Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

لوحة الفلورة تعدد الإرسال الآلي للدراسات المناعية-علم الأورام في عينات الأنسجة الكبدية الفورمالين--ثابت

Published: January 21, 2019 doi: 10.3791/58390
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 3, 3, 1, 2, 1, 1, 4, 3, 1
1Laboratory of Pathology, MedImmune, 2Laboratory of Pathology, MedImmune, 3Akoya Biosciences Inc., 4Department of Translational Molecular Pathology, University of Texas - MD Anderson Cancer Center

Summary

بروتوكول مفصل للوحة علامة ستة الفلورة متعدد هو الأمثل وتنفيذها، باستخدام الملطخ الآلي لنتائج أكثر اتساقا وأقصر وقت إجراء. هذا النهج يمكن تكييفها مباشرة بأي مختبر للدراسات المناعية-الأورام.

Abstract

استمرار التطورات في علم الأورام المناعية تتطلب زيادة فهم آليات المناعة السرطان. تحليل عينات الأنسجة من الخزعات (FFPE) الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين إيمونوبروفيلينج أصبح أداة أساسية لفهم تعقيدات علم المناعة الورم واكتشاف رواية المؤشرات الحيوية التنبؤية للسرطان العلاج المناعي. إيمونوبروفيلينج تحليل الأنسجة يتطلب تقييم علامات مجتمعة، بما في ذلك الفئات السكانية الفرعية الخلية الملتهبة ونقاط التفتيش، ومحصنة في ورم المكروية. ظهور أساليب الرواية المناعي متعدد يسمح لتحليل مولتيباراميتريك أكثر كفاءة لأقسام الأنسجة واحدة مما لا immunohistochemistry مونوبليكس القياسية (المدينة). واحد الفلورة متعدد المتاحة تجارياً (إذا) الأسلوب هو استناداً إلى تضخيم إشارة تيراميدي، وجنبا إلى جنب مع تحليل مجهرية متعددة الأطياف، يسمح لفصل إشارة أفضل لعلامات مختلفة في الأنسجة. هذه المنهجية متوافق مع استخدام unconjugated الأجسام الأولية التي قد تم تحسينها للمدينة الموحدة على عينات الأنسجة FFPE. هنا يصف لنا بالتفصيل بروتوكولا مؤتمتة تسمح متعدد إذا وضع العلامات لعينات الأنسجة الكبدية مع لوحة جسم متعدد علامة الستة تضم PD-L1، PD-1، CD68، CD8، وكي-67، وسيتوكيراتينس AE1/AE3 مع 4، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي كونتيرستين خلية نووية. هو الأمثل في بروتوكول الفريق متعدد في الآلي الملطخ المدينة وقت المصبوغة هو أقصر من البروتوكول اليدوي ويمكن مباشرة تطبيقها وتكييفها من قبل المحقق أي مختبر للدراسات المناعية-علم الأورام في عينات الأنسجة FFPE البشرية. ووصف أيضا هي عدة عناصر وأدوات، بما في ذلك أسلوب إسقاط--عنصر تحكم لمراقبة الجودة الجميلة للوحة إذا كان متعدد جديدة، التي تعتبر مفيدة للتحسين والتحقق من صحة هذا الأسلوب.

Introduction

إيمونوبروفيلينج تحليل عينات الأنسجة FFPE الورم قد أصبح عنصرا أساسيا في الدراسات المناعية-الأورام، خاصة بالنسبة لاكتشاف والتحقق من صحة رواية المؤشرات الحيوية التنبؤية للسرطان العلاج المناعي في سياق التجارب السريرية1 ،2. يبقى المدينة اللونية، تشروموجينس الكيميائية مثل ديامينوبينزيديني، باستخدام تقنية قياسية في تشخيص الأمراض إيمونولابيلينج من الأنسجة خزعة3. المدينة الموحدة يمكن أن تستخدم أيضا لسرطان الأنسجة إيمونوبروفيلينج، بما في ذلك كوانتيتيشن من الفئات السكانية الفرعية من الخلايا المرتبطة بالأورام الليمفاوية، وتقييم مستويات التعبير من نقاط التفتيش المناعي مثل يجند موت الخلية المبرمج 1 (PD-L1)4 ،5. المدينة الموحدة محدودة، ومع ذلك، في أن يمكن أن يكون المسمى مستضد واحد فقط كل قسم الأنسجة. لأنه عادة ما تتطلب دراسات إيمونوبروفيلينج تحليل التعبير مجتمعة من عدة علامات، سيتطلب استخدام المدينة الموحدة تلطيخ لمقاطع متعددة من الأنسجة، وكل ملطخة بعلامة واحدة، و، ولذلك، سيكون محدودة إلى حد كبير لتحليل عينات الأنسجة الصغيرة مثل الأساسية إبرة الخزعات. طرق المدينة القياسية أيضا محدودة لتقييم العلامات التي يتم كويكسبريسيد عن الخلية متنوعة من السكان، كما شائع مع علامات الحاجز المناعي مثل PD-L1، التي يعبر عنها بالضامة المرتبطة بالورم والخلايا السرطانية. أبلغ هذا القيد في، على سبيل المثال، استخدام معيار مونوبليكس المدينة من أخصائيي علم الأمراض للتحليل الكمي لعلامة المدينة أعرب عنها الخلية مختلف أنواع6. تطوير تقنيات المدينة اللونية متعدد توظيف تشروموجينس الملونة المتنوعة على نفسه يمثل قسم الأنسجة النهوض على الأسلوب القياسي مونوبليكس المدينة،7 على الرغم من أنها تظل محدودة إيمونولابيلينج لعدد قليل علامات، ويقدم أيضا التحديات تقنية هامة للتقييم السليم لعلامات المعرب عنها في المقصورات سوبسيلولار نفس السكان الخلية نفسها.

المحاذير المذكورة أعلاه فيما يتعلق بتوافر الأنسجة من العينات السريرية، فضلا عن القيود المفروضة على تقنيات المدينة اللونية المتعددة، قد أدت إلى الحاجة إلى تطوير تحسين طرائق متعدد للدراسات المناعية-الأورام استناداً إلى وضع العلامات الفلورية جنبا إلى جنب مع التصوير النظم التي يمكن فعلياً فصل إشارات فلوروفوريس متعددة من نفس الشريحة. واحد مثل هذا الأسلوب يستند إلى تضخيم إشارة تيراميدي (TSA) جنبا إلى جنب مع تصوير مجهرية متعددة الأطياف للون كفاءة الفصل8. توظف مجموعة متاحة تجارياً على أساس حساب السياحة الفرعي فلوروفوريس الأمثل ل التصوير المتعدد الأطياف8 (انظر الجدول للمواد). ميزة هامة من هذا النظام هو توافقه مع نفس الأجسام المضادة الأولية غير مسمى التي تم التحقق من صحتها والأمثل لمعيار اللونية المدينة9،،من1011. وهذا ما يسمح أسرع الأمثل ليس فقط ولكن أيضا المرونة في التعديلات الأمثل ولوحة تتضمن أهدافا جديدة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون الأمثل طريقة حساب السياحة الفرعي الفلورة متعدد (mIF) المتاحة تجارياً الآلي المدينة الملطخ بالأنظمة، مما يسمح لنقل مباشر من مونوبليكس المدينة اللونية للقوة المتعددة الجنسيات.

