Summary
Denne protokol beskriver en endotel differentiering teknik for kardiale stamceller. Det fokuserer især på hvordan serum koncentration og celle-seeding tæthed påvirker i endothelial differentiering potentiale.
Abstract
Hjerte stamceller (CPCs) kan have terapeutiske potentiale for kardiale regeneration efter skade. I den voksne pattedyr hjerte, iboende CPCs er yderst sparsomme, men udvidet CPC kunne være nyttige for Celleterapi. En forudsætning for deres anvendelse er deres evne til at differentiere på en kontrolleret måde i de forskellige kardiale lineages bruger definerede og effektive protokoller. Derudover ved in vitro- ekspansion, CPCs isoleret fra patienter eller prækliniske sygdomsmodeller kan tilbyde frugtbar forskningsværktøjer til undersøgelse af sygdomsmekanismer.
Aktuelle undersøgelser bruger forskellige markører til at identificere CPCs. Dog er ikke alle af dem udtrykt i mennesker, der begrænser translationel virkningen af nogle prækliniske undersøgelser. Differentiering protokoller, der er gældende uanset isolation teknik og markør udtrykket muliggør standardiserede ekspansion og priming af CPCs til celle terapi formål. Her beskriver vi at priming af CPCs under en lav føtal bovint serum (FBS) koncentration og lav celle tæthed betingelser letter i endothelial differentiering af CPCs. ved hjælp af to forskellige delpopulationer af mus og rotter CPCs, vi viser at laminin er en mere egnet substrat end fibronektin til dette formål under følgende protokol: efter dyrkning for 2-3 dage i medium herunder kosttilskud at bevare multipotency og med 3,5% FBS, CPCs udsås på laminin på < 60% sammenløbet og kulturperler i supplement-gratis medium med lave koncentrationer af FBS (0,1%) til 20-24 timer før differentiering i endothelial differentiering medium. Fordi CPCs er en heterogen population, serumkoncentrationer og inkuberingstider muligvis justeres afhængigt af egenskaberne for den respektive CPC delpopulation. I betragtning af dette, teknikken kan anvendes på andre typer af CPCs og giver en nyttig metode til at undersøge potentiale og mekanismer af differentiering og hvordan de påvirkes af sygdom ved brug af CPCs isoleret fra respektive sygdomsmodeller.
Introduction
Nylige undersøgelser støtte eksistensen af hjemmehørende hjerte stamceller (CPCs) i voksne pattedyr hjerte1,2,3, og CPCs kunne være en nyttig kilde til celleterapi efter hjerte skade4, 5. Derudover udvidet CPC kan give en frugtbar model for narkotika-screening og undersøgelsen af sygdomsmekanismer når isoleret fra patienter med sjældne cardiomyopatier, eller respektive sygdom modeller6,7.
CPCs isoleret fra den voksne hjerte besidde stem/stamceller celle egenskaber1,2,3,8 , som de er multipotente, clonogenic, og har evne til selvfornyelse. Men der er mange forskellige (under) populationer af CPCs udstiller forskellige overflade markør profiler, herunder, for eksempel, c-kit, Sca-1, og andre, eller hentes af forskellige isolation teknikker (tabel 1). Flere kultur og differentiering protokoller har været etableret1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Disse protokoller varierer hovedsageligt med hensyn til vækst faktor og serum indhold, som er tilpasset formålet med den dyrkning og som kan føre til forskelle i resultater og virkninger, herunder differentiering effektivitet.
Markør-baserede isolering teknikker:
CPCs kan være isolerede baseret på en specifik overflade markør udtryk1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Tidligere undersøgelser tyder på, at c-kit og Sca-1 kan være de bedste markører til at isolere bosiddende CPCs1,11,14,19,20. Fordi ingen af disse markører er virkelig bestemt for CPCs, er kombinationer af forskellige markører normalt anvendes. Mens CPCs express lave niveauer af c-kit21, er c-kit for eksempel også udtrykt af andre celletyper, herunder mastceller22, endotelceller23og hæmatopoietisk stilk/stamfader celler24. Et yderligere problem er, at ikke alle markører er udtrykt på tværs af alle arter. Dette er tilfældet for Sca-1, som udtrykker i mus, men ikke i menneskelig25. Derfor, ved hjælp af protokoller, der er uafhængige af isolation markører kan være fordelagtige på baggrund af kliniske forsøg og undersøgelser med menneskelige prøver.
