Summary
Een gedetailleerd protocol voor een zes-marker multiplex immunofluorescentie paneel is geoptimaliseerd en uitgevoerd, met behulp van een geautomatiseerde stainer voor meer consistente resultaten en een kortere tijd van de procedure. Deze aanpak kan direct worden aangepast door elk laboratorium voor immuno-oncologie studies.
Abstract
Verdere ontwikkelingen in immuno-oncologie vereisen een toegenomen inzicht in de mechanismen van kanker immunologie. De immunoprofiling analyse van weefselmonsters van Biopten van formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) is een belangrijk instrument voor inzicht in de complexiteit van de Tumorimmunologie en ontdekken van nieuwe voorspellende biomarkers voor kanker immunotherapie geworden. Immunoprofiling analyse van weefsels vereist de evaluatie van gecombineerde markers, met inbegrip van inflammatoire cel subpopulaties en immuun controleposten, in de communicatie van de tumor. De komst van de nieuwe multiplex immunohistochemische methoden zorgt voor een efficiënter multiparametric analyse van enkele weefselsecties dan standaard monoplex immunohistochemistry (IHC). Een commercieel beschikbare multiplex immunofluorescentie zorgt (IF) methode is gebaseerd op tyramide-signaal versterking en, in combinatie met multispectrale microscopische analyse, voor een betere scheiding van het signaal van uiteenlopende markers in weefsel. Deze methodologie is compatibel met het gebruik van unconjugated primaire antilichamen die zijn geoptimaliseerd voor standaard IHC op FFPE weefselmonsters. Hierin beschrijven we in detail een geautomatiseerde protocol waarmee multiplex als etikettering van weefselmonsters carcinoom met een zes-marker multiplex antilichaam panel bestaande uit PD-L1, PD-1, CD68 CD8, Ki-67 en AE1/AE3 Cytokeratines met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole Als een nucleaire cel counterstain. Het protocol multiplex deelvenster wordt in een geautomatiseerde IHC stainer geoptimaliseerd voor een kleuring tijd die korter is dan die van de handmatige protocol en kan worden direct toegepast en aangepast door elk laboratorium-Detective voor immuno-oncologie studies over menselijke FFPE weefselmonsters. Ook beschreven zijn verschillende controles en instrumenten, met inbegrip van een drop-control methode voor fijne controle van de kwaliteit van een nieuwe multiplex als panel, die nuttig voor de optimalisatie en validatie van de techniek zijn.
Introduction
Immunoprofiling analyse van FFPE tumor weefselsteekproeven uitgegroeid tot een essentieel onderdeel van immuno-oncologie studies, met name voor de detectie en validatie van nieuwe voorspellende biomarkers voor kanker immunotherapie in het kader van klinische proeven1 ,2. Chromogenic IHC, met behulp van chemische chromogens zoals diaminobenzidine, blijft de standaard techniek in diagnostische pathologie voor de immunolabeling van de biopsie weefsel3. Standaard IHC kan ook worden gebruikt voor kanker weefsel immunoprofiling, met inbegrip van de kwantificatie van de subpopulaties van tumor-geassocieerde lymfocyten en de beoordeling van de niveaus van de expressie van immuun checkpoints zoals geprogrammeerde cel dood ligand 1 (PD-L1)4 ,5. Standaard IHC is echter beperkt, in die slechts één antigeen kan worden gelabeld per weefselsectie. Omdat immunoprofiling studies vergen doorgaans de analyse van de gecombineerde uitdrukking van verschillende markeringen, het gebruik van standaard IHC zou vereisen de kleuring van meerdere weefselsecties, elk gekleurd met een enkele gegevensmarkering, en daarom zou aanzienlijk beperkt voor de analyse van kleine weefselsteekproeven zoals kern naald biopsieën. IHC standaardmethoden zijn ook beperkt zijn voor de beoordeling van de markeringen die zijn coexpressed door diverse cel populaties, zoals gebruikelijk is bij immuun checkpoint markeringen zoals PD-L1, die wordt uitgedrukt door zowel de kankercellen als de tumor-geassocieerde macrofagen. Deze beperking is gemeld in, bijvoorbeeld, het gebruik van standaard monoplex IHC door pathologen voor de kwantitatieve analyse van een marker van de IHC uitgedrukt door diverse cel typen6. De ontwikkeling van een multiplex chromogenic IHC technieken met divers gekleurde chromogens op de dezelfde weefsel sectie vertegenwoordigt een vooruitgang over de IHC monoplex standaardmethode,7 hoewel ze blijven beperkt door de immunolabeling van slechts een paar Markeringen en ook een belangrijke technische uitdaging voor de juiste beoordeling van markeringen uitgedrukt in de dezelfde subcellular compartimenten van de dezelfde cel populaties aanwezig.