نقدم هنا بروتوكولا لفريق القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات للدراسات المناعية-الأورام يستند الآلي صبغة mIF حساب السياحة الفرعي ويستخدم ماسح المتعدد الأطياف للتصوير. هذا البروتوكول يمكن تكييفها وتعديلها بواسطة أي مستخدم المختبر مع الوصول إلى وصف الأجهزة والمواد الكاشفة. يشمل البروتوكول فريق من ستة أجسام الأولية إيمونوبروفيلينج من الأورام السرطانية: PD-L1، PD-1، CD68 (كعلامة بلعم عموم)، CD8 (خلايا T-السامة للخلايا)، كي-67، و AE1/AE3 (pan-سيتوكيراتين، تستخدم كعلامة الظهارية للتعرف على سرطان خلايا). دراسة حديثة توضح الاستفادة المثلى من بروتوكول mIF إدارة أمن النقل اليدوي باستخدام المدينة اللونية كمرجع قياسي للتحقق من صحة متعدد تلطيخ12. قد وضعت طريقة تحديث المعروضة هنا باستخدام مجموعة حساب السياحة الفرعي المتاحة تجارياً، وسبعة ألوان محسنة في الملطخ الآلي، تقصير الوقت المصبوغة من 3 – 5 أيام إلى ح 14، بينما أيضا تحسين اتساق تلطيخ جذريا. بالإضافة إلى البروتوكول الرئيسية المفصلة المقدمة هنا، يتضمن قسم المواد التكميلية الأسلوب "إسقاط السيطرة"، عملية مراقبة نوعية إضافية لتقييم لوحة mIF جديدة، فضلا عن الملاحظات الفنية للتحسين، استكشاف الأخطاء وإصلاحها، والتنمية من جديد الألواح المتعددة لمساعدة المستخدم على مختبر لإعداد وتحسين طريقة حساب السياحة الفرعي mIF mIF مخصصة لوحات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: البروتوكول المقدمة هنا توضح كيفية إجراء إيمونوبروفيلينج فريق القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات باستخدام حساب السياحة الفرعي لأجسام ستة (CD68، ki67، PD-L1، PD-1 و CD8 و AE1/AE3) في الآلي الملطخ (انظر الجدول للمواد). البروتوكول يصف أيضا كيفية إجراء إسقاط عناصر التحكم لمراقبة الجودة من لوحة mIF جديدة (انظر المواد التكميلية). في هذا البروتوكول، يتم تلوين مع ثماني شرائح فب أونستينيد من البشرية لوزة (مراقبة إيجابية) والشرائح أونستينيد ثمانية من غدية الرئة البشرية. وتستخدم الشريحة الأولى لكامل متعدد تلطيخ مع كافة علامات ستة، والشريحة الثانية لمراقبة ايستب التي تستخدم لا أجسام الأولية والشرائح الستة المتبقية لإسقاط عناصر التحكم (انظر المواد التكميلية). عنصر تحكم إضافية للأنسجة أوتوفلوريسسينسي ينصح بشدة، وينبغي أن تدرج دائماً في متعدد الدراسة (انظر المواد التكميلية). ومع ذلك، يمكن توظيف المحققين سائر أنواع الورم والضوابط وفقا لأهدافها الخاصة بالمشروع. مختبر المستخدمين دون خبرة سابقة مع أسلوب حساب السياحة الفرعي mIF وتقنيات الماسح المتعدد الأطياف يجب قراءة "دليل تنمية المدينة متعدد" (المتاحة على شبكة الإنترنت في http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). على الرغم من أن يصف هذا الدليل بروتوكول يدوي، كما يوفر مقدمة طيبة لتلطيخ أسلوب القوة المتعددة الجنسيات. جميع أقسام الأنسجة المستخدمة في هذا البروتوكول قد تصبح مجهولة المصدر والموافقة وفقا "إعلان هلسنكي".

1. عينات الأنسجة

  1. حدد عينة لوزة البشر FFPE المحتوية على تضخم اللمفاوية لاستخدامها كعنصر إيجابي وعينه غدية الرئة بشرية فب من المعروف أن PD-L1 إيجابية. استعراض الشرائح (H & E) الهيماتوكسيلين وويوزين من كتل سرطان الرئة المحدد لتأكيد وجود ورم. من المهم تجنب الأورام مع المناطق وفيرة من نخر كهذا قد يزيد تلوين الخلفية غير محددة.
    ملاحظة: لهذا التحسين، وتجنب استخدام كتل البارافين التي تم تخزينها لمدة 10 سنوات أو أكثر والأنسجة مع مظهر مجففة في كتلة البارافين (استشارة أخصائي علم الأنسجة).
  2. استخدام مبضع، قطع 10 مقاطع تسلسلية متتالية من كل كتلة، 4 ميكرومتر سميكة. جبل المقاطع على شريحة زجاجية إيجابيا يحمل المستخدمة للمدينة، مقطع واحد كل شريحة.
    ملاحظة: يجب تحميل المقاطع تماما شقة دون التجاعيد، كما قد تنشئ التجاعيد التحف المصبوغة. عدد شرائح مقاطع المسلسل من 1 إلى 10.
  3. إعداد شريحة ح & ه جديدة في القسم الأول. استعراض الشريحة ح & ه بمساعدة أخصائي للتأكد من وجود ورم الأنسجة أو الرئة لوزة المتبقية في الكتلة.
    ملاحظة: يمكن أن تساعد هذه الشريحة H & E، في وقت لاحق، مع تحديد المناطق ذات الأهمية لتحليل الأطياف وفينوتيبينج.
  4. تخزين المقاطع أونستينيد في مربع شريحة بلاستيكية عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.

2. إنشاء mIF جديدة البرنامج Staining في "الملطخ" الآلي: التسجيل المواد الكاشفة

ملاحظة: يجب إضافة الكواشف إلى قائمة الكاشف في البرنامج الملطخ الآلي قبل أن تكون متوفرة للاستخدام في البروتوكولات. انظر الجدول للمواد للحصول على معلومات عن الصيغة النموذجية والبرمجيات الملطخ الآلي.

  1. انقر فوق علامة التبويب الكواشف داخل البرنامج الآلي الملطخ. انقر فوق إضافة تعيين كاشف جديد. أدخل الاسم (مثلاً، "520 حساب السياحة الفرعي الكاشف") والاسم المختصر (على سبيل المثال، "520 حساب السياحة الفرعي")، مشيراً إلى أن هناك ثمانية أحرف كحد أقصى. حدد فرعية من قائمة منسدلة وتعيين المورد. لا تقم بتغيير وصمة عار مفردة/مزدوجة من DS واحد/تسلسلي. تعيين الافتراضي تلطيخ بروتوكول و البروتوكول. تعيين بروتوكول هير الافتراضي إلى ER1 20.
  2. حفظ الكاشف الجديد وكرر الخطوة 2، 1 لجميع المواد الكيميائية المدرجة في الجدول 1.

3-الملطخ الآلي: تسجيل للحاويات

  1. كتابة اسم الكاشف لاستخدامها على جانب كل حاوية. مسح الباركود على الجانب. في النافذة المنبثقة، حدد الكاشف الصحيح من القائمة. حدد تاريخ انتهاء صلاحية وحفظها.
  2. كرر الإجراء في الخطوة 3، 1 لجميع المواد الكيميائية المدرجة في الجدول 1.
  3. تسجيل عدة أبحاث مفتوحة. مسح كل الرموز الشريطية على جانب الطقم واتبع المطالبة التي تظهر على الشاشة. اسم المجموعة "أدوات البحث متعدد 1." سجل أمينوميثاني x tris (هيدروكسيميثيل) 1 (تريس)-مخزنة المالحة كجزء من هذه المجموعة (الجدول 1).

4-الملطخ التلقائية: إنشاء القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات "برنامج بروتوكول"

  1. هو بروتوكول متعدد قاعدة مسبقة مع اسم أوبال 7 متعدد في ستاينيرس الآلي الجديد (انظر الصيغة النموذجية والبرمجيات في الجدول للمواد). حدد البروتوكول بتصفية "جميع" بدلاً من "المفضلة" على الشاشة البروتوكول. إذا كان البروتوكول الأساسي غير موجود، ثم تحديث البرنامج الملطخ الآلي مع المساعدة من الشركة المصنعة.
  2. وينبغي إجراء جميع التعديلات على نسخة من الأصلي للبروتوكول. قبل إجراء التغييرات، حفظ الأصلي وإنشاء نسخة عن طريق النقر فوق علامة التبويب برتوكولات ، ثم النقر بالزر الأيمن على البروتوكول 7 أوبال متعدد وتحديد النسخة.
  3. قم بتغيير الاسم إلى بروتوكول متعدد 7 1 في نافذة جديدة، وحدد علامة التبويب المقترنة مع الجهاز الصحيح (نموذج الكلمة أو benchtop). تتطابق مع البروتوكول في تكميلية الجدول S1. انقر فوق إضافة كاشف إضافة خطوة تثبيط البيروكسيديز 10 دقيقة (وليس جزءا من بروتوكول قياسي) وحدد المانع البيروكسيديز الكاشف.
  4. وتؤكد أن الخطوات حظر استخدام المخزن مؤقت حظر الحزب الشيوعي الإندونيسي. التأكد من أن كل جسم الأولية تشير إلى الكاشف المناسب، أن الخطوات جسم الثانوية الاستفادة بوليمر HRP، ويستخدم ذلك الطيفية 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) مزودة بأدوات التشغيل الآلي متعددة الأطياف. تأكيد جميع الخيارات عن طريق فحص الكاشف التي عينت لكل خطوة منها في القائمة المنسدلة على الشاشة البروتوكول.