Markør-uafhængig Isolation teknikker:
Der er flere store teknikker til CPC isolation, som er primært uafhængigt af overflade markør udtryk, men som kan raffineres af de på hinanden følgende udvalg af specifikke markør-positive subfractions efter behov (Se også tabel 1). (1) side befolkning (SP) teknik har oprindeligt været præget i en primitiv befolkning på hæmatopoietisk stamceller baseret på evnen til at efflux DNA farvestof Hoechst 3334226 af ATP-binding kassetten (ABC) transportvirksomheder27. Hjerte SP celler er blevet isoleret fra forskellige grupper og rapporteret til at udtrykke en række mærker med nogle mindre forskelle mellem rapporter2,8,13,14. (2) kolonidannende enhed fibroblastceller (CFU-Fs) har oprindelig været defineret baseret på en mesenchymale stromale celle (MSC)-ligesom fænotype. Isolerede MSCs er kulturperler på retter at fremkalde koloni dannelse. Sådan kolonidannende MSC-lignende CFU-Fs kan isoleres fra voksne hjertet og er i stand til at differentiere i hjertets lineages15. (3) Cardiosphere-afledte celler (CDC) er enkelt celler, der stammer fra klynger af celler dyrkes fra væv biopsier eller explants28,29,30,31. Det blev for nylig vist, at for det meste CD105+/CD90-/c-kit- celle brøkdel udstiller cardiomyogenic og regenerativ potentielle32.
Her, leverer ved hjælp af SP-CPC'er isoleret fra mus, vi en protokol for den effektive induktion i endothelial lineage baseret på en tidligere undersøgelse i rotte CPCs og mus SP-CPC'er33. Protokollen indeholder specifikke tilpasninger til kultur og ekspansion teknik med hensyn til celle tæthed, serum indholdet af medium og substrat. Det kan anvendes ikke kun til musen SP-CPC'er men til forskellige typer af CPCs til formål at fremkalde en skæbne switch fra en forstærker til en endotel-begået CPC, det være sig på grund af transplantation af disse celler eller deres brug for mekanistisk in vitro- undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brug af mus til celle isolation formål var i overensstemmelse med retningslinjer for pleje og brug af forsøgsdyr og med den schweiziske lov om dyr og blev godkendt af den schweiziske kantonale myndigheder.
Bemærk: Isolering af Sca-1+/CD31- SP-CPC'er fra mus hjerte var hovedsagelig gjort som tidligere beskrevet34 med nogle ændringer. For materialer og reagenser, der anvendes, se Tabel af materialer. For alle eksperimenter, var cardiac SP-CPC'er isoleret fra mus forstærket, passaged, og bruges i en celle linje-lignende måde. Passager 7-20 blev brugt til denne undersøgelse.
1. væv forberedelse
Bemærk: Alle eksperimenter ved hjælp af mus skal foretages efter de retningslinjer og forordninger. Denne protokol bruger fire mus. Kultur plader, der er 100 mm i diameter er beskrevet som P100 og kultur plader, der er 60 mm i diameter er beskrevet som P60 for følgende dele af protokollen.
- Indsprøjtes hver mus med 200 mg/kg af pentobarbital intraperitoneal (i.p.) og vente, indtil det er fuldt bedøvede ved at kontrollere sine svar på tå klemme.
- Tør brystet med 70% ethanol. Skær huden og thorax væggen med en saks til at eksponere brysthulen.
- Løft hjertet med pincet og skære det i bunden ved hjælp af saks. Sætte hjertet i en P100 med 25 mL (5 mL for P60) af kolde fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (tre til fem hjerter pr. P100) eller en til to hjerter pr. P60.
- Pumpe hjertet med pincet til at skubbe blod ud af hulrum (figur 1A).
- Sætte hjertet i en P100 med 25 mL (5 mL for P60) koldt PBS til vask. Fjerne hjertets forkamre, ved hjælp af lille saks. Klip hjertet i to langsgående stykker og vaske dem igen i iskold PBS (25 mL/P100, 5 mL/P60).
- Overføre brikker til en ny P100 med 25 mL (5 mL for P60) koldt PBS. Skåret i stykker i mindre stykker med lille saks (figur 1B). Tilføj en dråbe af 1 mg/mL collagenase B fortyndet i Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) og hakkekød i små stykker grundigt med en steril barberblad (figur 1 c).
2. fordøjelse
- Der tilsættes 10 mL (2,5 mL for P60) af 1 mg/mL collagenase B løsning til fadet fra trin 1,6.
- Sætte collagenase B løsning som indeholder hakket hjerte stykker i en skrå (omkring 30°) P100 (eller P60) i et 37 ° C inkubator (fig. 1 d).
- Inkuber hakket hjerte stykker i en periode på højst 30 min. der homogeniseres ved gentagne gange passerer dem gennem en Pasteur pipette hver 10 min under inkubationen (figur 1E).
Bemærk: Det er vigtigt at ikke overstige 30 min inkubation i alt for trin 1.3.
3. filtrering
- Der tilsættes 10 mL (5 mL for P60) af kolde HBSS suppleret med 2% FBS i hakket og homogeniseret hjerte stykker.