De voornoemde beperkingen met betrekking tot de beschikbaarheid van het weefsel van klinische monsters, evenals de beperkingen van multiplex chromogenic IHC technieken, hebben aanleiding gegeven tot de noodzaak tot het ontwikkelen van verbeterde multiplex methoden voor immuno-oncologie studies op basis van fluorescerende labeling gecombineerd met beeldvormende systemen die effectief de signalen van meerdere fluorophores van de dezelfde dia scheiden kunnen. Een dergelijke techniek is gebaseerd op tyramide signaal versterking (TSA) in combinatie met multispectrale microscopie imaging voor efficiënte kleur scheiding8. Een commercieel beschikbare TSA gebaseerde kit maakt gebruik van fluorophores geoptimaliseerd voor multispectrale imaging8 (Zie Tabel van materialen). Een cruciaal voordeel van dit systeem is de verenigbaarheid ervan met de dezelfde labelloze primaire antilichamen die reeds zijn gevalideerd en geoptimaliseerd voor standaard chromogenic IHC9,10,11. Hierdoor niet alleen sneller optimalisatie, maar ook flexibiliteit in de optimalisatie en paneel wijzigingen opnemen van nieuwe doelen. Bovendien, de methode van de TSA multiplex immunofluorescentie (mIF) kan worden geoptimaliseerd voor commercieel beschikbare geautomatiseerde IHC stainer systemen, waardoor voor een eenvoudige overdracht van monoplex chromogenic IHC aan mIF.
Hier presenteren we een protocol voor een mIF paneel voor immuno-oncologie-studies die is gebaseerd op mIF TSA kleuring geautomatiseerde en een multispectrale scanner voor imaging gebruikt. Dit protocol kan worden aangepast of gewijzigd door elk laboratorium gebruiker met toegang tot de beschreven instrumentatie en reagentia. Het protocol bevat een panel van zes primaire antilichamen voor de immunoprofiling van carcinomen: PD-L1, PD-1, CD68 (als een pan-macrofaag marker), CD8 (cytotoxische T cellen), Ki-67, en AE1/AE3 (pan-cytokeratin, gebruikt als een epitheliale merker voor de identificatie van carcinoom cellen). Een recente studie beschrijft de optimalisatie van een handmatige TSA mIF protocol met behulp van chromogenic IHC als standaard referentie voor het valideren van de multiplex12kleuring. De bijgewerkte methode hier gepresenteerd is ontwikkeld met behulp van een commercieel beschikbaar, zeven-kleur TSA kit geoptimaliseerd in een geautomatiseerd brandschilderen, drastisch verkorten van de kleuring tijd van 3 – 5 dagen tot 14 h, terwijl ook het verbeteren van de consistentie van de kleuring. Naast het gedetailleerde belangrijkste protocol hier gepresenteerd, bevat een sectie Aanvullende materialen de "drop-control"-methode, een extra kwaliteitscontrole proces te evalueren van een nieuw mIF deelvenster, evenals technische notities voor de optimalisatie, probleemoplossing en ontwikkeling van nieuwe multiplex panelen om de laboratorium-gebruiker instellen en optimaliseren van de mIF TSA methode voor aangepaste mIF panelen te helpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Het protocol gepresenteerd hier wordt beschreven hoe u immunoprofiling voor een mIF panel met behulp van TSA voor zes antilichamen (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 en AE1/AE3) op een geautomatiseerde stainer (Zie Tabel van materialen). Het protocol wordt ook beschreven hoe uit te voeren van de daling van de besturingselementen voor een controle van de kwaliteit van een nieuwe mIF paneel (Zie Aanvullende materialen). In dit protocol, kleuring gebeurt met acht onbevlekt FFPE glijbanen van menselijke tonsillen (positieve controle) en acht onbevlekt dia's uit menselijke longen adenocarcinoom. De eerste dia wordt gebruikt voor volledige multiplex kleuring met alle zes markeringen, de tweede dia voor de controle van de isotype waarin geen primaire antilichamen worden gebruikt en de resterende zes dia's voor de besturingselementen van de daling (Zie Aanvullende materialen). Een extra controle voor weefsel autofluorescence wordt sterk aanbevolen en moet altijd worden opgenomen in een multiplex studie (Zie Aanvullende materialen). Onderzoekers kunnen echter gebruikmaken van andere tumor typen en de besturingselementen volgens hun eigen doelen van het project. Laboratorium gebruikers zonder eerdere ervaring met de mIF TSA methode en technieken van multispectrale scanner moeten lezen de Multiplex gids van de ontwikkeling van de IHC (beschikbaar online op http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Hoewel deze handleiding een handmatige protocol beschrijft, biedt het ook een goede introductie tot de mIF kleuring methode. Alle weefselsecties werkzaam in dit protocol werden geanonimiseerd en goedgekeurd volgens de verklaring van Helsinki.
