Summary
Ett detaljerat protokoll för en sex-markör multiplex immunofluorescens panel är optimerad och utfört, med en automatiserad stainer för mer enhetliga resultat och en kortare procedur. Detta tillvägagångssätt kan anpassas direkt vid ett laboratorium för immunonkologiska studier.
Abstract
Fortsatta utvecklingen i immunonkologiska kräver en ökad förståelse för mekanismerna bakom cancerimmunologi. Immunoprofiling analys av vävnadsprov från formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) biopsier har blivit ett viktigt verktyg för att förstå komplexiteten i tumör immunologi och upptäcka nya Prediktiva biomarkörer för cancer immunoterapi. Immunoprofiling analys av vävnader kräver utvärdering av kombinerade markörer, inklusive inflammatoriska celler subpopulationer och immun kontrollpunkter, i den tumör mikromiljö. Tillkomsten av nya multiplex immunohistokemiska metoder möjliggör en effektivare multiparametric analys av enstaka vävnadssnitt än standard monoplex immunhistokemi (IHC). En kommersiellt tillgänglig multiplex immunofluorescens möjliggör (om) metoden baseras på tyramide-signal förstärkning och, i kombination med Multispektrala Mikroskopisk analys, en bättre signal separation av olika markörer i vävnad. Denna metod är förenlig med användningen av okonjugerat primära antikroppar som har optimerats för standard IHC på FFPE vävnadsprover. Häri beskriver vi i detalj en automatiserad protokoll som tillåter multiplex om märkning av carcinoma vävnadsprover med en sex-markör multiplex antikropp panel bestående av PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 och AE1/AE3 typen med 4, 6-diamidin-2-fenylindol som en nukleär cell motfärg. Multiplex panel protokollet är optimerad i en automatiserad IHC stainer för en färgning tid som är kortare än den manuella protokollet och kan direkt tillämpas och anpassas av alla laboratorium utredare för immunonkologiska studier på mänskliga FFPE vävnadsprover. Här beskrivs också flera kontroller och verktyg, inklusive en droppe-kontroll metod för fina kvalitetskontroll av en ny multiplex om panel, som är användbara för optimering och validering av teknik.
Introduction
Immunoprofiling analys av FFPE tumör vävnadsprover har blivit en viktig del av immunonkologiska studier, särskilt för identifiering och validering av nya Prediktiva biomarkörer för immunterapi mot cancer inom ramen för kliniska prövningar1 ,2. Kromogen IHC, använda kemiska kromogener såsom Diaminobenzidin, förblir standardteknik i Diagnostisk patologi för immunolabeling biopsi vävnad3. Standard IHC kan också användas för cancer vävnad immunoprofiling, inklusive kvantitering av subpopulationer av tumör-associerad lymfocyter och bedömningen av uttrycksnivåerna för immun kontrollpunkter såsom programmerad cell death ligand 1 (PD-L1)4 ,5. Standard IHC är begränsad, men däri endast en antigen kan märkas per vävnad avsnitt. Eftersom immunoprofiling studier kräver normalt analys av kombinerade uttryck av flera markörer, användning av standard IHC skulle kräva färgningen av flera vävnadssnitt, varje färgas med en enda markör, och skulle därför vara väsentligt begränsad för analys av små vävnadsprover såsom nålbiopsi. IHC standardmetoder begränsas också för bedömningen av markörer som är coexpressed av olika cellpopulationer, vilket är vanligt med immun kontrollpunkt markörer såsom PD-L1, som uttrycks av både tumör-associerad makrofager och cancerceller. Denna begränsning har rapporterats i, exempelvis användningen av standard monoplex IHC av patologer för kvantitativ analys av en IHC markör uttryckts av olika cell typ6. Utvecklingen av multiplex kromogen IHC tekniker sysselsätter olika färgade kromogener på de samma vävnad avsnitt representerar en befordran över IHC monoplex standardmetoden,7 även om de fortfarande begränsas av immunolabeling av bara några markörer och även presentera en viktig teknisk utmaning för ordentlig utvärdering av markörer som uttrycks i de samma subcellulär fack i de samma cellpopulationer.
De ovan nämnda förbehåll angående vävnad tillgänglighet från kliniska prover, samt begränsningar i multiplex kromogen IHC tekniker, har gett upphov till behovet av att utveckla förbättrade multiplex metoder för immunonkologiska studier baserade på fluorescerande märkning kombinerat med imaging system som effektivt kan skilja signaler från flera fluorophores från samma bild. En sådan teknik är baserad på tyramide signal amplifiering (TSA) i kombination med Multispektrala mikroskopi imaging för effektiv färg separation8. Ett kommersiellt tillgängliga TSA-baserade kit sysselsätter fluorophores optimerad för Multispektral avbildning8 (se Tabell för material). En viktig fördel med detta system är dess förenlighet med de samma omärkt primära antikroppar som redan har validerats och optimerad för standard kromogen IHC9,10,11. Detta tillåter inte bara snabbare optimering men också flexibilitet i optimering och panelen ändringarna införliva nya mål. Dessutom metoden multiplex immunofluorescens (mIF) TSA kan optimeras för kommersiellt tillgängliga automatiserade IHC stainer system, möjliggör en enkel överföring från monoplex kromogen IHC till mIF.