Bemærk: HBSS suppleret med 2% FBS slukker collagenase B aktivitet. - Filtrer hjerte stykker gennem 100 µm filter til at fjerne ufordøjet væv og centrifugeres ved 470 x g i 5 min. ved stuetemperatur (RT) (figur 1F, gul filtre).
- Supernatanten resuspenderes i 5 mL (3 mL for P60) af røde blodlegemer lysisbuffer, og Inkuber pellet i 5 min. under lejlighedsvis omrystning på is.
- Der tilsættes 10 mL (5 mL for P60) af PBS (til at stoppe lysis reaktion) og filtreres prøven gennem et 40 µm filter til at udelukke større celler, herunder resterende cardiomyocytes (figur 1F, blå filtre).
- Der centrifugeres tube på 470 x g i 5 min på RT (uden bremse). Supernatanten og resuspenderes i 1 mL af DMEM herunder 10% FBS.
- Tælle celler i en prøve med en hemocytometer. Resuspend cellerne med DMEM herunder 10% FBS, der tager sigte på en endelig celle koncentration af 1 x 106 celler/mL.
Bemærk: Ca 5 x 106 cardiomyocyte - og erytrocyt-forarmet celler kan estimeres pr. mus. - Distribuere cellerne i to rør (figur 2): i rør A, der tilsættes 1,5 mL til Hoechst 33342 farvning med verapamil; i rør B, tilføje 18,5 mL til Hoechst 33342 farvning og fortsætte med at bejdse og sortere (trin 4.1 og 4.2) hjerte SP celler ved flowcytometri.
4. sortering af Cardiac SP celler ved flowcytometri
Bemærk: Verapamil hæmmer Hoechst efflux ved at blokere multidrug resistance (MDR) ABC transporter aktivitet. Hoechst 33342 er en DNA-bindende farvestof, der kan bruges i levende celler til at opdage cellecyklus som det korrelerer med DNA-indhold. Hoechst-33342-ekstrudering celler vises i Hoechst lave del af begge emission kanaler (450 nm, Hoechst blå; 650 nm, Hoechst rød), det vil sige annullering af den Hoechst-fastholde "vigtigste befolkningen", at give dem deres navn "side befolkning". SP celler er beriget i celler med stamfader egenskaber og viser et højt udtryk af multiresistente ABC-transportører (såsom MDR1 og ABCG2). Hoechst 33342 skrives som Hoechst for følgende dele af protokollen. Det er vigtigt at beskytte lysfølsomme materialer til ideelle resultater.
-
Farvning med Hoechst i tilstedeværelse og fravær af verapamil
- Tilføje verapamil (med en endelig koncentration på 83.3 µM) og Hoechst (med en endelig koncentration på 5 µg/106 celler) til celle løsning. I rør A, bruge Verapamil og Hoechst; tube B, bruge Hoechst kun. Inkuber i et vandbad (ved 37 ° C) i 90 min. og vende rør hvert 20 min (figur 1 g).
- Centrifugeres rør på 470 x g i 5 min på RT. udsmid supernatanten og resuspend hver pellet i HBSS (1 x 106 celler/mL).
- Tage en 1,5 mL aliquot til enkelt stainings og negativ kontrol fra tube B (figur 2): (i) fluorescein isothiocyanat (FITC)-konjugerede anti-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-konjugerede anti-CD31; (iii) nonstained celler (negativ kontrol).
Bemærk: Isotype kontrolelementer bruges her til at konfigurere isolation protokol. - Centrifugeglas A og B og single-farvning og negativ kontrol delprøver på 470 x g i 5 min på RT for udvaskning Hoechst og verapamil.
- Supernatanten og resuspend pellets af tube A og (iii) den negative kontrol i 250 µL af HBSS og holde dem på is i mørke indtil sortering.
- Resuspenderes i rør B i 200 µL af HBSS og pellet af (i, ii) de single-farvning delprøver på 100 µL af HBSS. Tilføje FITC-konjugeret anti-Sca-1 (0,6 µg/107 celler) og APC-konjugerede anti-CD31 (0,25 µg/107 celler). Inkuber pellets i 30 min på is og ryst dem fra tid til anden i mørke.
- Tilsættes 2 mL HBSS til rør. Centrifugeres rør på 470 x g i 5 min på RT.
- Supernatanten og resuspend alle pellets med 1 mL af HBSS, og der centrifugeres som ovenfor. Kassér analysere. Resuspenderes single-farvning delprøver i 200 µL af HBSS. Resuspenderes tube B i HBSS (20 x 106 celler/mL).
- Holde prøver på is og beskyttet mod lys indtil sortering.
-
Sortering med flowcytometri
- Forberede sterile 1,5 mL sortering rør med 500 µL af HBSS herunder 2% FBS.