1. de weefselmonsters
- Selecteer een FFPE menselijke tonsillen monster met lymfoïde hyperplasie moet worden gebruikt als positieve controle en een FFPE menselijke longen adenocarcinoom monster waarvan bekend is dat PD-L1 positief. Bespreek de haematoxyline en eosine (H & E) dia's van de geselecteerde long kanker blokken ter bevestiging van de aanwezigheid van een tumor. Het is belangrijk te voorkomen dat tumoren met overvloedige gebieden van necrose als dit aspecifieke achtergrondkleuring verhogen kan.
Opmerking: Voor deze optimalisatie, Vermijd het gebruik van paraffineblokken die zijn opgeslagen voor 10 jaar of meer en weefsel met een gedroogde verschijning in het blok van paraffine (consult met een technicus van de histologie). - Gebruikend microtome, 10 opeenvolgende seriële secties van elk blok, 4 µm dik gesneden. De secties op een positief geladen glasplaatje gebruikt voor IHC, één sectie per dia koppelen.
Opmerking: Secties moeten worden gemonteerd perfect plat zonder rimpels, als rimpels kleuring artefacten kunnen genereren. De dia's nummeren van de seriële secties vanaf 1 tot en met 10. - Voorbereiden van een nieuwe H & E dia op de eerste sectie. Bekijk de H & E dia met behulp van een patholoog ter bevestiging van de aanwezigheid van tonsillen weefsel of Long tumor nog in het blok.
Opmerking: Deze H & E dia kan helpen, later met de selectie van de regio's van belang voor de multispectrale analyse en fenotypering. - Opslag onbevlekt secties in een kunststof dia doos bij 4 ° C voor maximaal drie maanden.
2. het creëren van een nieuwe mIF Staining programma op een geautomatiseerd Stainer: registratie van de reagentia
Opmerking: Reagentia moeten worden toegevoegd aan de lijst van de reagens in de geautomatiseerde stainer software voordat ze beschikbaar voor gebruik in protocollen zijn. Zie de Tabel van materialen voor informatie over de geautomatiseerde stainer model en software-versie.
- Klik op het tabblad van de reagentia binnen de geautomatiseerde stainer software. Klik op toevoegen aan te wijzen van een nieuwe reagens. Voer de naam (bijvoorbeeld "520 TSA reagens") en de afgekorte naam (bijvoorbeeld "520 TSA"), overwegende dat er is een maximum van acht tekens. Selecteer aanvullende uit de drop-down menu en stel de leverancier. Wijzig niet Enkel/dubbel vlek uit Één/opeenvolgend DS. De kleuring van protocol bij Protocol Fstandaardwaarde instellen. Stel het standaardprotocol voor HIER op ER1 20.
- Sla het nieuwe reagens en herhaal stap 2.1 voor alle reagentia vermeld in tabel 1.
3. geautomatiseerde Stainer: Registratie van de Containers
- Schrijf de naam van het reagens te gebruiken aan de zijkant van elke container. Scan de barcode op de kant. Selecteer in het pop-upvenster, het juiste reagens in de lijst. Selecteer een vervaldatum en sla.
- Herhaal de procedure in stap 3.1 voor alle reagentia vermeld in tabel 1.
- Registreer de Open onderzoek Kit. Scannen van beide barcodes aan de zijkant van de kit en volg de aanwijzingen op het scherm. Naam van de kit "Multiplex Research Kit 1." Registreren van de 1 x tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)-gebufferde zoutoplossing als onderdeel van deze kit (tabel 1).
4. geautomatiseerde Stainer: Oprichting van een mIF Protocol programma
- Het basis protocol van multiplex is voorgeladen met de naam Opaal 7 Multiplex op nieuwe geautomatiseerde stainers (Zie de versie van het model en software in de Tabel van de materialen). Zoek het protocol met een filter op "all" in plaats van "voorkeur" op het scherm van het protocol. Als het basis protocol niet aanwezig is, dan uw geautomatiseerde stainer-software bijwerken met de hulp van de fabrikant.
- Alle wijzigingen moeten worden uitgevoerd op de exemplaren van het oorspronkelijke protocol. Voordat u wijzigingen aanbrengt, sla het origineel en een kopie maken door te klikken op het tabblad protocollen , vervolgens met de rechtermuisknop op het protocol van Opal 7 Multiplex en exemplaarte selecteren.
- Wijzig de naam 7 Multiplex protocol 1 in het nieuwe venster en selecteer het tabblad geassocieerd met het juiste apparaat (vloer model of benchtop). Overeenkomen met het protocol in de Aanvullende tabel S1. Klik op Toevoegen reagens toe te voegen een 10 min peroxidase remming stap (die geen deel uitmaakt van het standaardprotocol) en selecteer het peroxidase-remmer als het reagens.
- Bevestigen dat de blokkerende stappen een buffer met blokkerend PKI gebruiken. Ervoor zorgen dat elke primair antilichaam verwijst naar de geschikt reagens, dat secundair antilichaam stappen gebruiken een HRP-polymeer, en dat spectrale 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) voorzien van de kit multispectrale automatisering wordt gebruikt. Bevestig alle keuzes door het controleren van het reagens die bestemd zijn voor elke respectieve stap in het drop-down menu op het scherm van het protocol.
5. geautomatiseerde Stainer: Toevoeging van Drop besturingselementen en Isotype Control Protocol
- Kopieer de naam 7 Multiplex protocol 1 en wijzig het 7 MultiplexProtocol 1 CD68 DROP. Het reagens CD68 antilichaam Verander Muis IgG en sla het protocol.
- Zes meer nieuwe protocollen, één voor elk besturingselement drop en één voor de controle van de volledige isotype (het veranderen van alle antilichamen aan de juiste isotypes) op dezelfde manier maken
6. automatische Stainer: Dia voorbereiding Protocol
- Kopieer het prestaining protocol * bak en Dewax en de naam van dit protocol multispectrale bak en Dewax 2 h.
- Aanpassen van het protocol zodat deze overeenkomen met de in tabel 2aangegeven reagentia. Bak-dia's gedurende 2 uur bij 60 ° C. Dewax voor 30 s bij 72 ° C.
7. automatische Stainer: Voorbereiding van de reagentia
- Één onderzoek detectie kit voor te bereiden. Een reagens moet permanent gekoppeld aan deze kit, zodat de vulling de 30 mL open container gemarkeerd voor 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 1 x TBS en zoek dit in positie 1 (het verst van het handvat) in het onderzoek detectie kit aangewezen Multiplex Research Kit 1. dit reagens wordt permanent gekoppeld dit onderzoek kit en moet niet veranderen van positie voor toekomstig gebruik.
- Label twee 30 mL open containers Multispectrale blok en Multispectrale secundaire. Vul de container Multispectrale blok met 30 mL van blokkerende buffer/antilichaam verdunningsmiddel uit de multispectrale kleuring kit. Vul de Multispectrale secundaire container met 30 mL anti-mouse/anti-rabbit secundair antilichaam polymeer uit de multispectrale kleuring kit.
- Tien 7 mL open containers voor te bereiden. Het vereiste volume in microliters is 600 + (150 x [aantal dia's]). Elke antilichaam zal worden toegepast op 12 dia's in dit geval (zes tonsillen en zes longkanker). De etikettering en de volumes voor alle containers zijn aangegeven in tabel 3.
- Voor elke antilichaam buis, eerst toevoegen het antilichaam verdunningsmiddel, gevolgd door de geconcentreerde primair antilichaam in de volumes aangegeven in tabel 3. Meng door zachte pipetteren.
- Een open container van 7 mL voorbereiden DAPI, met behulp van vier druppels DAPI concentraat per milliliter van tweemaal gedestilleerd water; een totaal van 16 zal worden gekleurd met de DAPI (600 + [150 x 16] = 3.000 µL). Voeg 3 mL tweemaal gedestilleerd water plus 12 druppels spectrale DAPI in de container. Bereiden van verse DAPI voor elke run.
- Een open container van 7 mL voorbereiden peroxidase-remmer. Alle 16 dia's zullen worden behandeld met peroxidase-remmer (600 + [150 x 16] = 3.000 µL). