à un maximum de 7-8 min.
- Préparer une matrice de la membrane basale (p. ex., Matrigel, désormais dénommé matrice) plaque.
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Representative Results
Isolement de souris de SP-CPC :
Dans cette étude, nous avons utilisé des souris CPCs isolés selon le phénotype de la SP, considérant que les résultats de rat CPC sont modifiés et ajoutés dans un rapport antérieur avec permission (Figure 8),33.
Prolifération cellulaire sous haute et basse densité et avec différents taux sériques :
Notre étude antérieure a montré que l’expression de l’ARNm de marqueurs cardiaques lignée changé durant le premières 24 h étape de culture. On sait que la matrice extracellulaire influe sur les décisions de destin cellulaire, dont la différenciation endothéliale35. Pour explorer les conditions propices à la facilitation de l’engagement de la lignée endothéliale des SCD, nous avons utilisé FN et LN (les deux 10 µg/mL) sur une plaque de 6 puits (zone de croissance : 9,6 cm2/bien) dans cette étude. Parce que les décisions de destin cycle cellulaire et les cellules sont étroitement liées, nous cherchons la condition qui présente un taux de prolifération cellulaire faible en l’absence de mort cellulaire, comme telle, une condition peut refléter la transition entre la prolifération cellulaire et la différenciation. Nous avons, par conséquent, appliquer les conditions suivantes et comparé les taux de prolifération cellulaire : pour la densité cellulaire, confluence élevé (80 % - 90 %) et faible (< 60 %) confluency et pour la concentration sérique, des conditions de culture normale (dans cette étude 3,5 % FBS) et faible taux sérique de conditions (≤ 0,1 % FBS). Tout d’abord, nous avons vérifié l’état de densité faible. Il n’y a aucune différence significative de la viabilité cellulaire et la prolifération de la densité cellulaire faible avec 3,5 % FBS entre LN et FN, alors qu’une faible densité avec 0,1 % FBS a montré une prolifération cellulaire réduite sur LN par rapport au FN, mais aucune augmentation de la mort cellulaire ( Figure 4). En revanche, dans des conditions de densité cellulaire élevée, les concentrations sériques de 3,5 % et de 0,1 % ne montrent aucune différence dans la prolifération cellulaire et dans la mort cellulaire entre les deux substrats (Figure 5).
Ces résultats indiquent qu’une faible densité sur LN avec 0,1 % de sérum de diminue la prolifération sans affecter la viabilité de la CPC.
Changements dans la forme des cellules dans le milieu de différenciation endothéliale :
Bien que nécessitant de plus amples études visant à comprendre la signification et les mécanismes sous-jacents, changements dans la forme des cellules semblent révélatrice des conditions de culture approprié comme changements spécifiques peut être observée dès le début dans les cultures, dans lequel endothéliale la différenciation va être réussie (Figure 6). Comme indiqué dans les cercles en pointillés blancs dans la Figure 6, au bout de 7 à 14 jours dans le milieu de la différenciation endothéliale, cultures réussies contenaient des cellules qui étaient plus gros et différent dans la morphologie aux autres cellules. Fait intéressant, ces cellules ont disparu vers la fin de la phase de différenciation est également apparu dans un nombre plus faible et à des moments plus tard dans les cultures à haute densité sur LN et rem. alors qu’on n’a pas encore qualifié ces cellules, ce protocole propose des la forme de la cellule de suivi chaque 2-3 jours jusque vers le 14e jour. Si aucune cellule n’apparaît, le nombre de cellules ensemencées devrait être réduit.
Évaluation de la capacité endothéliale avec un dosage de la Formation du Tube :
L’essai de la formation du tube est une technique utile pour évaluer l’efficacité de la différenciation endothéliale des SCD en mesurant la capacité de formation de tube de cellules différenciées. Nous avons, par conséquent, exécuté le test de formation de tube avec cellules différenciées selon les conditions décrites. Fait intéressant, la formation des tubes réussie a été régulièrement démontrée par les cellules plaqué à faible densité et différenciées sur LN, tandis que la formation du tube a échoué pour la plupart dans les cellules cultivées sur LN à une densité élevée (Figure 7 a). De même, la formation des tubes échoua surtout dans les cellules cultivées sur FN indépendamment de la densité cellulaire, bien que forment de cellules différenciées sur FN à une faible densité parfois des tubes rudimentaires, selon l’état de la cellule (par exemple, isoler ou le passage des nombre, Figure 7 b). Pour confirmer la nature endothéliale de cellules, cellules plaqués sur les lamelles ont été différenciées selon le protocole décrit et colorés pour vWF. Encore une fois, l’expression de vWF est plus homogène et plus prononcée dans la CPCs différencient sur LN par rapport au FN (Figure 7D). La figure 8 montre les résultats de l’analyse de formation tube interprété pour des études antérieures à l’aide de CPC de rat dans les mêmes conditions comme en l’espèce décrit33. Ces résultats montrent que la formation du tube est plus efficace dans les cellules différenciées sur LN comparativement à FN lorsque plaqué dans des conditions de faible densité et avec faible taux sérique (0,1 % FBS) pendant 20 à 24 heures avant la différenciation dans le milieu de la différenciation endothéliale. Ces résultats suggèrent que ce protocole pourrait être utile pour divers types de cellules et indépendante des espèces.
Figure 1 : Illustration d’isolement spécifique les étapes pour obtenir une suspension de cellules cardiomyocytes appauvris de coeurs isolés de souris et de flux représentant cytometry lectures de SP cardiaque (A), ce panneau indique l’éjection de résidus de sang dans les cavités cardiaques par répété légère pression appliquée à l’aide de petites pinces. (B), ce tableau montre le découpage des cœurs en petits morceaux à l’aide de petits ciseaux. (C), ce panneau affiche le hachage de la viande des morceaux de cœur à l’aide d’une lame de rasoir. (D), ce panneau indique l’incubation des cœurs hachées avec la collagénase B en plaques inclinées à 37 ° C. (E), ce panneau indique l’homogénéisation des cœurs hachées à l’aide d’une pipette Pasteur au cours de l’étape d’incubation. (F) ce panneau montre le filtrage des tissus digérés grâce à un filtre de 100 µm (jaune) et un 40 µm filtre (bleu) pour l’élimination des résidus de tissus non digérées et les cardiomyocytes. (G) ce panneau montre le renversement doux d’un tube conique de 50 mL contenant la suspension de cellules cardiomyocytes appauvris et envelopper de papier d’aluminium pour la protection contre la lumière après l’ajout de Hoechst. (H), ce panneau montre flux représentatif cytometry lectures de cellules Hoechst en présence et en absence du vérapamil ABC transporteur inhibiteur pour l’identification de la SP (I) ce panneau montre une parcelle de point représentatif de SP les cellules selon une positivité CD31 et Sca-1 pour l’identification de la Sca-1+/CD31– sous-fraction. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : aperçu schématique de la préparation de l’échantillon menant à la SP cardiaque tri. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : protocole pour l’induction de la lignée endothéliale et différenciation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : prolifération de souris SP-CPC lorsque plaqué à une faible densité sous différents taux sériques sur LN et rem. (A et B) Ces panneaux indiquent le nombre de cellules au jour 2. (C et D) Ces panneaux montrent la viabilité au jour 2. Les données sont indiquées comme la moyenne ± l’écart-type de la moyenne (SEM) ; N = 5 ; différents passages ; p < 0,05 par de Student t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : prolifération de souris SP-CPC lorsque plaqué à une densité cellulaire élevée sous différents taux sériques sur LN et rem. (A et B) Ces panneaux indiquent le nombre de cellules au jour 2. (C et D) ces panneaux montrent la viabilité au jour 2. Les données sont indiquées comme la moyenne ± la SEM ; N = 5 ; différents passages. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : morphologie à 14 et 17 d pendant le processus de différenciation des cellules. Cette figure montre lumineux-zone (BF) images de souris SP-CPCs ensemencées sur plats revêtus de LN ou FN avec un low (bas) ou une densité élevée (High) et avec support 2 pour 20 h, suivie de moyen 3 pour 14 ou 17 d. White, cercles en pointillés délimiter les zones contenant wit de cellules de forme ronde h une plus grande taille de la cellule. L’imagerie a été réalisée avec la microscopie lumineuse. Le grossissement = 2 X ; la barre d’échelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Tube de formation et vWF coloration après différenciation endothéliale de SP-SCD sur LN et rem. (A et B) Ces panneaux montrent la formation du tube. (C et D) Ces panneaux montrent la coloration du vWF. Cellules ont été ensemencées sur 10 µg/mL de plats revêtus de LN ou FN avec une densité faible ou élevé et moyen 2 pour 20 h, suivies de moyen 3 pendant 21 jours et puis récoltés par la trypsine et ensemencés sur la matrice de la membrane basale. Toutes les photos ont été prises après 16 h. L’imagerie a été réalisée avec la microscopie lumineuse et le grossissement = 2 X pour les groupes A et B. L’imagerie est réalisée avec la microscopie fluorescente et le grossissement = 10 X pour les séries C et D. Panneaux A et C montrent des plats LN-enduit. Groupes B et D montrent plats revêtus FN. La barre d’échelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Tube de formation après la différenciation endothéliale de rat CPCs. SCD de rat ont été injectées à une densité cellulaire faible sur 10 µg/mL de plats revêtus de LN ou FN avec F12 FBS contenant 0,1 % milieu de 20 h, suivi d’un autre 21 jours en moyenne 3 et ensuite récolté avec la trypsine. Sur la matrice de la membrane basale sur une plaque à 96 puits, 4 x 104 cellules ont été ensemencées dans 100 μl de milieu 3. L’imagerie a été réalisée avec la microscopie lumineuse. Le grossissement = 2 X ; la barre d’échelle = 50 µm. Ce chiffre est modifié en fonction sur une précédente étude33. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Espèces | Isolement, marqueur de détection | Référence |
| Humain, rat, souris | c-kit+/Lin-, c-kit+/CD45-, c-kit+/CD45 /CD31–– | Beltrami, cellule 2003 ; Bolli, Lancet 2011 ; Ellison, cellule 2013 ; Smith, Nat Protoc 2014 ; Vicinanza, mort cellulaire diffèrent 2017 |
| Chiens bâtards | Lin-, ainsi : c-+, kit MDR1+ ou Sca-1+ | Linke, PNAS 2005 |
| Souris | SCA-1+ | Oh, PNAS 2003 |
| Souris | Population de côté, plus : Abcg2+, Sca-1+/CD31-, mutation de Sca-1++ | Hierlihy, FEBS Lett 2002 ; Martin, Dev Biol 2004 ; Pfister, Circ Res 2005 ; NOSEDA, Nat Commun 2015 |
| Souris | Colonie formant unité-fibroblaste, ainsi : CD45-, CD31-, Sca-1+, PDGFRa+ | Pelekanos, Stem Cell Res 2012 |
| Souris, rat, homme | ISL-1+ *, plus : CD31-, c-kit-, Sca-1-, Gata4+, Nkx2.5+ | Laugwitz, Nature 2005 ; Bu, Nature 2009 |
| * Isl-1 se trouve dans le myocarde embryonnaire ou foetal, pas en plein adulte. | ||
Tableau 1 : Techniques d’isolement et des marqueurs de cellules progénitrices cardiaque.
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Discussion
Avantages du présent protocole :
Ce protocole prévoit une technique de différenciation endothéliale des SCD. Nous avons constaté qu’une concentration sérique et la densité cellulaire faible pourraient améliorer l’efficacité de la différenciation endothéliale, auquel cas LN s’est avéré pour être un substrat plus adapté que le FN dans ces conditions. Nous avons utilisé deux types distincts de CPCs : rat CPC, qui ont été utilisés dans une manière ligne cellulaire et souris SP-CPC, qui ont été isolés et élargi. Notamment, le protocole était applicable aux deux types de courant CPCs. techniques permettent aux scientifiques d’isoler et augmenter le CPC primaires de souris génétiquement modifiées et des modèles précliniques de la maladie, ainsi que des humains28,,36. Utilisant ce protocole aux SCD isolé pourrait être utile pour l’étude des mécanismes des maladies non seulement mais aussi pour l’exploration de nouvelles cibles thérapeutiques.
Les CPC sont actuellement en essais cliniques pour cell therapy4,5, par lequel les cellules sont isolées de patients et dos transplantés après l’amplification in vitro . À cet égard, le protocole présenté ici pourrait aider à identifier des stratégies pour améliorer le potentiel de différenciation de ces CPC avant la transplantation. Cependant, thérapie cellulaire souffre toujours d’une efficacité limitée en raison de la faible rétention, survie et greffe des cellules transplantées. Études mécanistes in vitro basées sur ce protocole ou sur les adaptations de celle-ci ont le potentiel de contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à la différenciation des processus-en particulier, mécanismes liés à la densité des cellules , substrat et facteurs de croissance. Nouvelles connaissances provient de telles études peut finalement être reprogrammation cellulaire et placées pour influencer directement la CPCs résidant à différencier après une blessure.
Limites du présent protocole :
CPCs primaires isolés sont des populations hétérogènes qui montrent des phénotypes différents en ce qui concerne la taille des cellules et le taux de croissance de cellules selon l’isolement, même en utilisant les mêmes marqueurs et la technique d’isolation identique. Par conséquent, les trois points suivants doivent être définis : (1) l’ensemencement de la cellule des numéros selon la taille des cellules, (2) la concentration sérique idéal (< 0,5 %) et (3) le temps d’incubation pour la première étape (induction de lignée) avec une concentration sérique très faible. Ici, nous montrons les différences dans l’efficacité de la différenciation en fonction de la densité cellulaire. Cependant, même si nous avons comparé sérique (0,1 % FBS) par rapport aux concentrations sériques de la culture (3,5 % FBS), nous n’avons pas examiné autres concentrations dans le < gamme FBS 0,5 %. En outre, selon les espèces et les marqueurs d’isolation utilisés, l’efficacité de l’induction de la lignée peut varier. Par conséquent, le protocole doit être optimisé pour chaque type de cellule.
Techniques d’inhibition/induction pharmacologique et génétiques pourraient être utilisés pour l’examen des mécanismes de la maladie avec ce protocole, au lieu d’organismes génétiquement modifiés ou des modèles animaux de maladies. Dans ce cas, le protocole devrait être repensé : avant le traitement avec le milieu contenant du sérum-basse, les cellules seront traités avec des réactifs spécifiques ou des outils génétiques. En conséquence, les cellules peuvent être plus vulnérables que les cellules non-traitées. À l’aide de sérum faible dans la première étape est le point clé dans le présent protocole. Une validation minutieuse du temps d’incubation et de la concentration sérique pour la première étape permettant de ralentir la prolifération des cellules tout en préservant la viabilité au titre de la privation de sérum est donc essentielle de savoir si ce protocole peut être un succès ou non.
Résumé :
En résumé, CPCs isolés de modèles animaux fournissent un outil précieux pour les études de la maladie et la régénération cardiaques. Lors de l’expansion, CPCs humaines peuvent également être utilisés directement pour la thérapie cellulaire. Nous, ici, de fournir un protocole pour l’induction de la lignée endothéliales efficace et différenciation des SCD issu des adaptations minutieuse des concentrations de sérum et de la densité des cellules. L’avantage de ce protocole est son applicabilité aux différents types de SCD et son potentiel pour contribuer à une base pour l’étude des et/ou la mise en place d’autres outils de régénération cardiaque roman.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Vera Lorenz pour son soutien utile pendant les expériences et le personnel de l’installation de cytométrie en flux du département de biomédecine (DBM), l’université et hôpital de l’Université Bâle. Ce travail a été soutenu par le séjour-sur piste programme de l’Université de Bâle (Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster est soutenu par une subvention de la Swiss National Science Foundation (subvention numéro 310030_156953).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
| Thrombin | 0.0005 U/mL | All necessary components included in the kit | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | All necessary components included in the kit |
References
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- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
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