- Pletten celler med 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (0,15 µg/106 celler) i isbad i 10 min at udelukke døde celler.
- Sortere de kardiale SP ved hjælp af følgende indstillinger: excite Hoechst ved hjælp af 350 nm (UV) excitation, indsamle fluorescens emission med en 450/50 nm sporgruppe-pass filter (Hoechst blå) og en 670/30 nm sporgruppe-pass filter (Hoechst rød) og bruge en dyse størrelse på 100 µm og tryk på 15 psi.
- For analyse, registrere 5 x 105 begivenheder for de sortering prøver og 1 x 105 begivenheder for den negative kontrol, verapamil kontrol og single-farvning prøver.
Bemærk: Hjerte SP er omkring 0,5% - 2% (figur 1 H) men kan variere mellem laboratorier og isolater. Sca-1+/CD31- brøkdel er omkring 1% - 11% af den samlede hjerte SP (figur 1I) men kan variere mellem laboratorier og isolater. SCA-1+/CD31- SP-CPCs er skrevet som SP-CPC'er for følgende dele af protokollen.
5. primære kultur af isolerede SP-CPC'er
Bemærk: Tre forskellige typer af medier blev brugt i denne protokol. De er nævnt som Medium 1 (ifølge Noseda et al.) 8, medium 2, og Medium 3 og er beskrevet i Tabel af materialer med hensyn til deres sammensætning.
- Varme op Medium 1-37 ° C før brug og køle ned centrifuge til 4 ° C. Centrifugeres de sortering rør ved 4 ° C og 470 x g for 6 min og resuspend celler i Medium 1.
- Sætte cellerne på en gas-gennemtrængelige P60 tallerken med 4 mL Medium 1. Ændre medium hver 3 d, indtil cellerne har nået 70% - 80% sammenløb.
Bemærk: Trin 5.2 kan tage omkring 2-3 uger.
6. udvidelse og differentiering af SP-CPC'er
-
Cellekultur
- Kultur 3 x 105 SP-CPCs i 8 mL Medium 1 i en kolbe på T75.
- Inkuber SP-CPC'er på 37 ° C med 5% CO2 indtil 70-80% sammenløb, skiftende medium hver 2-3 d.
Bemærk: Celle nummer skal ændres efter type af CPCs anvendes, fordobling tid og i Cellestørrelse.
-
SP-CPC vækst og levedygtighed under forskellige serumkoncentrationer
- Kultur SP-CPC'er for 2-3 d i T75 kolber med 8 mL Medium 1. Omhyggeligt Aspirér medium og skylles forsigtigt med 5 mL varm (37 ° C) HBSS.
- Behandling af celler med 5 mL Trypsin-EDTA i 5 min i celle inkubator, tilsættes 5 mL af Medium 1 at stoppe Trypsin aktivitet og overføre cellesuspension til en 15 mL tube.
- Centrifugeres celler på 470 x g i 5 min på RT.
- Resuspend celler i Medium 1 eller Medium 2 (lineage induktion medium) og plade 2,5 x 105 SP-CPC'er på P60 retter med 3 mL medium indeholdende forskellige serumkoncentrationer.
- Indsamle medium fra fad af trin 6.2.4 for indsamling af døde celler i en 15 mL tube efter 2 d af dyrkning i Medium 1 eller Medium 2.
- Trypsinize vedhængende celler som trin 6.2.2 og indsamle cellesuspension ind i 15 mL rør af trin 6.2.5. Centrifugeres celler på 840 x g i 5 min på RT.
- Opsug supernatanten og tilsættes 1 mL Medium 1 eller Medium 2 til celle optælling. Pletten SP-CPC'er med trypan blå (0,4%) og Grev trypan blå-positive (døde) og trypan blå-negative (levedygtige) celler.
Bemærk: Cellernes levedygtighed (trin 6.2.7) er givet som trypan-blå negative celle nummer i forhold til den samlede celle nummer.
-
Induktion i endothelial differentiering
- Precoat (6-godt) kultur plade med 10 µg/mL af laminin (LN) eller fibronektin (FN).
- Gøre en substratopløsning indeholdende 10 µg/mL af LN eller FN med F12 medium (eller PBS). Tilsættes 2 mL substrat til hver brønd. Opretholde pladen i 30 minutter ved 37 ° C.
- Opsug løsningen fra pladen og tilsættes 2 mL PBS i hvert hul indtil ved hjælp af det.
- Opsug medium fra celler fra trin 6.1.2, skyl dem forsigtigt med 5 mL varm (37 ° C) HBSS, behandle dem med 5 mL Trypsin-EDTA i 5 min i celle inkubator, tilsættes 5 mL af Medium 1 at stoppe Trypsin aktivitet og overføre cellesuspension til en 15 mL tube.
- Centrifugeres celler på 470 x g i 5 min på RT. aspirat supernatanten og tilføje Medium 2 til celle optælling.
- Frø 8 x 104 celler pr. godt på bestrøget pladen med 3 mL Medium 2 og holde det ved 37 ° C i 20-24 h. ændring medium til 3 mL Medium 3.
Bemærk: Vi anbefaler at bruge medium, der indeholder en lav serumkoncentrationen — og uden kosttilskud – for de første 20-24 h. Anbefales ved hjælp af < 60% celle sammenløbet (dvs., celle antal skridt 6.3.4 har justeres afhængigt af cellen størrelse og vækst sats). - Kultur celler for 21 d og ændre medium hver 3 d.
- Kontroller i endothelial arten af differentierede celler ved farvning dem med en endotel markør som von Willebrand faktor (vWF) og udfører Fluorescens mikroskopi.
- Cellerne vaskes med 1 mL PBS og løse cellerne i 3,7% formaldehyd i 2 min på RT.
- Permeabilize celler med 0,1% Triton X i ddH2O (eller PBS) i 30 min og blokere det med 10% ged serum for 1 h på RT.
- Inkuber celler med anti-von Willebrands faktor antistof (1: 100) i 48 timer ved 4 ° C
- Vaske cellerne 3 x med 1 mL PBS, i 10 minutter hver gang. Inkuber dem med Alexa Fluor 546 ged anti-kanin sekundær antistof (1: 500) i 1 h i RT i mørke.
- Vask igen 3 x til 10 min hver, med 1 mL PBS. Pletten cellekerner med 4'6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochlorid (DAPI; 1: 500) for 5 min på RT i mørke.
- Vaske cellerne 3 x, for 5 min hver, med 1 mL PBS. Montere cellerne og gemme dem på 4 ° C
Bemærk: De dyrkningsbaserede betingelser (substrat, medium, supplerende reagenser og FBS koncentration) af trin 6.1 og 6.3 er beskrevet i figur 3.
- Precoat (6-godt) kultur plade med 10 µg/mL af laminin (LN) eller fibronektin (FN).
-
Tube dannelse assay
- Forberede basalmembranen matrix (f.eks.Matrigel, fremover benævnt matrix) plade.
- Tø matrix ved 4 ° C natten over.
- Coat en 96-brønd plade med 100 µL af matrixen på is.
Bemærk: Det er vigtigt at undgå enhver bobler i matrixen. Pladerne skal være belagt på isen for at undgå jellification af matrixen. - Vedligeholde plade ved 37 ° C i 30 min.
- Opsug medium fra celler (efter afslutningen af trin 6.3.5), forsigtigt skyl celler med 5 mL varm (37 ° C) HBSS, og behandle dem med Trypsin-EDTA i 5 min i celle inkubator. Tilføje Medium 3 stop Trypsin aktivitet og overføre cellesuspension til en 15 mL tube.
- Centrifugeres celler på 470 x g i 5 min på RT. aspirat supernatanten, tilsættes 1 mL Medium 3, og med pipette overfoeres forsigtigt.
- Filtrer cellerne med en 35 µm celle si, hvis cellerne er samlet.
- Tælle cellerne og frø 2 x 103 til 4 x 103 celler i 100 µL af Medium 3 i hver matrix-belagt godt. Holde pladen ved 37 ° C i celle inkubator for 16 h.
- Tage et billede med et lysfelt mikroskop på 2 X forstørrelse.
Bemærk: I tilfælde af en ufuldstændig trypsinization, forlænge eksponeringstid til Trypsin-EDTA til højst 7-8 min.
- Forberede basalmembranen matrix (f.eks.Matrigel, fremover benævnt matrix) plade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Musen SP-CPC isolering:
I denne undersøgelse brugte vi mus CPCs isoleret efter SP fænotype, mens resultater fra rotte CPCs er ændret og tilføjet fra en tidligere rapport med tilladelse (figur 8)33.
Celledelingen Under høj og lav celle tætheder og med forskellige serumkoncentrationer:
Vores tidligere undersøgelse viste, at mRNA udtryk for hjertets lineage markører ændret inden for de første 24 h dyrkning trin. Det er kendt, at den ekstracellulære matrix påvirker celle skæbne beslutninger, herunder endotel differentiering35. For at udforske passende betingelser for lettelse i endothelial afstamning engagement af CPCs, vi brugte FN og LN (begge 10 µg/mL) på en 6-godt plade (vækstområde: 9,6 cm2/godt) i denne undersøgelse. Fordi cellecyklus og celle skæbne beslutninger er tæt forbundne, vi søger den betingelse, der udviser en lav celle spredning sats i mangel af celledød, som sådan en tilstand kan afspejle overgangen fra celleproliferation til differentiering. Vi derfor anvendt følgende betingelser og sammenlignet celle spredning priser: for celle tæthed, høj (80% - 90%) confluency og lav (< 60%) confluency, og for serum koncentration, normale dyrkningsbetingelser (i denne undersøgelse 3,5% FBS) og lavt serum betingelser (≤0.1% FBS). Først, vi testede lav celle tæthed tilstand. Der ikke var nogen betydelige forskelle i cellernes levedygtighed og spredning i lav celle tæthed med 3,5% FBS mellem LN og FN, mens en lav celle tæthed med 0,1% FBS viste en nedsat celleproliferation på LN i forhold til FN men ingen stigning i celledød ( Figur 4). Derimod på høje celle tæthed betingelser, serumkoncentrationer af både 3,5% og 0,1% viste ingen forskelle i celleproliferation og celledød mellem de to substrater (figur 5).
Disse resultater viser, at en lav celle tæthed på LN med 0,1% serum reducerer spredning uden at påvirke CPC levedygtighed.
Ændringer i celle form i Endothelial differentiering Medium:
Selv om kræver yderligere undersøgelser til at forstå de underliggende mekanismer og betydning, synes ændringer i celle form at være en indikator for egnede kultur betingelser som specifikke ændringer kan observeres tidligt i kulturer, hvor endotel differentiering vil være vellykket (figur 6). Som vist i de hvide stiplede cirkler i figur 6, inden for 7-14 d i endothelial differentiering medium, indeholdt succesfulde kulturer celler, der var større og anderledes i morfologi til andre celler. Interessant, antyder disse celler forsvandt i slutningen af fasen for differentiering og optrådte også i lavere tal og på senere tidspunkter i high-density kulturer på LN og FN. der henviser til, at vi ikke yderligere karakteriserer disse celler, denne protokol sporing figuren celle hver 2-3 d indtil omkring dag 14. Hvis ingen sådanne celler vises, bør antallet af celler seedede være nedsat.
Evaluering i Endothelial mulighed for med en Tube dannelse Assay:
Tube dannelse assay er en nyttig teknik til at vurdere effektiviteten i endothelial differentiering af CPCs ved at måle tube dannelse kapacitet af differentierede celler. Vi, udføres derfor tube dannelse assay med cellerne differentieres efter de beskrevne betingelser. Interessant, var vellykket tube dannelse konsekvent vist af celler belagt med lav tæthed og differentieret på LN, der henviser til tube dannelse for det meste ikke i celler belagt på LN på en høj densitet (figur 7A). Ligeledes tube dannelse var for det meste forgæves i celler dyrkes på FN uanset celle tæthed, selvom cellerne differentieres på FN på en lav densitet undertiden dannet rudimentære rør, afhængig af cellen betingelse (f.eks.isoleres og/eller passage nummer, figur 7B). For at bekræfte den endotel naturen af celler, blev celler belagt på coverslips differentieret efter de beskrevne protokol og farves til vWF. Igen, vWF udtryk var mere ensartede og mere udtalt i CPCs differentieret på LN i forhold til FN (figur 7CD). Figur 8 viser resultaterne fra tube dannelse assay som udføres til tidligere undersøgelser ved hjælp af rotte CPCs under samme protokol som her beskrevet33. Disse resultater viser, at røret dannelse er mere effektiv i cellerne differentieres på LN i forhold til FN når forgyldt lav celle tæthed betingelser og med lavt serum (0,1% FBS) i 20-24 timer før differentiering i endothelial differentiering medium. Disse resultater tyder på, at denne protokol kunne være nyttige for forskellige celletyper og uafhængig af arter.
Fig. 1: Illustration af specifikke isolation skridt for at opnå en cardiomyocyte-forarmet cellesuspension af isolerede mus hjerter og repræsentative flow flowcytometri udlæsninger af den kardiale SP. (A) dette panel viser udslyngning af resterende blod fra hjertet hulrum gennem gentagne mindre pres anvendt ved hjælp af små pincet. (B) dette panel viser opskæring af hjerterne i små stykker ved hjælp af lille saks. (C) dette panel viser hakning af hjertet stykker med et barberblad. (D) dette panel viser inkubation af hakket hjerter med collagenase B i vippes plader ved 37 ° C. (E) dette panel viser homogenisering af hakket hjerter ved hjælp af Pasteurs pipette under trinnet inkubation. (F) dette panel viser filtrering af fordøjet væv gennem en 100 µm filter (gul) og en 40 µm filter (blå) til fjernelse af ufordøjet væv rester og cardiomyocytes. (G) dette panel viser den blide tilbageførsel af en 50 mL konisk rør indeholdende cardiomyocyte-forarmet cellesuspension og indpakning i sølvpapir for let beskyttelse efter tilsætning af Hoechst. (H) dette panel viser repræsentative flow flowcytometri udlæsninger af Hoechst-farvede celler i tilstedeværelse og fravær af ABC transporter hæmmer verapamil til identifikation af SP. (jeg) dette panel viser en repræsentativ dot plot af SP celler efter CD31 og Sca-1 positivitet til identifikation af Sca-1+/CD31- subfraction. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk oversigt over prøveforberedelse fører op til den kardiale SP sortering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: protokol i endothelial lineage induktion og differentiering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: mus SP-CPC spredning når belagt med en lav celle tæthed under forskellige serumkoncentrationer på LN og FN. (A og B) Disse paneler viser celle numre på dag 2. (C og D) Disse paneler viser levedygtighed på dag 2. Tallene vises som den gennemsnit ± standardafvigelsen på middelværdien (SEM); N = 5; forskellige passager; p < 0,05 af Student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: mus SP-CPC spredning når belagt med en høj celle tæthed under forskellige serumkoncentrationer på LN og FN. (A og B) Disse paneler viser celle numre på dag 2. (C og D) vise disse paneler levedygtighed på dag 2. Tallene vises som den gennemsnit ± SEM; N = 5; forskellige passager. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: celle morfologi på 14 og 17 d undervejs differentiering. Denne figur viser lysfelt (BF) billeder af musen SP-CPC'er seedede på LN - eller FN-belagt retter med en lav (Low) eller høj (High) celle densitet og med Medium 2, til 20 h, efterfulgt af Medium 3 til 14 eller 17 d. hvid stiplet cirkler markerer områder indeholdende runde-formet celler wit h en større Cellestørrelse. Imaging blev udført med-lysfelt mikroskopi. Forstørrelsen = 2 X; skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Tube dannelse og vWF farvning efter endotel differentiering af SP-CPC'er på LN og FN. (A og B) Disse paneler viser tube dannelse. (C og D) Disse paneler viser vWF farvning. Celler var seedet på 10 µg/mL af LN - eller FN-belagt retter med en lav eller høj celle tæthed og med Medium 2 til 20 h, efterfulgt af Medium 3 for 21 d, høstet med Trypsin og seedet på matrixen basalmembranen. Alle billeder blev taget efter 16 h. Imaging blev udført med-lysfelt mikroskopi og forstørrelsen = 2 X for paneler A og B. Imaging er udført med fluorescerende mikroskopi og forstørrelsen = 10 X for paneler C og D. Paneler A og C Vis LN-belagt retter. Paneler B og D viser FN-belagt retter. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Tube dannelsen efter i endothelial differentiering af rotte CPCs. Rotte CPCs var seedet på en lav celle tæthed på 10 µg/mL af LN - eller FN-belagt retter med 0,1% FBS-holdige F12 medium for 20 timer, efterfulgt af en anden 21 d i Medium 3, og derefter høstet med Trypsin. På matrixen basalmembranen på en 96-brønd plade var 4 x 104 celler seedede i 100 μL af Medium 3. Imaging blev udført med-lysfelt mikroskopi. Forstørrelsen = 2 X; skalalinjen = 50 µm. Dette tal er ændret, baseret på en tidligere undersøgelse33. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Arter | Isolation, afsløring markør | Reference |
| Menneskelige, rotte, mus | c-kit+/Lin-, c-kit+/CD45-, c-kit+/CD45-/CD31- | Beltrami, celle 2003; Bolli, Lancet 2011; Ellison, celle 2013; Smith, Nat Protocol 2014; Vicinanza, celledød afviger 2017 |
| Køter hunde | Lin-, plus: c-kit+, MDR1+ eller Sca-1+ | Linke, PNAS 2005 |
| Mus | SCA-1+ | Åh, PNAS 2003 |
| Mus | Side befolkningen, plus: Abcg2+, Sca-1+/CD31-, Sca-1+/PDGFRa+ | Hierlihy, FEBS Lett 2002; Martin, Dev Biol 2004; Pfister, Circ Res 2005; Noseda, Nat Commun 2015 |
| Mus | Koloni-dannende enhed-fibroblast, plus: CD45-, CD31-, Sca-1+, PDGFRa+ | Pelekanos, Stem Cell Res 2012 |
| Mus, rotte, menneskelige | ISL-1+ *, plus: CD31-, c-kit-, Sca-1-, Gata4+, Nkx2.5+ | Laugwitz, naturen 2005; Bu, natur 2009 |
| Isl-1 er fundet i den embryonale eller føtale myokardiet, ikke i den voksne hjerte. | ||
Tabel 1: Isolation teknikker og markører for hjerte stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordelene ved denne protokol:
Denne protokol giver en endotel differentiering teknik af CPCs. Vi fandt, at et lavt serum koncentration og lav celle tæthed kunne forbedre effektiviteten i endothelial differentiering, hvorved LN viste sig for at være en mere egnet substrat end FN under disse betingelser. Vi brugte to forskellige typer af CPCs: rotte CPCs, som blev brugt i en celle linje-lignende måde, og musen SP-CPCs, som var isoleret og udvidet. Især protokollen var gældende for begge typer af CPCs. aktuelle teknikker tillader videnskabsfolk til at isolere og udvide primære CPCs fra genmodificerede mus og fra prækliniske sygdomsmodeller samt fra mennesker28,36. Ved hjælp af denne protokol på isolerede CPCs kunne være nyttigt til undersøgelsen af ikke kun sygdomsmekanismer, men også til udforskningen af nye terapeutiske mål.
CPCs er i øjeblikket i klinisk afprøvning for celle terapi4,5, hvorved cellerne er isoleret fra patienter og transplanterede tilbage efter in vitro- forstærkning. I denne henseende kunne protokollen præsenteres her hjælpe med at identificere strategier for at forbedre den differentiering af sådanne CPCs før transplantation. Dog lider celleterapi stadig under begrænset effektivitet på grund af lav retention, overlevelse og engraftment transplanterede celler. Mekanistiske in vitro- undersøgelser baseret på denne protokol eller tilpasninger heraf har potentiale til at bidrage til en bedre forståelse for de molekylære mekanismer kørende proces-i differentiering især mekanismer relateret til celle tæthed , substrat og vækstfaktorer. Ny viden hentet fra disse undersøgelser kan i sidste ende anvendes til celle omprogrammering og anvendes til at direkte påvirke bosiddende CPCs at differentiere efter skade.
Begrænsninger i denne protokol:
Isolerede primære CPCs er heterogene befolkninger, der viser forskellige fænotyper Cellestørrelse og celle vækst afhængig af isolationen, selvom du bruger samme markører og identiske isolation teknik. De følgende tre punkter skal derfor defineres: (1) celle såning numre efter Cellestørrelse, (2) den ideelle serumkoncentrationen (< 0.5%), og (3) inkubationstiden for det første skridt (induktion af afstamning) med et meget lavt serum koncentration. Her, viser vi forskelle i differentiering effektivitet afhængig af celle tæthed. Men selvom vi sammenlignede lavt serum (0,1% FBS) versus kultur serumkoncentrationer (3,5% FBS), vi undersøgte ikke andre koncentrationer inden for den < 0.5% FBS vifte. Desuden, afhængigt af isolation markører brugt og arterne, kan effektiviteten af induktion af afstamning engagement variere. Derfor bør protokollen optimeres for hver celle.
Farmakologiske og genetiske hæmning/induktion teknikker kunne bruges til at undersøge sygdomsmekanismer med denne protokol, i stedet for genetisk modificerede eller sygdom dyremodeller. I så fald protokollen bør være redesignet: før behandling med lav-serum-holdige medium, vil cellerne behandles med specifikke reagenser eller genetiske værktøjer. Som en konsekvens, kan cellerne være mere sårbare end nontreated celler. Ved hjælp af lavt serum i det første skridt er det centrale punkt i denne protokol. En omhyggelig validering af serum koncentration og inkubering tid til det første skridt at tillade hæmmer celledelingen samtidig opretholde levedygtighed under serum afsavn er derfor afgørende for om denne protokol kan blive en succes eller ej.
Resumé:
I Resumé give isolerede CPCs fra dyremodeller et værdifuldt redskab for hjerte sygdom og regenerering undersøgelser. Ved ekspansion, kan menneskelige CPCs også direkte anvendes til celleterapi. Vi, give her en protokol for effektiv endotel lineage induktion og differentiering af CPCs baseret på omhyggelig tilpasninger af celle tæthed og serum koncentrationer. Fordelen ved denne protokol er dens anvendelighed til forskellige typer af CPCs og dets potentiale til at bidrage en grundlag for studiet af og/eller etablering af andre roman hjerte regenerering-værktøjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Vera Lorenz for hendes nyttige støtte under eksperimenterne og personale fra Flow flowcytometri anlægget fra Institut for biomedicin (DBM), Universitet og University Hospital Basel. Dette arbejde blev støttet af ophold på track programmet fra Basel Universitet (til Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster understøttes af et tilskud fra den schweiziske National Science Foundation (grant nummer 310030_156953).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
| Thrombin | 0.0005 U/mL | All necessary components included in the kit | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | All necessary components included in the kit |
References
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
- Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
- Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
- Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
- El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
- Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
- Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
- Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
- Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
- Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
- Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
- Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
- Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
- Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
- Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
- Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).
- Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).
- Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
- Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).
- Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
- Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).