5-الملطخ الآلي: إضافة إفلات عناصر التحكم، وبروتوكول التحكم ايستب

  1. نسخ اسم بروتوكول متعدد 7 1 وتغييره إلى بروتوكول متعدد 7 إسقاط 1 CD68. تغيير الكاشف جسم CD68 إلى مفتش الماوس وحفظ البروتوكول.
  2. إنشاء ستة بروتوكولات جديدة أكثر، واحدة لكل عنصر تحكم الإفلات وواحد لعنصر التحكم ايستب كاملة (تغيير جميع الأجسام المضادة إلى إيسوتيبيس المناسب) بنفس الطريقة.

6-الآلي الملطخ: الشريحة إعداد بروتوكول

  1. نسخ البروتوكول بريستينينج * خبز ودو ، وإعادة تسمية هذا البروتوكول "خبز متعددة الأطياف" وح 2 دو.
  2. تعديل البروتوكول لمطابقة الكواشف هو مبين في الجدول 2. خبز شرائح ح 2 عند 60 درجة مئوية. دو لمدة 30 ثانية عند 72 درجة مئوية.

7-صباغة الآلي: إعداد الكواشف

  1. تحضير الأدوات كشف البحث واحدة. يجب أن تكون كاشف واحد المقترنة بشكل دائم مع هذه المجموعة، حيث ملء حاوية مفتوحة 30 مل عليها ل 1 x تريس مخزنة المالحة (تبس) مع 1 x TBS وتحديد موقع هذا في الموضع 1 (الأبعد عن المقبض) في عدة بحوث الكشف المعينة "مجموعة أدوات البحث متعدد" 1. هذا الكاشف ستكون مرتبطة بشكل دائم مع هذه المجموعة البحثية ويجب عدم تغيير الموقف لاستخدامها في المستقبل.
  2. قم بتسمية اثنين 30 مل فتح الحاويات كتلة متعددة الأطياف و متعددة الأطياف الثانوية. ملء حاوية كتلة متعددة الأطياف مع 30 مل من المخزن المؤقت/جسم حظر مادة من الطقم المصبوغة متعددة الأطياف. ملء حاوية متعددة الأطياف الثانوية مع 30 مل بوليمر جسم الثانوي موس مكافحة-rabbit المضادة من الطقم المصبوغة متعددة الأطياف.
  3. إعداد عشرة مل 7 حاويات مفتوحة. وحدة التخزين المطلوبة في ميكروليتيرس هو 600 + (150 × [عدد الشرائح]). سيتم تطبيق كل جسم للشرائح 12 في هذه الحالة (لوزة ستة وستة الرئة). تتم الإشارة إلى وضع العلامات ووحدات التخزين لكافة الحاويات في الجدول 3.
  4. لكل جسم الأنبوبة، إضافة للمرة الأولى الجسم مادة، متبوعاً بجسم الأساسي يتركز في وحدات التخزين المشار إليها في الجدول 3. مزيج من بيبيتينج لطيف.
  5. إعداد حاوية مفتوحة 7 مل DAPI، استخدام أربعة قطرات تركيز DAPI في المليلتر من الماء المقطر المزدوجة؛ ما مجموعة 16 سوف تكون ملطخة DAPI (600 + [150 × 16] = 3,000 ميليلتر). أضف 3 مل من الماء المقطر مزدوجة بالإضافة إلى 12 قطرات من DAPI الطيفية في الحاوية. إعداد DAPI جديدة لكل تشغيل.
  6. إعداد 7 مل حاوية مفتوحة للمانع البيروكسيديز. سيتم التعامل مع كافة الشرائح 16 مع مثبط البيروكسيديز (600 + [150 × 16] = 3,000 ميليلتر). أضف 3 مل كتلة البيروكسيديز في الحاوية.
  7. قبل إعداد العامل تركيزات فلورس، ريسوسبيند جميع فلورس المجففة بالتبريد بإضافة 75 ميليلتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى كل أنبوبة فلور توفيرها من قبل الشركة المصنعة. مزيج من بيبيتينج. هذا هو رصيد حساب السياحة الفرعي فلور. مخزن في 4 درجات مئوية.
  8. إعداد ست حاويات المعايرة، واحدة لكل فلور. وحدة التخزين المطلوبة في ميكروليتيرس هو 350 + (150 × [عدد الشرائح]). سيتم تطبيق كل فلور لشرائح 16 في هذه الحالة (لوزة ثمانية وثمانية من الرئة). تتم الإشارة إلى وضع العلامات ووحدات التخزين لكافة الحاويات في الجدول 4.
  9. عندما تم تسجيل جميع الكواشف وإعداد، ضع كل حاوية في أي مكان على رف وتحميل جميع الكواشف على الملطخ الآلي. وسيؤكد التحقيق وحدة التخزين لكل كاشف.

8-الملطخ الآلي: عينة الإعداد وتلطيخ متعددة الأطياف

  1. في البرنامج الآلي الملطخ، انقر فوق "إعداد الشرائح" في الجزء العلوي من الشاشة. انقر فوق إضافة الدراسة. ملء الإطار المنبثق مع دراسة معرف واسم الدراسة، والتعليقات.
    1. حدد اسم الباحث إجراء تشغيل المصبوغة من القائمة المنسدلة. اترك حجم dispense في 150 ميليلتر. حدد متعددة الأطياف دو إعداد البروتوكول. انقر فوق موافق ثم إضافة الشريحة. ضمن التعليقات، اكتب "متعدد 1 الرئة 123ABC". أكمل الحقول التالية كما هو مبين: نوع الأنسجة = اختبار النسيج؛ حجم Dispense = 150 ميليلتر؛ وضع Staining = واحد الروتينية؛ علامة = السلبية؛ تلوين = اكتب "7 متعدد البروتوكول 1"؛ إعداد = خبز متعددة الأطياف، دو ح 2؛ هير = هير 20 دقيقة مع ER1.
  2. انقر فوق إضافة الشرائح وتغيير التعليقات وبروتوكول لإضافة إسقاط عنصر التحكم الشرائح والشرائح التحكم ايستب. عندما تم إضافة كافة الشرائح للدراسة، قم بإغلاق إطار إضافة الشرائح وطباعة بطاقات العنونة. تطبيق التسميات على مجال التسمية المناسبة على كل شريحة.
  3. تحميل الشرائح إلى الرفوف وتطبيق البلاط الغطاء في الاتجاه الصحيح، وإدراج الرفوف في صباغة الآلي وانخفاض في علب. وسوف تفحص الجهاز التسميات الشريحة.
  4. عندما تم مسحها ضوئياً وتقاس جميع الشرائح والمواد الكاشفة. زر التشغيل (►) سوف تصبح نشطة. إذا أوتوستاينير الكشف عن أي أخطاء، مثل حجم الكاشف غير كافية، سوف يظهر رمز تحذير أصفر بعلبة المتأثرة. في حالة حدوث خطأ، حق انقر على رمز تنبيه وتصحيح الخطأ.
  5. بدء التلوين فورا أو جدولة بدء المتأخر. البروتوكول حوالي 14 ح في المدة. ملاحظة: ضمان سيتم إكمال البروتوكول في وقت عندما الشرائح يمكن إزالتها فورا كما إيزيس الغسيل يمكن أن تؤثر على نتائج المصبوغة.