Här presenterar vi ett protokoll för en mIF panel för immunonkologiska studier som är baserade på automatiserade mIF TSA färgning och använder en Multispektrala scanner för avbildning. Detta protokoll kan anpassas och modifieras av alla laboratorium användare med tillgång till de beskrivna instrumentering och reagenser. Protokollet innehåller en panel av sex primära antikroppar för immunoprofiling av Carcinom: PD-L1, PD-1, CD68 (som pan-makrofag markör), CD8 (T-cytotoxiska celler), Ki-67 och AE1/AE3 (pan-cytokeratin, används som en epitelial markör för identifiering av Carcinom celler). En nyligen genomförd studie beskriver optimering av en manuell TSA mIF protokoll med kromogent IHC som standard referens för att validera den multiplex färgning12. Den uppdatera metod som presenteras här har utvecklats med hjälp av en kommersiellt tillgänglig, sju-färg TSA kit optimerad i en automatiserad stainer, drastiskt förkorta färgning tiden från 3 – 5 dagar till 14 h, samtidigt förbättra konsekvensen av färgningen. Förutom detaljerade huvudsakliga protokollet presenteras här, omfattar ett Kompletterande material avsnitt metoden ”drop-control”, en ytterligare kvalitetskontroll process för att utvärdera en ny mIF-panel, liksom tekniska noteringar för optimering, Felsökning och utvecklingen av nya multiplex paneler att hjälpa laboratorium användaren att ställa in och optimera metoden mIF TSA för anpassade mIF paneler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Det protokoll som presenteras här beskriver hur du utför immunoprofiling av en mIF-panel med TSA för sex antikroppar (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 och AE1/AE3) på en automatiserad stainer (se Tabell för material). Protokollet beskrivs också hur du utför kontrollerna droppe för en kvalitetskontroll av en ny mIF-panel (se Kompletterande material). I detta protokoll utförs färgning med åtta ofärgade FFPE-bilder från mänskliga tonsill (positiv kontroll) och åtta ofärgade bilder från mänsklig lunga adenokarcinom. Den första bilden används för fullständig multiplex färgning med alla sex markörer, den andra bilden för isotypen kontroll där inga primära antikroppar utnyttjas och de återstående sex bilderna av droppe kontrollerna (se Kompletterande material). En ytterligare kontroll för vävnad autofluorescens rekommenderas och bör alltid ingå i en multiplex-studien (se Kompletterande material). Utredarna kan dock anställa andra tumortyper och kontroller enligt sina egna projektmål. Laboratoriet användare utan tidigare erfarenhet med de multilaterala mellanbanksavgifterna TSA metod och Multispektrala scanner tekniker bör läsa Multiplex IHC utveckling Guide (tillgängliga online på http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Även denna guide beskriver en manuell protokoll, ger det också en bra introduktion till de multilaterala mellanbanksavgifterna färgning metod. Alla vävnadssnitt anställd i detta protokoll var anonymiseras och godkänd enligt Helsingforsdeklarationen.
1. vävnadsprover
- Välj ett FFPE mänskliga tonsill prov innehållande lymfoid hyperplasi som ska användas som en positiv kontroll och ett FFPE mänsklig lunga adenokarcinom prov kända för att vara PD-L1 positiva. Granska hematoxylin och eosin (H & E) bilder av valda lung cancer block för att bekräfta förekomsten av en tumör. Det är viktigt att undvika tumörer med riklig områden av nekros eftersom det kan öka icke-specifik bakgrundsfärgning.
Obs: För denna optimering, undvika att använda paraffinblock som har lagrats i 10 år eller mer och vävnad med en torkad utseende i blocket paraffin (konsultera med en histologi tekniker). - Använda en mikrotom, skära 10 på varandra följande seriella sektioner från varje block, 4 µm tjock. Montera avsnitten på en positivt laddad glasskiva som används för IHC, ett avsnitt per bild.
Obs: Sektioner måste monteras helt platt utan rynkor, som rynkor kan generera färgning artefakter. Antal bilder av seriell avsnitt från 1 till 10. - Förbereda en ny H & E bild på det första avsnittet. Granska H & E bilden med hjälp av en patolog att bekräfta förekomsten av tonsill vävnad eller lung tumör kvar i blocket.
Obs: Denna H & E bild kan hjälpa, senare, med urvalet av regioner i intresse för Multispektrala analys och fenotypning. - Förvara ofärgade sektioner i en plast slide låda vid 4 ° C i upp till tre månader.
2. skapande av nya multilaterala mellanbanksavgifter färgningen Program på en automatiserad Stainer: registrering av reagenser
Obs: Reagenser måste läggas till listan reagens i automatiserade stainer programvaran innan de blir tillgängliga för användning i protokoll. Se Tabell för material för information på automatiserade stainer modell och programvara version.
- Klicka på fliken reagenser inom automatiserad stainer programvaran. Klicka på Lägg till att utse en ny reagens. Ange namnet (t.ex., ”520 TSA Reagent”) och det förkortade namnet (t.ex., ”520 TSA”), att notera att det finns högst åtta tecken. Välj underordnade från droppa-ned menyn och ange leverantören. Ändra inte Enkel/dubbel fläcken från Singel/sekventiell DS. Ange standardvärdet färgning protokoll till Protokollet F. Ange standard HIER protokollet till ER1 20.
- Spara nya reagensmedlet och upprepa steg 2.1 för alla reagenser anges i tabell 1.
3. automatisk Stainer: Registrering av behållare
- Skriv namnet på reagens ska användas på sidan av varje behållare. Skanna streckkoden på sida. I popup-fönstret, Välj rätt reagensmedel i listan. Välj ett förfallodatum och spara.
- Upprepa proceduren i steg 3.1 för alla reagenser anges i tabell 1.
- Registrera i öppen forskning Kit. Skanna båda streckkoder på sidan av satsen och följ de anvisningarna. Namn på kit ”Multiplex forskning Kit 1”. Registrera den 1 x tris (hydroxymetyl) aminometan (Tris)-buffrad koksaltlösning som ingår i detta kit (tabell 1).
4. automatisk Stainer: Skapandet av en mIF Protocol Program
- Bas multiplex protokollet är förladdad med namnet Opal 7 Multiplex på nya automatiserade stainers (se modell och programvara version i Tabellen för material). Leta upp protokollet genom filtrering för ”alla” istället för ”föredrog” på skärmen protokoll. Om bas protokollet inte är närvarande, sedan uppdatera programvaran automatiserade stainer med hjälp från tillverkaren.
- Alla ändringar bör ske på kopior av ursprungliga protokollet. Innan du gör ändringar, spara originalet och skapa en kopia genom att klicka på fliken protokoll , sedan högerklicka Opal 7 Multiplex protokollet och välja Kopiera.
- Ändra namnet till 7 Multiplex protokoll 1 i det nya fönstret och välj fliken associerade med rätt enhet (golvmodell eller bänkmonterade). Matcha protokollet i Kompletterande tabell S1. Klicka på Lägg till reagens för att lägga till 10 min peroxidas hämning steget (inte en del av standardprotokollet) och välj peroxidas hämmaren som reagens.
- Bekräfta att de blockerande steg använda ett PKI-blockerande buffert. Se till att varje primär antikropp hänvisar till lämpliga reagens, sekundär antikropp steg utnyttja en HRP-polymer, som det spektrala 4′, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) som tillhandahålls med Multispektrala automation kit utnyttjas. Bekräfta alla val genom att kontrollera de reagens som har utsetts för varje respektive steg i den nedrullningsbara menyn på skärmen protokoll.
5. automatiserade Stainer: Tillsats av droppe kontroller och isotypen Control Protocol
- Kopiera namnet 7 Multiplex protokoll 1 och ändra det till 7 Multiplex protokoll 1 CD68 släppa. Ändra reagensmedlet CD68 antikropp Mus IgG och spara protokollet.
- Skapa sex mer nya protokoll, en för varje droppe kontroll och en för komplett isotypen kontroll (ändra alla antikroppar till den lämpliga isotyper) på samma sätt.
6. automatiserade Stainer: Bild förberedelse protokoll
- Kopiera prestaining protokollet * baka och Dewax och döp detta protokoll Multispektrala baka och Dewax 2 h.
- Justera protokollet för att matcha de reagens som visas i tabell 2. Baka bilder för 2 h vid 60 ° C. Dewax för 30 s vid 72 ° C.
7. automatisk Stainer: Beredning av reagensen
- Förbereda en forskning upptäckt kit. En reagens måste vara permanent associerad med detta kit, så Fyll behållaren 30 mL öppna markerade för 1 x Tris-buffrad koksaltlösning (TBS) med 1 x TBS och leta upp detta i position 1 (längst bort från handtaget) i forskning upptäckt kit designerat Multiplex forskning Kit 1. Denna reagens kommer att permanent förknippas med denna forskning kit och får inte ändra position för framtida bruk.
- Märk två 30 mL öppen behållare Multispektrala Block och Multispektrala sekundära. Fyll behållaren Multispektrala Block med 30 mL av blockerande buffert/antikropp spädningsvätska från Multispektrala färgning kit. Fyll behållaren Multispektrala sekundära med 30 mL anti-mouse/anti-rabbit sekundär antikropp polymer från Multispektrala färgning kit.
- Förbereda tio 7 mL öppna behållare. Volymen som krävs i mikroliter är 600 + (150 x [antal bilder]). Varje antikropp kommer att gälla 12 objektglas i detta fall (sex tonsill och sex lunga). Den märkning och volymer för alla behållare betecknas i tabell 3.
- För varje antikropp tube, först lägga till antikroppen spädningsvätska, följt av den koncentrerade primär antikroppen i volymerna som anges i tabell 3. Blanda genom skonsam pipettering.
- Förbereda en 7 mL öppen behållare för DAPI, använder fyra droppar DAPI koncentrat per milliliter av dubbeldestillerat vatten. sammanlagt 16 kommer att färgas med DAPI (600 + [150 x 16] = 3 000 µL). Tillsätt 3 mL dubbeldestillerat vatten plus 12 droppar spektrala DAPI i behållaren. Förbereda färska DAPI för varje körning.
- Förbereda en 7 mL öppen behållare för peroxidas hämmare. Alla 16 bilder kommer att behandlas med peroxidas hämmare (600 + [150 x 16] = 3 000 µL). Tillsätt 3 mL peroxidas block in i behållaren.
- Innan du förbereder arbetande koncentrationer av fluors, resuspendera alla frystorkade fluors genom att lägga till 75 µL av dimetyl sulfoxid varje fluor rör som tillhandahålls av tillverkaren. Blanda genom pipettering. Detta är TSA fluor beståndet. Förvaras vid 4 ° C.
- Förbereda sex titrering behållare, en för varje fluor. Volymen som krävs i mikroliter är 350 + (150 x [antal bilder]). Varje fluor kommer att tillämpas på 16 bilder i detta fall (åtta tonsill och åtta lunga). Den märkning och volymer för alla behållare betecknas i tabell 4.
- När alla reagens har registrerats och beredd, placera varje behållare till valfri plats på ett rack och ladda alla reagens på automatiserade Infärgaren. Sonden kommer att bekräfta volymen av varje reagens.
8. automatisk Stainer: Prov Setup och Multispektrala färgning
-
Klicka i den automatisera stainer programvaran, Skjut Inställningar överst på skärmen. Klicka på Lägg till studien. Fylla i popup-fönstret med studien ID, studie namn och kommentarer.
- Välj namnet på forskaren genomför färgning flykt från det drop-down listan. Lämna dispensering volymen på 150 µL. Välj Multispektrala Dewax för förberedelse-protokollet. Klicka på OK och Lägg till bild. Under kommentarer, typ ”Multiplex 1 Lung 123ABC”. Fyll i följande fält som anges: Vävnadstyp = Test vävnad; Dispensering volym = 150 µL; Färgningen läge = singel, rutin; Markör = negativ; Färgning = Skriv ”7 Multiplex protokoll 1”; Förberedelse = Multispektrala baka, Dewax 2 h; HIER = HIER 20 min med ER1.
- Klicka på Lägg till bild och ändra kommentarer och protokoll till tillsätt droppe kontrollglas och isotypen kontroll bild. När alla bilder har lagts till studien, Stäng fönstret Lägg till bild och skriva ut etiketter. Applicera etiketter till etikettområdet lämplig på varje bild.
- Ladda objektglasen i rack, tillämpa täcka brickorna i rätt riktning, infoga racken i den automatiserade stainer och lägre magasinen. Enheten kommer att skanna bilden etiketterna.
- När alla diabilder och reagenser har skannats och mätt. På Kör knappen (►) blir aktiv. Om autostainer upptäcker eventuella fel, såsom otillräckligt reagens volym, visas en gul varningssymbol av drabbade magasinet. Om ett fel inträffar, högerklicka på symbolen för försiktighet och åtgärda felet.
- Initiera färgning omedelbart eller schemalägga en fördröjd start. Protokollet är ca 14 h varaktighet. Obs: Se till att protokollet kommer att slutföra vid en tidpunkt när bilderna kan tas bort omedelbart som kvarvarande tvätt kan påverka färgning resultat.
9. täckglasapplicering Multispektrala bilder
- Ta bort bilderna från den automatiserade stainer och lagra dem i ett rack som nedsänkt i 1 x TBS.
- Montera av prov med nr 1,5 coverslips och 15 µL av montering media (se Tabell för material). Ta bort alla bubblor genom att trycka försiktigt på täckglaset med en pipettspetsen.
- Låt bilderna ska bota över natten i rumstemperatur på en arbetsbänk. Ohärdat diabilder kan skannas omedelbart med varsam hantering.
10. Multispektrala Scanner
- Kraften på Multispektrala skannern och dess dator (se Tabell av material för modell och programvara). Starta programvaran Mikroskop kontroll. Öppna den främre luckan Multispektrala skannern med beröring-känslig knappen på framsidan av enheten. Varje fjäderbelastade bärare i skannern håller fyra diabilder. Ladda in alla bilder i bärare och registrera ordern innan du laddar bärarna i enheten.
- Välj Redigera protokoll och klicka på New...; Skapa sedan protokollnamnet Multiplex Panel 1 och släpp kontroller. Skapa namnet studie Multiplex Panel utvecklingoch klicka på Skapa protokolletskriver Översikt Scan Filter DAPI; Markera Hela bilden Skanna och PIXELupplösning 0,50 µm (20 X). Alla filter och band bör vara representerade. Om inte, klicka på Redigera filter och band, Välj alla fem filter (DAPI, FITC, CY3, Texas Red och CY5) och klicka sedan på Redigera exponeringar.
- Ladda transportören genom att välja transportören med den full multiplex av lunga adenokarcinom. Välj den rätta bilden genom att använda det grafiska användargränssnittet. Fokusera vävnaden antingen manuellt eller genom att använda autofokus. Navigera till något område med acceptabel DAPI färgning och klicka på Auto-exponera för att ställa in exponeringen i millisekunder (0 – 2 000 ms).
- Upprepa samma procedur för alla fem filter set i både hela skanna och MSI regionen kolumner. Tänk på att navigera till ett område med acceptabel färgning och fokusera mikroskopet innan du ställer in exponeringen för varje filter och förstoring nivå. Auto-utsätta för alla fem filter i en 20 x övergripande scan och 20 x Multispektral avbildning (MSI) Multispektrala regioner. Välj en upplösning för 0.50 µm (20 x). Spara protokoll och klicka på tillbaka att återgå till startskärmen på Vectra programvaran; Klicka på Skanna diabilder.
- Öppna gränssnitt för varje bild och uppgift att Skanna. Anges studie Multiplex Panel utveckling, ställa in protokoll till Multiplex Panel 1 och släpp kontrolleroch ange Bild ID till Multiplex Lung ABC123, Multiplex CD68 släppa Lung ABC123, etc . När alla bilder har märkts och uppgifter är inställd, klicka på Skanna. Automatiserad Multispektrala skannern kommer att utföra full-slide skanningar av alla diabilder med alla fem filter.
11. Multispektrala Scanner: Multispektral avbildning
- När du skannar är klar, öppna programvaran QPTIFF (”Phenochart”) och klicka på Load bild uppe till vänster. Detta kommer att öppna en QPTIFF, som är en fem-filter hela-slide scan. Varje lager innehåller information från mer än en fluor, så verktyget är begränsad, men den vävnad struktur och brett uttrycksmönster är uppenbara och kan användas för att markera regioner för MSI.
- Navigera till och öppna den rätta bilden i studien med hjälp av nedrullningsbara trädet till vänster. Logga in (uppe till höger) med användarens initialer.
- Välj fem regioner för MSI med hjälp av stämpel överst på skärmen. Konsultera en patolog om tillgänglig. Under Välj för, Välj förvärv; Välj under storlek i fält, 1 x 1. och under fältet begränsning, Välj 0,5 µm (20 x). Baserat på cytokeratin (CK) färgning (huvudsakligen i Cy5), Välj flera regioner med både tumör (CK +) och stroma (CK-) till avbildas från övergripande scan. Upprepa proceduren för varje bild.
- När alla MSI: er är valt, Stäng Phenochart programvaran och återgå till Vectra programvaran. Ändra uppgiften från Skanna till MSI för varje bild och klicka sedan på Skanna igen för att utföra den MSI-samlingen.
12. spektrala minoriteter
Obs: Det spektrala unmixing steget krävs för kanalseparation och bildanalys av bilderna. Innan spektrala minoriteter utförs i programvaran informera, måste det spektrala biblioteket byggas med hjälp av lunga adenokarcinom diabilder färgas med varje fluor ensam och med DAPI ensam. Denna procedur beskrivs också i ovannämnda Multiplex IHC Assay utveckling Guide.
- När MSI förvärvet är klar, kan du använda spektral unmixing (”informera”) programvaran för att öppna filer i mappen MSI . Dessa filer upphöra tillägget .im3 filtyp.
- Under bildformat, Välj Multispectral; under samplingsformatVälj fluorescens; och under spektrala bibliotek källa, Välj informera.
- Välj fluors, Välj och ladda alla sex fluors och DAPI från biblioteket byggt med lunga adenokarcinom biblioteket bilder. Klicka på Förbered alla (nedre vänstra). Spektral unmixing programvaran utför spektrala minoriteter på alla öppna bilder, med hjälp av de medföljande spektrala profilerna.
- Med en patolog, bedöma färgning mönstret mot kromogen enstaka fläckar av samma målet i sekventiella presentationer av samma vävnad.
13. utvärdering av fluorescensintensiteten och Signal dämpning
Obs: Verktyget räknas som visas som en pil med en liten brun låda, är det viktigaste verktyget för multiplex optimering och bör användas frekvent (se Kompletterande material). Med verktyget räknar i den spektrala unmixing programvaran, bedöma signal-brus-förhållandet, som ett minimum bör överstiga 10:1 (se Kompletterande material för felsökning och för utvärdering av den multiplex färgning med släpp kontroller).
- 13.1. med en bild öppen i den spektrala unmixing programvaran, engagera verktyget räknar och undersökning bilder att bedöma fluorescensintensiteten hos varje kanal. Målet intensiteten i lungvävnaden är mellan 10 och 20 normaliserat räknas. Normaliserat räknas verktyget visas i figur 1.
- Utesluta bilder med högsta signalen räknas av mindre än 10 eller normal signal område räknas på mindre än fem för varje markör så att autofluorescens och off-target färgning inte konkurrerar med autentiska signalen.
- Exkludera bilder med maximal räknas större än 30 för någon kanal att undvika spektrala blödning eller ineffektiva spektrala minoriteter.
- Åtgärda höga eller låga normaliserat räknas genom justering av koncentrationen, TSA.
14. Multispektrala bildanalys
- Öppna en eller flera MSI i spektral unmixing programvara och bara välja fluors för minoriteter som är representerade i minst en öppen bild. Klicka på Förbered alla att unmix alla för närvarande öppnade färgbilder för att ge spektralt oblandade bilder.
- Välj verktyget räknar att kartlägga räknas över varje bild genom att hovra över områden av intresse.
- Välj ikonen ögat öppna redigeraren Visa. Välj och justera displayen intensiteten i varje oberoende kanal.
- Välj Konfigurera för att öppna den vävnad segmentering, cell segmentering, fenotypning och scoring moduler. Dessa verktyg krävs för objektiva validering av multiplex färgning mot kromogen enstaka fläckar och kan användas för att generera kvantitativa phenoptic data (Figur S1).
- Använda Exportera fliken Spara gråskala, fluorescerande, pathview-stil okomprimerad TIFF och datafiler från modulerna phenoptic analys för ytterligare analys, arkivering och presentationer (Figur S1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet beskrivs här kommer ge resultat som de visas i figur 2. Börja med en utvärdering av färgningen i tonsill-kontrollen börjar med surface skivepitelcancer epitel. Histologin av tonsill provet kan ses med en patolog, med H & E bilden som referens. Om kromogen IHC sektioner utförs med samma markörerna på samma vävnad block, kan sedan dessa användas att bekräfta densitet och distribution av varje markör i mIF-bilden. Som visas i figur 2A, tonsill vävnaden bör ge klart definierade AE1/AE3 cytokeratin färgning i tonsill ytan skivepitel (figur 2A; märkt som röda falsk), utan bakgrund i den lymfoida vävnad. Färgningen ska vara cytoplasmiska, ibland med membran accentuering och atomkärnor måste vara negativ. Nätstruktur epitelet i kryptor bör vara positivt för både typen (röd) och PD-L1 (figur 2A; grön falsk). Den follikulära stilbildande Centrerat tonsill bör, sedan identifieras. Den stilbildande centren bör vara lätt igenkännlig och bör vara rik på Ki-67-positiva lymfocyter (figur 2A; gula falsk). KI-67 färgning bör alltid kärnkraft. Makrofager som är närvarande i den stilbildande centren bör också vara lätt att känna igen, ibland som större celler (även kallad ”tingible organ”). De kommer att visa positiv färgning för CD68 som en granulär cytoplasma fläck (figur 2A; orange falsk). En rörlig andel av CD68 celler utanför den stilbildande centren är också att vänta. Makrofager kan visa membran färgning för PD-L1. Detta är vanligtvis blekare i intensitet än färgning för PD-L1 i nätstruktur epitel. Det bör finnas någon nukleär CD68 färgning. CD8 bör fläcken lymfocyter med en T-cell-distribution (färre i den stilbildande centren och en större andel i de interfollicular områdena, se figur 2A, cyan falsk). CD8 + lymfocyter är vanligtvis små celler med knappa cytoplasman, så det är praktiskt omöjligt att skilja membran kontra cytoplasman i lymfocyterna. PD-1 starkt kommer att färga små lymfocyter i området germinal center, vanligtvis klustrade på peripheryen av den stilbildande centren (figur 2A; magenta falsk), samt spridda lymfocyter i regionen interfollicular, vanligtvis visar en lägre färgning intensitet än i området germinal center. Som med CD8, är det inte möjligt att tydligt skilja membran och cytoplasmisk färgning i små lymfocyter färgas med PD-1. Eftersom en rörlig andel av CD8 celler coexpress PD-1, rekommenderas för kvalitetskontroll ändamål att färgning mönstret och distribution av varje markör som är målat i samma vävnader jämföras med kromogent IHC referens rutschkanor, som föreslagits i tidigare publicerade protokoll12.
Efter det förväntade färgning mönstret har bekräftats i kontrollen tonsill vävnad, Fortsätt att utvärdera färgningen i lung cancer provet (figur 2B). Eftersom tumörvävnad förväntas visa en variabel och heterogena uttryck för markörerna, är det mycket viktigt under optimering av en ny mIF panel att jämföra färgning mönstret för varje enskild markör som observerats i mIF metoden och dess uttryck hos kromogen IHC bilden, utvärdering av kvantitet och fördelningen av de positiva cellerna som tidigare beskrivits12. Dock bör grundläggande färgning mönstret bevaras; exempelvis bör typen observeras i cytoplasman i epitelceller och aldrig i en kärna; CD68 ska visas som kornig cytoplasmisk färgning i makrofager, etc. Ännu viktigare, i vissa markörer ändras färgning intensitet från tonsill kontroll i cancer vävnad; PD-L1- och PD-1 kan till exempel Visa lägre intensitet färgning i tumörvävnad jämfört med mycket hög uttrycket observerats i tonsill kontroll. Det är därför viktigt att utföra utvärdering och optimering med verktyget räknas i informera programvaran, med exempel på tumör vävnader i stället för kontrollerna tonsill.
Slutligen, isotyp-negativa kontroller och släpp kontroller behöver utvärderas, inte bara för att upptäcka bakgrunden och autofluorescens, utan också för paraply effekter och spektrala blöda (figur 3 och figur 4). Isotypen kontroller bör inte visa någon immunfärgning över bilden; om någon färgning observeras, måste sedan av imaging eller färgning förfarande ses över. Släpp kontroller är viktigt att utvärdera potentiella artefakter i färgningen, såsom spektrala blöda eller paraply effekter, på grund av metoden mIF under optimering av en ny multiplex panel (se figur 5, Kompletterande figur S2, Kompletterande bild S3, och kompletterande material). Fluorescerande monoplex och släpp kontroller bör utvärderas och jämförs med panelen full multiplex. Varje droppe kontroll ska visa samma färgning mönster förutom den enda primära antikropp, som bör tas bort på varje specifik kontroll. Ytterligare information finns i avsnittet Kompletterande material .
Figur 1 : informera räknar verktyg. Verktyget informera programvara räknas aktiveras genom att välja ikonen beige ruta. Normaliserat räknas korrigeras för bitdjup, exponeringstid, vinst och binning. Bilderna togs på 20 X förstoring; skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa resultat. (A) tonsill och (B) nonsmall-cell lungcancer var fläckade av PD-L1 (520 TSA, grön), CD8 (540 TSA, cyan), Ki67 (570 TSA, gul), CD68 (620 TSA, orange), cytokeratin (650 TSA, röd), och PD-1 (690 TSA, magenta). Individuella kanaler representeras separat nedan i små paneler. Markören visas i det övre högra hörnet av varje bild. Bilderna togs på 20 X förstoring; Skalstapeln = 50 (eller 250 µm). Anges i panelen A är 1) 4) stratifierat skivepitel, 3) interfollicular område, lymfoida follikeln och 2) germinal center. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : TSA blockering/paraply effekt. Detta är ett exempel på 690 TSA deponerade av en PD-1 antikropp-blockerande CD3 signal på ett sätt som är beroende av mängden TSA närvarande. Ljusaste 690 TSA signalen blockerar signalen 620 TSA mest effektivt (nonsmall-cell lungcancer fläckade anti-PD-1 D4W2J för 30 min på 0,52 µg/mL eller isotypen följt av en 10 min 690 TSA upptäckt på 1: 100; då, anti-CD3 F7.2.38 för 30 min på 0,14 µg/mL (följt av en 10 min 620 TSA upptäckt på 1: 100). Bilderna togs på 20 X förstoring; skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Spektrala blöda. Nonsmall-cell carcinoma lungvävnad var fläckad med Ki-67 drop-kontrollprotokollet (fullständig multiplex protokoll med Ki-67 antikropp utelämnas). 540 TSA kanalen (CD8) och 570 TSA kanalen (Ki-67) visas. Inget nukleär färgning mönster är uppenbar, men en minskad kopia av CD8 färgningsmönster observeras i kanalen TSA 570. Detta behandlas bäst genom att säkerställa jämförbar färgning stödnivåer i alla kanaler. I det här fallet, korrigerar tillägg av en robust Ki-67-signal (normaliserat räknas mellan 10 och 20) det spektrala utfallet. Bilderna togs på 20 X förstoring; skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : Släppa kontroller. Denna figur visar en sammansatt bild av en full multiplex jämfört med samma område i sekventiella presentationer av lunga adenokarcinom färgas med släpp kontroller där den angivna primära antikroppen utelämnades. Bilderna togs på 20 x förstoring; Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Namn | Förkortat namn | Typ | Behållare | Grupp |
| PKI-blockerande buffert | OPALBLOK | Sidotjänster | Öppna 30 mL | Allmänna |
| Opal Polymer HRP | OPAL 2AB | Sidotjänster | Öppna 30 mL | Allmänna |
| OPAL 1 x TBS | OPAL1TBS | Sidotjänster | Öppna 30 mL | Det. Kit |
| CD68 0.30 µg/mL PG-M1 Mus | OPALCD68 | Sidotjänster | Öppen 7 mL | Allmänna |
| Ki67 0,61 µg/mL MIB-1 Mus | OPALki67 | Sidotjänster | Öppen 7 mL | Allmänna |
| PD-L1 0,20 µg/mL SP263 Rab | OPALPDL1 | Sidotjänster | Öppen 7 mL | Allmänna |
| PD-1 0,52 µg/mL D4W2J Rab | OPAL PD1 | Sidotjänster | Öppen 7 mL | Allmänna |
| CD8 0.70 µg/mL SP239 Rab | OPAL CD8 | Sidotjänster | Öppen 7 mL | Allmänna |
| CK 0,24 µg/mL AE1/AE3 Mus | OPAL CK | Sidotjänster | Öppen 7 mL | Allmänna |
| Mus IgG | OPAL MUS | Sidotjänster | Öppen 7 mL | Allmänna |
| Kanin IgG | OPAL RAB | Sidotjänster | Öppen 7 mL | Allmänna |
| OPAL peroxidas Block | OPALPERX | Sidotjänster | Öppen 7 mL | Allmänna |
| Spektral DAPI | OPALDAPI | Sidotjänster | Titrering 6 mL | Allmänna |
| Opal 520 reagens | OPAL 520 | Sidotjänster | Titrering 6 mL | Allmänna |
| Opal 540 reagens | OPAL 540 | Sidotjänster | Titrering 6 mL | Allmänna |
| Opal 570 reagens | OPAL 570 | Sidotjänster | Titrering 6 mL | Allmänna |
| Opal 620 reagens | OPAL 620 | Sidotjänster | Titrering 6 mL | Allmänna |
| Opal 650 reagens | OPAL 650 | Sidotjänster | Titrering 6 mL | Allmänna |
| Opal 690 reagens | OPAL 690 | Sidotjänster | Titrering 6 mL | Allmänna |
Tabell 1: Leica Bond RX protokoll, Opal reagenser
| Reagens | Tid (h) | Temperatur (grader Celsius) | |
| 1 | Ingen reagens | 120:00 | 60 |
| 2 | Bond Dewax lösning | 0:30 | 72 |
| 3 | Bond Dewax lösning | 0:00 | 72 |
| 4 | Bond Dewax lösning | 0:00 | Omgivningstemperatur (rumstemperatur) |
Tabell 2: OPAL förberedelse protokoll
| Mål | µg/mL | Klon | Källa | Hel | Beståndet µg/mL | µL spädningsvätska | ΜL AB |
| CD68 | 0,3 | PG-M1 | Dako | 20043031 | 30 | 2376 | 24 |
| Ki67 | 0,61 | MIB-1 | Dako | 20049476 | 46 | 2368.17 | 31.83 |
| PD-L1 | 0,2 | SP263 | Vent. | F09591 | 1,61 | 2101.86 | 298.14 |
| PD-1 | 0,52 | D4W2J | CST | 1 | 100 | 2387.52 | 12,48 |
| CD8 | 0,7 | SP239 | Ventana | 160318 | 70 | 2376 | 24 |
| CK | 0,24 | AE1/AE3 | Dako | 10129428 | 179,5 | 2396.79 | 3.21 |
| Mus IgG | 0,61 | ||||||
| Rab IgG | 0,7 |
Tabell 3: Primär antikroppar beredning.
| Opal Fluor | Bilder | Utspädning | µL spädningsvätska | µL opal Fluor |
| Opal 520 | 16 | 1: 200 | 2736.3 | 13,8 |
| Opal 540 | 16 | 1:700 | 2746.1 | 3.9 |
| Opal 570 | 16 | 1:150 | 2731.7 | 18,3 |
| Opal 620 | 16 | 1: 100 | 2722.5 | 27,5 |
| Opal 650 | 16 | 1:350 | 2742.1 | 7,9 |
| Opal 690 | 16 | 1:150 | 2731.7 | 18,3 |
Tabell 4: OPAL Fluor beredning.
Kompletterande Material Word-dokument: Vänligen klicka här för att hämta det här dokumentet.
Kompletterande figur 1: Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2: Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 3: Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande tabell 1: Leica Bond RX Opal Multiplex protokollet. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.
Kompletterande Tabell2: Sammanfattning och jämförelse av full multiplex, släpp kontroller och full isotypen kontroller. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pågående cancer immunoterapi revolutionen är öppningen roman och lovande behandlingsalternativ för cancer patienter13. Framsteg inom området för immunonkologiska kommer att kräva ökad kunskap om den inflammatoriska tumör mikromiljö, inte bara för att förstå biologin av de immunologiska mekanismerna som är involverade i carcinogenes, men också för att hitta Prediktiva biomarkörer för nya immunterapi-baserade behandlingar1,2. På grund av den komplexa biologin cancer immunologi, är förhör av tumör vävnadsprover vanligtvis krävs för att utveckla en växande lista av immun-markörer, som interagerar med varandra och är ofta coexpressed av olika cellpopulationer i vävnaden1 ,2,5. Kliniska prövningar sysselsätter vanligtvis små biopsier, såsom core nål eller endoskopisk biopsier, som samlas på olikt pekar av terapi för att utvärdera och övervaka patientens svar. Sådana biopsier ger begränsade mängder av vävnad, vilket i sin tur begränsar antalet vävnadssnitt som kan användas för cancer immunoprofiling. Denna begränsning är särskilt betungande när traditionella tekniker, såsom standard monoplex IHC, används. Därför, finns det en tydlig behöver för nya metoder för cancer immunoprofiling som gör användning av multiplex tekniker med kapacitet att samtidigt utvärdera coexpression av olika biomarkörer och effektivisera användningen av värdefull vävnadsprover.
I multiplex färgning och Multispektrala avbildningsmetoder som beskrivs i detalj här, används en mIF panel för immunonkologiska studier på FFPE vävnader såsom biopsier från en klinisk prövning. Denna metod har tidigare beskrivits, validerats, och tillämpats till cancer immunoprofiling8,9,10,11,12,14, 15. tidigare publicerade protokoll har beskrivit liknande mIF färgning metoder med TSA-baserat system, såsom den sju-färg kit, som är tidskrävande och kräver cirka 4 dagar av arbete av en dedikerad laboratorium vetenskapsman12 ,15. Svar på dessa brister, har detta protokoll optimerats med hjälp av en kommersiellt tillgängliga automatiserade stainer, dramatiskt förkorta den färgning tid till 14 h och eliminera det variabilitet som införs genom manuell operatörer. Imaging genomförs en Multispektrala skanner kan separera spektra av sju eller fler fluorescerande signalerna i multiplex bilderna, inklusive autofluorescens, som kan avlägsnas effektivt utan att försämra signalkvaliteten. Detta protokoll kan ändras replikeras, och framförd av alla laboratorium användare med tillgång till instrument och reagenser i detalj i Tabell för material.
Kritiska steg i detta protokoll är avsnitt 7, 10, 11, 12. Avsnitt 7 avser beredning av reagens. En noggrann beredning av reagensen för multiplex färgning är viktigt, som kräver fokuserad uppmärksamhet av ett laboratorium vetenskapsman eller tekniker för att undvika operatörsberoende variation. En av de stora frågorna med multiplex-metoden till exempel färgning variationer, som kan minskas genom noggrann beredning av spädningarna av reagenser, särskilt de TSA färgämnena. Avsnitt 10 och 11 är relaterade till bild förvärv. En viktig risk är överexponering eller oversaturation bilder, vilket kan leda till spektrala utfall, en artefakt som stör signalen från en annan kanal kanal som avbildas (se Kompletterande material). Noggrant reglera exponeringstiderna kan hjälpa för att förhindra oversaturation och spektrala utfall. Spektral minoriteter bedrivs i avsnitt 12. Detta bygger på förberedelsen av den spektrala bibliotek (beskrivs i Multiplex IHC Assay utveckling Guide, tillgänglig online). I det här steget tränas informera programvaran ”” att specifikt känna igen färgerna för varje TSA färgämne. Det spektrala biblioteket är skapade med hjälp av delar från en kontroll vävnad, såsom mänskliga tonsill, färgas med en jämnt uttryckliga markör, såsom CD20, tillsammans med varje enskild TSA färgämne på enskilda bilder. Dessutom behövs autofluorescens diabilder (också beskrivs i Multiplex IHC Assay utveckling Guide) för att träna programmet informera att känna igen och subtrahera vävnad autofluorescens. Autofluorescens kontrollglas bör vara beredd med hjälp av prover från samma vävnader som studeras (t.ex. lungcancer, etc.), behandlas på samma sätt som de multilaterala mellanbanksavgifter bilderna och inkuberas med primära och sekundära antikroppar men utan TSA färgämnet. Bara en enda autofluorescens spektral profil kan väljas, så var noga med att välja en representation av den observerbara autofluorescens som kan komma från kollagen, fibros, röda blodkroppar, endogena pigment och andra källor. Skapa ett nytt spektrala bibliotek i början av varje nytt projekt och använder en autofluorescens spektrum som är representativ av vävnad studie exemplar, samt kör samma vävnad block som positiv kontroll för varje parti inom samma projekt, värdefulla metodologiska åtgärder som hjälper till att förbättra samstämmigheten i den spektrala minoriteter över olika prover inom samma projekt.
Multiplex metoden som beskrivs i detta protokoll erbjuder flera felsökning verktyg, inklusive en signal-brus-utvärderare (räknas verktyg), släpp kontroller (Kompletterande material) och en patologi vy för kvalitetskontroll av färgningen. Verktyget räknar hjälper till att utvärdera intensiteten av färgningen och nivån på bakgrunden. Om den intensitet och/eller bakgrundsnivåerna är hög, är det första synsättet att minska utspädningen av TSA färgämnet. Om problemet kvarstår, bör de kromogena IHC-bilder som används för optimering av sådan särskild markör ses med en patolog, letar förekomsten av bakgrunden. Vyn patologi genereras av informera programvaran, med en Diaminobenzidin-liknande falsk framställning av fluorescensen från den TSA-länkade fluor, liksom en faux hematoxylin representation genereras från alla fluorescerande signaler, inklusive DAPI . Bilder från vyn patologi hjälp med den visuella utvärderingen av färgning mönster av en patolog för förbättrad färgning. Dessa verktyg bör alltid användas vid optimering av en ny panel och som kvalitetskontroll steg under färgning arbetsflödet.
Metoden mIF kräver användning av primära antikroppar som korrekt har validerats och optimerad för standard kromogen IHC på formalin-fasta vävnader. En av de stora fördelarna med metoden mIF TSA är exempelvis dess kompatibilitet med hjälp av primära antikroppar som har validerats och optimerad i anatomisk patologi laboratorium för klinisk användning12. Denna fördel innebär att multiplex panelerna kan anpassas av laboratoriet användaren att svara på specifika cancer immunologi frågor utan behov av preconjugated antikroppar, som ger snabb och dynamisk panel utveckling. I detta avseende börjar faktiska arbetsflödet för optimering av en ny panel med validering och optimering av antikroppar med standard kromogen IHC, letar efter den bästa utspädningen och färgning villkor som ger ren och konsekvent färgning. Nästa steg, använda samma spädningarna optimerad för IHC, är att överföra färgningen med TSA fluors i stället för Diaminobenzidin och jämföra resultaten av monoplex Immunofluorescerande TSA med den kromogen IHC som referens. Antikropparna kan slutligen kombineras i mIF färgning, alltid använda den kromogen IHC färgningsmönster som kontroll referens för att justera mIF TSA färgning parametrar, främst de TSA dye utspädningarna och färgning sekvensen. Under denna process är samarbete med en patolog avgörande för att utvärdera kvaliteten på färgningen.
Begränsningar av denna teknik är den tid och ansträngning som krävs för optimering och validering av nya paneler och immunophenotyping analys av mIF paneler. Viktigaste, är dock korrekt validering av mIF metoder. Bristen på korrekt validering av dessa tekniker bär risken för att generera ogiltig resultat, som kan lägga till förvirrande uppgifter i litteraturen, därmed hindra försök att få en bättre förståelse av biologi cancer immunologi16. Det är därför åligger utredaren att göra alla ansträngningar för att korrekt validering av multiplex metoder, inklusive att säkerställa nära deltagande och utvärdering av patologer med utbildning och erfarenhet inom validering och utvärdering av vävnad histopatologi och IHC-baserade tekniker17,18,19,20. Det protokoll som presenteras här ingår några av de verktyg som kan hjälpa med validering av en ny multiplex panel, inklusive patologi utvärdering av H & E bilder innan färgning och analys, användning av kromogen IHC som en hänvisning till optimera de multilaterala mellanbanksavgifterna TSA färgning, metoden droppe kontroll för kvalitetskontroll av en ny multiplex panel, och användningen av isotypen, autofluorescens, och släpp kontroller. Trots den tekniska komplexiteten i mIF metoder öppnar tekniker såsom Multispektral avbildning med spektrala minoriteter, liksom andra roman multiplex plattformar, en ny era för analys av vävnadsprover från patienter och generering av nya former data som inte är möjligt med standard IHC ensam. Därför, utveckling och tillämpning av mIF tekniker kommer att fortsätta växa, att bli kraftfulla verktyg för den cancer immunoprofiling av biopsier för kliniska prövningar och hjälper till att identifiera nya multiparametric Prediktiva biomarkörer för immunterapi, nytta, framför allt cancer patienten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete stöds av MedImmune, globala biologics R & D arm av AstraZeneca. C.W., K.R. och C.C.H. är anställda av Perkin Elmer, som producerar reagenserna (TSA kit) och Multispektrala skannrar som användes i detta arbete. M.S., K.D., A.H., W.Z., C. Bagnall, C. Brown, J.C., A.L., K.S., M.R. och J.R.C. är anställda av MedImmune med aktieägande eller lager intressen eller alternativ i AstraZeneca.
Acknowledgments
Redaktionellt stöd tillhandahölls av Deborah Shuman av MedImmune.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