9-كوفيرسليبينج الشرائح المتعددة الأطياف

  1. إزالة الشرائح من الملطخ الآلي وتخزينها في رف غارقة في 1 × tbs.
  2. تحميل العينات مع كوفيرسليبس رقم 1، 5 و 15 ميليلتر لتركيب وسائل الإعلام (انظر الجدول للمواد). قم بإزالة أي فقاعات عن طريق الضغط بلطف على ساترة مع تلميح ماصة.
  3. السماح للشرائح لعلاج بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء المختبر. يمكن تفحص الشرائح أونكوريد فورا بمعالجة متأنية.

10-الأطياف الماسح الضوئي

  1. السلطة على الماسح المتعدد الأطياف وعلى الكمبيوتر (انظر الجدول للمواد للمعلومات النموذجية والبرمجيات). بدء تشغيل البرنامج تحكم المجهر. فتح الباب الأمامي للماسح المتعدد الأطياف بالضغط على زر حساسة للمس على الجزء الأمامي الجهاز. وتحمل كل حاملة نابض في الماسح الضوئي أربع شرائح. تحميل كافة الشرائح إلى الناقلين وسجل النظام قبل تحميل الناقلين في الجهاز.
  2. حدد بروتوكول تحرير ثم انقر فوق جديد...؛ ثم، قم بإنشاء اسم بروتوكول متعدد الفريق 1 وإفلات عناصر التحكم. إنشاء اسم دراسة تطوير الفريق متعدد، انقر فوق إنشاء بروتوكول، واكتب نظرة عامة حول مسح عامل التصفية DAPI؛ ثم، حدد مسح الشريحة كاملة و "القرار بكسل" 0.50 ميكرومتر (20 س). ينبغي أن تمثل جميع المرشحات والعصابات. إذا لم يكن الأمر كذلك، انقر فوق تحرير عوامل التصفية والعصابات، وحدد كل المرشحات الخمس (DAPI، فيتك، CY3، تكساس الأحمر و CY5)، وثم انقر فوق تحرير التعرض.
  3. تحميل الناقل عن طريق تحديد الناقل متعدد كامل من الرئة غدية. حدد الشريحة الصحيح باستخدام واجهة المستخدم الرسومية. التركيز الأنسجة أما يدوياً أو باستخدام ضبط تلقائي للصورة. انتقل إلى أي منطقة تلطيخ DAPI مقبولة وانقر فوق كشف تلقائي لضبط التعرض في ميلي ثانية (0 – 2,000 ms).
  4. كرر الإجراء نفسه لكل خمس مجموعات التصفية في الأعمدة مسح كامل والمنطقة إس. من المؤكد أن انتقل إلى منطقة ذات صبغة مقبولة وإعادة تركيز المجهر قبل تعيين التعرض لكل مستوى التصفية والتكبير. كشف تلقائي لجميع المرشحات الخمس في 20 x المسح الشامل و 20 x (MSI) التصوير المتعدد الأطياف مناطق متعددة الأطياف. تحديد دقة بكسل من 0.50 ميكرومتر (20 س). حفظ البروتوكول وانقر مرة أخرى للعودة إلى الشاشة الرئيسية للبرنامج فكترا؛ ثم، انقر فوق مسح الشرائح.
  5. فتح واجهة لكل شريحة، وتعيين المهام مسح. وضع دراسة تطوير الفريق متعددوتعيين بروتوكول متعدد الفريق 1و "إسقاط عناصر التحكم" وتعيين معرف الشريحة إلى متعدد الرئة ABC123، إسقاط ABC123 الرئة CD68 متعدد، إلخ . عندما يتم تعيين المهام، وقد وصفت كافة الشرائح انقر فوق مسح. الماسح المتعدد الأطياف الآلي سيقوم بإجراء مسح الشريحة كاملة لكافة الشرائح باستخدام جميع المرشحات الخمس.

11-الأطياف الماسح الضوئي: التصوير المتعدد الأطياف

  1. مجرد اكتمال التفحص، افتح البرنامج قبتيف ("فينوتشارت") ثم انقر فوق تحميل الشرائح في أعلى يسار. سيؤدي هذا إلى فتح قبتيف، وتفحص كل الشرائح الخمس-تصفية. كل طبقة تحتوي على معلومات من فلور واحد أو أكثر، ذلك الأداة المساعدة محدودة، ولكن هيكل الأنسجة وأنماط التعبير عريضة واضحة ويمكن استخدامها لتحديد مناطق لاس.
  2. انتقل إلى وفتح الشريحة الصحيح في هذه الدراسة باستخدام شجرة القائمة المنسدلة على اليسار. تسجيل الدخول (أعلى اليمين) مع الأحرف الأولى من اسم المستخدم.
  3. تحديد خمس مناطق لاس باستخدام أداة الختم في الجزء العلوي من الشاشة. استشارة أخصائي إذا كان أحدها متوفراً. ضمن حدد، حدد اقتناء؛ تحت حجم في الحقول، حدد 1 x 1؛ وتحت قيود الحقل، حدد 0.5 ميكرومتر (20 س). استناداً إلى سيتوكيراتين (كورونا) تلوين (أساسا في Cy5)، حدد عدة مناطق مع الورم (كورونا تشيكية +) وسدى (كورونا-) تصويرها من الفحص الشامل. كرر هذا الإجراء لكل شريحة.
  4. عندما يتم تحديد جميع MSIs، إغلاق البرنامج فينوتشارت والعودة إلى البرنامج فكترا . قم بتغيير المهمة من المسح الضوئي إس لكل شريحة، وثم انقر فوق التفحص مرة أخرى لأداء مجموعة MSI.

12-الطيفية اتقانا

ملاحظة: الخطوة اتقانا الطيفية المطلوبة لفصل القناة وتحليل الصور من الشرائح. قبل أن يتم تنفيذ اتقانا الطيفية في إبلاغ البرنامج، يجب أن يبني مكتبة الطيفية باستخدام الشرائح غدية الرئة ملطخة بكل فلور وحدها، ومع DAPI وحدها. كما يتم وصف هذا الإجراء في المدينة متعدد المذكورة أعلاه "دليل التنمية المقايسة".

  1. عند الانتهاء من اقتناء MSI، استخدام البرنامج ("إبلاغ") اتقانا الطيفية لفتح الملفات في مجلد MSI . في نهاية هذه الملفات في ملحق نوع الملف.im3.
  2. ضمن تنسيق صورة، حدد مولتيسبيكترال؛ ضمن نموذج تنسيق، حدد الأسفار؛ وحدد إطار مصدر مكتبة طيفية، إبلاغ.
  3. لتحديد فلورس، حدد وتحميل كافة فلورس و DAPI ستة من مكتبة بني غدية الرئة مكتبة الشرائح. انقر فوق إعداد جميع (أسفل اليسار). سوف تؤدي البرامج اتقانا الطيفية اتقانا الطيفية على كل الصور المفتوحة، باستخدام التشكيلات الجانبية الطيفي المقدمة.
  4. مع أخصائي، تقييم نمط المصبوغة ضد البقع اللونية واحدة لنفس الهدف في شرائح متتالية من نفس الأنسجة.

13-تقييم شدة الأسفار والتوهين إشارة

ملاحظة: أداة التهم، الذي يظهر كسهم مع مربع صغير براون، هو أهم أداة للتحسين متعدد، وينبغي أن تستخدم في كثير من الأحيان (انظر المواد التكميلية). باستخدام أداة التهم في البرنامج اتقانا الطيفية، تقييم نسبة الإشارة إلى الضوضاء، التي ينبغي أن تتجاوز 10:1 (انظر المواد التكميلية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييم متعدد تلطيخ مع إفلات عناصر التحكم) كحد أدنى.

  1. 13.1-بصورة مفتوحة في البرنامج اتقانا الطيفية، إشراك الأداة التهم ومسح الصور لتقييم شدة الأسفار لكل قناة. كثافة المستهدفة في أنسجة الرئة بين 10 و 20 من التهم تم تسويتها. أداة تطبيع التهم يرد في الشكل 1.
  2. استبعاد شرائح مع التهم إشارة الحد الأقصى من تهم المنطقة إشارة أقل من 10 أو العادي بأقل من خمسة بالنسبة لأي علامة بحيث أوتوفلوريسسينسي وتلطيخ خارج الهدف لا تتنافس مع إشارة أصيلة.
  3. وتعول استبعاد شرائح مع الحد الأقصى أكبر من 30 لأي قناة لتجنب نزيف الطيفية أو عدم الكفاءة الطيفية اتقانا.
  4. معالجة التهم طبيعية عالية أو منخفضة عن طريق ضبط تركيز إدارة أمن النقل.

14-تحليل الصور الأطياف

  1. فتح MSI واحدة أو أكثر في مجال البرمجيات اتقانا الطيفية وفلورس فقط حدد أونميكسينج التي تمثل في صورة مفتوحة واحدة على الأقل. انقر فوق إعداد جميع أونميكس جميع الصور الملونة المفتوحة حاليا لإنتاج صور غير مخلوط طيفيا.
  2. حدد أداة التهم لدراسة التهم الموجهة إليه عبر كل صورة التي تحوم فوق مسؤولياتك الاهتمام.
  3. حدد أيقونة العين لفتح محرر طريقة العرض. تحديد وضبط كثافة عرض كل قناة مستقلة.
  4. حدد تكوين لفتح تجزئة الأنسجة، تجزئة الخلية، فينوتيبينج، ونماذج التسجيل. هذه الأدوات اللازمة للتحقق من صحة موضوعي متعدد تلطيخ ضد البقع اللونية واحدة ويمكن استخدامها لتوليد البيانات الكمية فينوبتيك (S1 الشكل).
  5. استخدم علامة التبويب تصدير لحفظ التدرج الرمادي، نيون، TIFF غير مضغوط على غرار باثفيو، وملفات البيانات من وحدات التحليل فينوبتيك للمزيد من التحليل، والأرشفة، والعروض التقديمية (S1 الشكل).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البروتوكول هو موضح هنا سوف توفر نتائج مثل تلك المبينة في الشكل 2. البدء بتقييم لتلطيخ في عنصر التحكم لوزة، بدءاً بظهارة الخلايا الحرشفية السطحية. يمكن مراجعة علم الأنسجة للعينة لوزة مع أخصائي، استخدام الشريحة ح & ه كمرجع. إذا كانت أبواب المدينة اللونية تتم مع علامات نفس كتلة الأنسجة نفسها، ثم هذه يمكن استخدامها للتأكد من الكثافة والتوزيع لكل علامة على الشريحة القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات. كما هو مبين في الشكل 2أ، الأنسجة لوزة ينبغي توفير سيتوكيراتين AE1/AE3 محددة بوضوح تلطيخ في الظهارة الحرشفية السطحية لوزة (الشكل 2أ؛ وصفت بسيودوكولور أحمر)، دون خلفية في الليمفاوي الأنسجة. تلطيخ ينبغي هيولى، أحياناً مع استفحال الغشاء، ويجب أن تكون النواة سلبية. ظهارة شبكية في أقبية ينبغي أن تكون إيجابية بالنسبة لكل من سيتوكيراتينس (أحمر) وشعبة المشتريات-L1 (الشكل 2أ؛ بسيودوكولور الخضراء). وينبغي، ثم تحديد مراكز جيرمنال الحبيبي لوزة. مراكز جيرمنال ينبغي التعرف عليها بسهولة، وينبغي أن تكون غنية بأن كي-67-إيجابية الخلايا الليمفاوية (الشكل 2أ؛ بسيودوكولور الأصفر). أن كي-67 تلطيخ ينبغي دائماً النووية. كما ينبغي أن الضامة الموجودة في مراكز جيرمنال يمكن التعرف عليه بسهولة، في بعض الأحيان كأكبر الخلايا (تسمى أيضا "الهيئات تينجيبلي"). سوف تظهر إيجابية تلطيخ ل CD68 كوصمة هيولى حبيبية (الشكل 2أ؛ بسيودوكولور البرتقالي). نسبة متغيرة من الخلايا CD68 خارج مراكز جيرمنال يتوقع أيضا. قد تظهر الضامة غشاء تلطيخ لشعبة المشتريات-L1. وهذا عادة ما اشحب في كثافة من تلطيخ لشعبة المشتريات-L1 في ظهارة شبكية. ينبغي أن يكون هناك لا CD68 النووية تلطيخ. CD8 ينبغي أن وصمة عار لمفاوية بتوزيع تي خلية (أقل في مراكز جيرمنال ونسبة أكبر في المناطق إينتيرفوليكولار؛ انظر الشكل 2أ، بسيودوكولور السماوي). CD8 + الخلايا اللمفية خلايا صغيرة عادة مع السيتوبلازم ضئيلة، حيث أنه من المستحيل عمليا التمييز غشاء مقابل السيتوبلازم في الخلايا الليمفاوية. PD-1 سيقوم بشدة وصمة عار لمفاوية صغيرة في منطقة مركز جيرمنال، عادة ما تتجمع في محيط مراكز جيرمنال (الشكل 2أ؛ بسيودوكولور الأرجواني)، فضلا عن مبعثرة الخلايا الليمفاوية في منطقة إينتيرفوليكولار، وعادة ما عرض كثافة المصبوغة أقل من تلك التي في منطقة مركز جيرمنال. كما هو الحال مع CD8، من غير الممكن تميز بوضوح غشاء وتلطيخ هيولى في الخلايا الليمفاوية الصغيرة الملون مع PD-1. نسبة متغيرة من الخلايا CD8 كويكسبريس PD-1، فمن المستحسن لأغراض مراقبة الجودة أنه نمط المصبوغة والتوزيع لكل علامة هو الملون في أنسجة نفس مقارنة مع الشرائح مرجع المدينة اللونية، كما اقترح في12من البروتوكولات نشرت سابقا.

بعد أن تأكدت النمط المصبوغة المتوقع في مراقبة الأنسجة لوزة، نشرع في تقييم تلطيخ في العينة سرطان الرئة (الشكل 2ب). لأنه من المتوقع أن تظهر تعبير متغير وغير متجانسة من العلامات ورم الأنسجة، من المهم جداً أثناء الاستفادة المثلى من لوحة mIF جديدة مقارنة نمط المصبوغة لكل علامة الفردية التي لوحظت في أسلوب القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات والتعبير عن ولوحظ في الشريحة المدينة اللونية القياسية، تقييم كمية وتوزيع الخلايا إيجابية كما هو موضح سابقا12. ومع ذلك، ينبغي الحفاظ على نمط المصبوغة الأساسية؛ على سبيل المثال، ينبغي مراعاة سيتوكيراتينس في السيتوبلازم للخلايا الظهارية وابدأ في نواة؛ يجب أن تظهر CD68 تلطيخ هيولى حبيبية في الضامة، إلخ. الأهم من ذلك، في بعض المناطق, بكثافة المصبوغة قد تتغير من عنصر التحكم لوزة إلى أنسجة السرطان؛ على سبيل المثال، يمكن أن تظهر PD-1 و PD-L1 تلطيخ في أنسجة الورم مقارنة بالتعبير عالية جداً في مراقبة لوزة أقل كثافة. ولذلك، من المهم إجراء التقييم والتحسين باستخدام أداة التهم في البرنامج إبلاغ، باستخدام أمثلة من أنسجة الورم بدلاً من عناصر التحكم لوزة.

أخيرا، فرض ضوابط ايستب السلبية وإسقاط تحتاج إلى تقييم، ليس فقط للكشف عن خلفية وأوتوفلوريسسينسي ولكن أيضا لآثار مظلة وتنزف الطيفية (رقم 3 و رقم 4). ضوابط ايستب ينبغي أن لا تثبت أي immunostaining عبر الشريحة؛ إذا كان يتم ملاحظة أي تلطيخ، ثم التصوير أو تلطيخ الإجراء يجب أن يعاد. إسقاط عناصر التحكم هامة لتقييم النتائج الملموسة المحتملة في تلطيخ، مثل آثار التسييل أو مظلة الطيفية، نظراً لأسلوب القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات خلال الاستفادة المثلى من فريق متعدد جديد (انظر الشكل 5، تكميلية الشكل S2، S3 التكميلية الرقم، و مواد تكميلية). ينبغي تقييم الضوابط مونوبليكس وإسقاط الفلورسنت ومقارنة مع الفريق متعدد كامل. يجب أن يظهر عنصر التحكم إسقاط كل نفس النمط المصبوغة باستثناء جسم أساسي واحد، التي ينبغي إزالتها من كل عنصر تحكم محدد. ترد تفاصيل أخرى في قسم المواد التكميلية .

Figure 1
الشكل 1 : إعلام "أداة حساب". يتم تنشيط الأداة تهمة برمجيات إبلاغ عن طريق تحديد رمز مربع بيج. يتم تصحيح التهم تم تسويتها لعمق البت، زمن التعرض للضوء وكسب و binning. واتخذت هذه الصور على 20 X التكبير؛ شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : نتائج الممثل. سرطان الرئة الخلية نونسمال لوزة (أ) و (ب) كانت ملطخة PD-L1 (520 حساب السياحة الفرعي، الأخضر)، CD8 (540 حساب السياحة الفرعي، أزرق سماوي)، Ki67 (570 حساب السياحة الفرعي، الأصفر)، CD68 (السياحة 620، البرتقالي)، سيتوكيراتين (650 حساب السياحة الفرعي، الأحمر)، و PD-1 (690 حساب السياحة الفرعي، أرجواني). يتم تمثيل القنوات الفردية بشكل منفصل أدناه في اللوحات الصغيرة. تتم الإشارة إلى العلامة في الجزء الأيسر العلوي من كل صورة. واتخذت هذه الصور على 20 X التكبير؛ شريط المقياس = 50 (أو 250 ميكرومتر). المشار إليه في الفريق هي A 1) جريب اللمفاوية ومركز 2) غيرمينال المنطقة 3) إينتيرفوليكولار 4) الطبقية الحرشفية ظهارة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تأثير حجب مظلة تسا- وهذا مثال على حساب السياحة الفرعي 690 أودعتها PD-1 حظر جسم إشارة CD3 بطريقة تعتمد على المبلغ لحساب السياحة الفرعي الحالي. إشارة تسا 690 ألمع كتل إشارة السياحة 620 الأكثر فعالية (سرطان الرئة الخلية نونسمال ملطخة بمكافحة-PD-1 D4W2J لمدة 30 دقيقة في 0.52 ميكروغرام/مل أو ايستب متبوعاً بكشف حساب السياحة الفرعي 10 دقيقة 690 1: 100؛ ثم، F7.2.38 المضادة CD3 لمدة 30 دقيقة في 0.14 ميكروغرام/مل متبوعة بكشف حساب السياحة الفرعي 620 دقيقة 10 في 1: 100). واتخذت هذه الصور على 20 X التكبير؛ شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : التسييل الطيفية. كان الملون أنسجة سرطان الرئة الخلية نونسمال مع بروتوكول التحكم قطره كي-67 (بروتوكول متعدد كامل مع جسم كي-67 محذوفة). تظهر القناة حساب السياحة الفرعي 540 (CD8) وقناة السياحة 570 (كي-67). لا يوجد نمط المصبوغة النووية الظاهر، ومع ذلك نسخة تقلص من CD8 تلطيخ النمط الملاحظ في قناة السياحة 570. هذا هو أفضل معالجة بضمان كثافة المصبوغة قابلة للمقارنة في جميع القنوات. وفي هذه الحالة، سيتم تصحيح إضافة إشارة قوية كي-67 (التهم مسواة بين 10 و 20) التسييل الطيفية. واتخذت هذه الصور على 20 X التكبير؛ شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : إسقاط عناصر التحكم- هذا الرقم يظهر صورة مركبة لكامل متعدد بالمقارنة مع نفس المنطقة من شرائح متتالية من الرئة غدية ملطخة بإسقاط عناصر التحكم التي أسقطت جسم الابتدائي المشار إليه. واتخذت هذه الصور على 20 x التكبير؛ شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الاسم اسم abbr. نوع حاوية المجموعة
المخزن المؤقت لحظر الحزب الشيوعي الإندونيسي أوبالبلوك الثانوية فتح 30 مل العام
برنامج الصحة الإنجابية البوليمرات أوبال 2AB أوبال الثانوية فتح 30 مل العام
أوبال 1 x TBS OPAL1TBS الثانوية فتح 30 مل طقم مخبر الشرطة
CD68 0.30 ميكروغرام/مل موس PG-M1 OPALCD68 الثانوية فتح مل 7 العام
ki67 ميكروغرام/مل 0.61 ميجابت-1 "موس" OPALki67 الثانوية فتح مل 7 العام
PD-L1 0.20 ميكروغرام/مل SP263 رب OPALPDL1 الثانوية فتح مل 7 العام
PD-1 0.52 ميكروغرام/مل D4W2J رب PD1 أوبال الثانوية فتح مل 7 العام
CD8 0.70 ميكروغرام/مل SP239 رب CD8 أوبال الثانوية فتح مل 7 العام
كورونا تشيكية 0.24 ميكروغرام/مل موس AE1/AE3 كورونا تشيكية أوبال الثانوية فتح مل 7 العام
مفتش الماوس المصحف أوبال الثانوية فتح مل 7 العام
مفتش الأرنب RAB أوبال الثانوية فتح مل 7 العام
كتلة البيروكسيديز أوبال أوبالبيركس الثانوية فتح مل 7 العام
DAPI الطيفية أوبالدابي الثانوية معايرة مل 6 العام
كاشف أوبال 520 أوبال 520 الثانوية معايرة مل 6 العام
كاشف أوبال 540 أوبال 540 الثانوية معايرة مل 6 العام
كاشف أوبال 570 أوبال 570 الثانوية معايرة مل 6 العام
كاشف أوبال 620 أوبال 620 الثانوية معايرة مل 6 العام
كاشف أوبال 650 أوبال 650 الثانوية معايرة مل 6 العام
كاشف أوبال 690 أوبال 690 الثانوية معايرة مل 6 العام

الجدول 1: السندات إيكا RX البروتوكول، والكواشف أوبال

كاشف الوقت (ح) درجة الحرارة (درجة مئوية)
1 لا كاشف 120:00 60
2 السندات دو الحل 0:30 72
3 السندات دو الحل 0:00 72
4 السندات دو الحل 0:00 المحيط (درجة حرارة الغرفة)

الجدول 2: أوبال إعداد بروتوكول

الهدف ميكروغرام/مل استنساخ المصدر الكثير الأسهم ميكروغرام/مل مخفف ميليلتر AB ميليلتر
CD68 0.3 PG-M1 داكو 20043031 30 2376 24
ki67 0.61 MIB-1 داكو 20049476 46 2368.17 31.83
PD-L1 0.2 SP263 تنفيس. F09591 1.61 2101.86 298.14
1-شعبة المشتريات 0.52 D4W2J لجنة العلم والتكنولوجيا 1 100 2387.52 12.48 بوصة
CD8 0.7 SP239 نافذة 160318 70 2376 24
كورونا تشيكية 0.24 AE1/AE3 داكو 10129428 179.5 2396.79 3.21
مفتش المصحف 0.61
مفتش Rab 0.7

الجدول 3: إعداد الأجسام المضادة الأولية.

فلور أوبال شرائح تمييع مخفف ميليلتر ميليلتر أوبال فلور
أوبال 520 16 1: 200 2736.3 13.8
أوبال 540 16 1:700 2746.1 3.9
أوبال 570 16 1:150 2731.7 18.3
أوبال 620 16 1: 100 2722.5 27.5
أوبال 650 16 1:350 2742.1 7.9
أوبال 690 16 1:150 2731.7 18.3

الجدول 4: إعداد فلور أوبال.

مستند Word مواد تكميلية: اضغط هنا لتحميل هذا المستند.

الإضافي رقم 1: اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-

تكميلية الشكل 2: اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-

تكميلية الشكل 3: اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-

تكميلية الجدول 1: السندات إيكا RX أوبال متعدد البروتوكول. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

تكميلية الجدول 2: موجز ومقارنة متعدد كامل وإسقاط عناصر التحكم وعناصر التحكم الكامل ايستب. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ثورة العلاج المناعي السرطان الجارية هو فتح الرواية وواعدة الخيارات العلاجية ل مرضى السرطان13. التقدم المحرز في مجال علم الأورام المناعية سيتطلب زيادة المعرفة بالتهاب وورم المكروية، ليس فقط لفهم بيولوجيا الآليات المناعية التي تشارك في التسرطن ولكن أيضا للبحث عن المؤشرات الحيوية التنبؤية لجديد العلاجات المستندة إلى العلاج المناعي1،2. سبب بيولوجيا المناعة السرطان معقدة، استجواب عينات الأنسجة الورم مطلوب عادة لوضع قائمة متنامية من علامات المناعة التي تتفاعل مع بعضها البعض، وهي كثيرا ما كويكسبريسيد بالسكان خلية مختلفة في الأنسجة1 2، ،5. عادة ما تستخدم التجارب السريرية الخزعات الصغيرة، مثل إبرة الأساسية أو خزعات بالمنظار، التي يتم جمعها في نقاط مختلفة من العلاج لتقييم ورصد استجابة المريض. هذه الخزعات توفير كميات محدودة من الأنسجة، والذي بدوره يحد من عدد أقسام الأنسجة التي يمكن أن تستخدم لسرطان إيمونوبروفيلينج. هذا القيد مشقة خاصة عندما تستخدم التقنيات التقليدية، مثل معيار مونوبليكس المدينة،. ولذلك هناك واضحة الحاجة إلى أساليب جديدة لسرطان إيمونوبروفيلينج التي تجعل استخدام تقنيات تعدد الإرسال مع القدرة في نفس الوقت تقييم كوكسبريشن لمختلف المؤشرات الحيوية وجعل استخدام أكثر كفاءة لعينات الأنسجة قيمة.

في تلطيخ متعدد وأساليب التصوير المتعدد الأطياف ووصف بالتفصيل هنا، يستخدم فريق من القوة المتعددة الجنسيات للدراسات المناعية-علم الأورام في الأنسجة FFPE مثل خزعات من تجربة سريرية. هذا الأسلوب قد تم وصفه سابقا والتحقق من صحة، وتطبيقها بنجاح على سرطان إيمونوبروفيلينج8،،من910،11،،من1214، 15-البروتوكولات المنشورة سابقا وقد وصف مشابهة mIF تلطيخ أساليب مع النظم المستندة إلى إدارة أمن المواصلات، مثل مجموعة السبعة-لون، التي تستغرق وقتاً طويلاً ويتطلب حوالي 4 أيام العمل مختبر مخصص عالم12 ،15. ردا على أوجه القصور هذه، وقد تم تحسين هذا البروتوكول باستخدام الملطخ الآلي متاحة تجارياً، تقصير كبير تلطيخ الوقت إلى ح 14 والقضاء على التفاوت الأخذ بعوامل التشغيل اليدوي. ويجري تصوير على ماسح المتعدد الأطياف قادرة على فصل أطياف إشارات الفلورسنت سبعة أو أكثر في الشرائح المتعددة، بما في ذلك أوتوفلوريسسينسي، الذي يمكن إزالة كفاءة دون المهينة جودة الإشارة. يمكن إجراء نسخ متماثل هذا البروتوكول، وتعديل، ويقوم بها أي مستخدم المختبر مع إمكانية الوصول إلى الأدوات والمواد الكاشفة بالتفصيل في الجدول للمواد.

خطوات حاسمة في هذا البروتوكول هي الأقسام 7، 10، 11، 12. 7 قسم يتعلق بإعداد الكواشف. إعداد دقيق الكواشف لتلطيخ متعدد ضروري، التي تتطلب عناية مركزة عالمة المختبر أو فني لتجنب الاختلاف تتوقف على المشغل. على سبيل المثال، هي واحدة من القضايا الرئيسية مع أسلوب متعدد تلطيخ التقلبات المناخية، التي يمكن الحد من إعداد دقيق لتخفيف المواد الكاشفة، على وجه التحديد الأصباغ حساب السياحة الفرعي. الأبواب 10 و 11 ترتبط بالحصول على الصور. مخاطر هامة هو التعرض المفرط أو أوفيرساتوريشن من الصور، التي قد تؤدي إلى الطيفية التسييل، قطعة أثرية فيه الإشارة من قناة أخرى يتداخل مع القناة يجري تصويرها (انظر المواد التكميلية). تنظيم أوقات التعرض بعناية يمكن أن يساعد على منع أوفيرساتوريشن وتنزف الطيفية. ويجري اتقانا الطيفية في الباب 12. وهذا يعتمد على إعداد المكتبة الطيفية (الموصوفة في "متعدد المدينة المقايسة تطوير الدليل"، متاح على الإنترنت). البرنامج إبلاغ في هذه الخطوة، هو "تدريب" التعرف على وجه التحديد الألوان لصبغ كل حساب السياحة الفرعي. المكتبة الطيفية التي تم إنشاؤها باستخدام مقاطع من أنسجة تحكم، كلوزه البشرية، ملطخة بعلامة أعرب موحد، مثل CD20، مقترنة بكل صبغ السياحة الفردية على الشرائح المفردة. وبالإضافة إلى ذلك، يلزم الشرائح أوتوفلوريسسينسي (كما وصف في دليل التنمية المقايسة المدينة متعدد) لتدريب البرنامج إبلاغ الاعتراف وطرح أوتوفلوريسسينسي الأنسجة. ينبغي إعداد باستخدام عينات من الأنسجة ذاتها قيد الدراسة (مثل سرطان الرئة، إلخ) أوتوفلوريسسينسي التحكم الشرائح، تعامل بنفس الطريقة كالشرائح mIF والمحتضنة مع أضداد، الابتدائي والثانوي ولكن دون صبغ حساب السياحة الفرعي. يمكن تحديد فقط صورة طيفية أوتوفلوريسسينسي واحدة، ولذلك يجب الحرص على تحديد تمثيل أوتوفلوريسسينسي يمكن ملاحظتها التي قد تأتي من الكولاجين والتليف وخلايا الدم الحمراء، وأصباغ الذاتية ومصادر أخرى. إنشاء مكتبة طيفية جديدة في بداية كل مشروع جديد واستخدام طيف أوتوفلوريسسينسي وهو الممثل للعينات دراسة الأنسجة، فضلا عن تشغيل كتل الأنسجة نفسه كعنصر إيجابي لكل دفعة في إطار المشروع نفسه، هي قيمة الخطوات المنهجية التي سوف تساعد على تحسين الاتساق بين الأطياف اتقانا عبر عينات مختلفة ضمن نفس المشروع.

الأسلوب متعدد الموصوفة في هذا البروتوكول يوفر عدة أدوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، بما في ذلك مقيم إشارة إلى الضوضاء (أداة التهم) وإفلات عناصر التحكم (مواد تكميلية)، وطريقة عرض علم أمراض لمراقبة الجودة لتلطيخ. تساعد الأداة التهم لتقييم كثافة تلطيخ ومستوى الخلفية. إذا كانت كثافة و/أو مستويات الخلفية عالية، النهج الأول للحد من تخفيف صبغة حساب السياحة الفرعي. إذا استمرت المشكلة، ينبغي استعراض الشرائح المدينة اللونية المستخدمة للاستفادة المثلى من تلك علامة خاصة مع أخصائي، تبحث عن وجود خلفية. عرض أمراض تم إنشاؤه بواسطة البرنامج إبلاغ، استخدام تمثيل بسيودوكولور مثل ديامينوبينزيديني للأسفار من فلور المرتبطة بالسياحة، وكذلك تمثيل توضع فو المتولدة من جميع إشارات مضيئة، بما في ذلك DAPI . تساعد الصور من عرض علم الأمراض مع التقييم البصري لأنماط المصبوغة بأخصائي لتلطيخ محسنة. وينبغي استخدام هذه الأدوات دائماً أثناء الاستفادة المثلى من لوحة جديدة وخطوات مراقبة الجودة أثناء سير العمل المصبوغة.

يتطلب الأسلوب mIF استخدام الأجسام المضادة الأولية التي تم التحقق من صحتها والأمثل للمدينة اللونية القياسية على أنسجة الفورمالين--الثابتة بشكل صحيح. على سبيل المثال، هي واحدة من المزايا الرئيسية لأسلوب حساب السياحة الفرعي mIF توافقه مع استخدام الأجسام المضادة الأولية التي تم التحقق من صحتها والأمثل في مختبر علم الأمراض التشريحية للاستخدام السريري12. وهذه الميزة يعني أن الأفرقة المتعددة يمكن تخصيصه من قبل المستخدم مختبر للإجابة على أسئلة علم المناعة سرطان محدد دون الحاجة للأجسام المضادة بريكونجوجاتيد، توفير التنمية السريعة ودينامية في لوحة. وفي هذا الصدد، يبدأ سير العمل الفعلي للاستفادة المثلى من لوحة جديدة مع التحقق من الصحة والاستفادة المثلى من الأجسام المضادة مع معيار المدينة اللونية، تبحث عن تمييع أفضل وتلطيخ الظروف التي ستوفر نظيفة ومتسقة تلوين. والخطوة التالية، باستخدام تخفيف نفس الأمثل للمدينة، هو نقل تلطيخ باستخدام حساب السياحة الفرعي فلورس بدلاً من ديامينوبينزيديني ومقارنة نتائج مونوبليكس إيمونوفلوريسسينت حساب السياحة الفرعي بالمدينة اللونية كمرجع. أخيرا، يمكن دمج الأضداد في تلطيخ mIF، دائماً استخدام المدينة اللونية تلطيخ نمط كمرجع عنصر تحكم لضبط القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات تسا المصبوغة المعلمات، أساسا تخفيف الصبغ حساب السياحة الفرعي وتسلسل المصبوغة. أثناء هذه العملية، يتم التعاون مع أخصائي مفيدة لتقييم نوعية تلطيخ.

وتشمل القيود المفروضة على هذا الأسلوب الوقت والجهد المطلوب للتحسين والتحقق لوحات جديدة وتحليل إيمونوفينوتيبينج لوحات القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات. ومع ذلك، هو الشاغل الرئيسي، التحقق السليم من أساليب القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات. عدم التحقق من صحة هذه التقنيات السليمة ينطوي على خطر توليد نتائج غير صالح، الذي يمكن إضافة بيانات مربكة للأدب، مما يعوق محاولات للتوصل إلى فهم أفضل لبيولوجيا السرطان علم المناعة16. أنها، لذلك، يتعين على المحقق على بذل كل جهد للتحقق من صحة بشكل صحيح أساليب متعددة، بما في ذلك ضمان مشاركة وثيقة، والتقييم من قبل أخصائيي علم الأمراض مع التدريب والخبرة في التحقق من صحة والتقييم للأنسجة الأنسجة والتقنيات المستندة إلى المدينة17،18،،من1920. يشمل البروتوكول المعروضة هنا بعض الأدوات التي يمكن أن تساعد في التحقق من فريق متعدد جديد، بما في ذلك تقييم الأمراض الشرائح ح & ه قبل تلطيخ وتحليل والاستخدام للمدينة اللونية كمرجع لتحسين القوة المتعددة الجنسيات حساب السياحة الفرعي تلطيخ، أسلوب التحكم الإفلات لمراقبة الجودة من جديد متعدد الفريق، واستخدام ايستب، أوتوفلوريسسينسي، وإسقاط عناصر التحكم. على الرغم من التعقيد التقني لأساليب القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات، تقنيات مثل التصوير المتعدد الأطياف مع الطيفية اتقانا، فضلا عن غيرها من المنابر المتعددة الرواية، يتم فتح حقبة جديدة لتحليل عينات الأنسجة من المرضى وتوليد أشكال جديدة البيانات التي لا يمكن مع معيار المدينة وحدها. ولذلك، تطوير وتطبيق تقنيات القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات ستواصل النمو، أصبحت أدوات قوية إيمونوبروفيلينج السرطان من الخزعات للتجارب السريرية، والمساعدة على تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية مولتيباراميتريك جديدة للعلاج المناعي، وتستفيد، قبل كل شيء، مريض السرطان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وأيد هذا العمل ميديموني، والبيولوجي العالمي R & د ذراع استرا زينيكا. C.W. والقازاقي C.C.H. هي موظفا "بيركن المر"، التي تنتج الكواشف (مجموعة حساب السياحة الفرعي) والماسحات الضوئية متعددة الأطياف التي استخدمت في هذا العمل. م. س.، ك. د، ه، W.Z.، باجنال جيم، جيم براون، كيركراده، أ. ل.، ك. س.، ومحمد، و J.R.C. من العاملين ميديموني مع امتلاك الأسهم و/أو مصالح الأسهم أو الخيارات في استرا زينيكا.

Acknowledgments

قدم الدعم التحريري شومان ديبورا من ميديموني.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
"InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis PerkinElmer CLS151066 Called "spectral unmixing software" in text
"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing PerkinElmer CLS151067 Called "QPTIFF software" in text
#1.5 Coverslips Sigma Aldrich 2975246
200 Proof Ethanol Koptec V1001
20x Tris-Buffered Saline VWR J640-4L
Antibody Diluent DAKO S2203
Anti-CD68 Mouse Monoclonal DAKO M087601-2 Clone PG-M1
Anti-CD8 Rabbit Monoclonal Ventana M5392 Clone SP239
Anti-CK Mouse Monoclonal DAKO M351501-2 Clone AE1/AE3
Anti-ki67 Mouse Monoclonal DAKO M724001-2 Clone MIB-1
Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal Cell Signaling #86163 Clone D4W2J
Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal Ventana 790-4905 Clone SP263
Bond Dewax Solution Leica AR9222 Called "dewax solution" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 1 Leica AR9961 Called "ER1" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 2 Leica AR9640 Called "ER2" in text
Bond Open Containers, 30 mL Leica OP309700 Called "30 mL open containers" in text
Bond Open Containers, 7 mL Leica OP79193 Called "7 mL open containers" in text
Bond Polymer Refine Detection Leica DS9800 Called "chromogenic detection kit" in text
Bond Research Detection Kit Leica DS9455 Called "research detection kit" in text
Bond Titration Kit Leica OPT9049 Called "titration kit" in text
Bond Universal Covertile Novocastra Leica S21.2001 Called "covertiles" in text
Bond Wash Solution 10X Concentrate Leica AR9590 Called "10x wash solution" in text
BondRX Autostainer Leica Called "automated stainer" in text
BondRX Software Version 5.2.1.204 Leica Called "automated stainer software" in text
Opal 7-Color Automation IHC Kit PerkinElmer NEL801001KT Called "multispectral staining kit" in text
Peroxidase Block Leica RE7101
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo P36965 Called "slide mountant" in text
Starfrost Slides Fisher 15-183-51
Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control PerkinElmer CLS143455 Called "microscope control software" in text

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
  2. Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
  3. Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
  4. Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
  5. Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
  6. Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
  7. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  8. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  9. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
  10. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
  11. Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
  12. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  13. Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
  14. Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
  15. Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
  16. Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
  17. Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
  18. Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).
  19. Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
  20. Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).

Tags

أبحاث السرطان، 143 قضية، الفلورة متعدد، التصوير المتعدد الأطياف، إيمونوهيستوتشيميستري، والأورام المناعية، إيمونوبروفيلينج، وسرطان الرئة
لوحة الفلورة تعدد الإرسال الآلي للدراسات المناعية-علم الأورام في عينات الأنسجة الكبدية الفورمالين--ثابت
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Surace, M., DaCosta, K., Huntley,… More

Surace, M., DaCosta, K., Huntley, A., Zhao, W., Bagnall, C., Brown, C., Wang, C., Roman, K., Cann, J., Lewis, A., Steele, K., Rebelatto, M., Parra, E. R., Hoyt, C. C., Rodriguez-Canales, J. Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens. J. Vis. Exp. (143), e58390, doi:10.3791/58390 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter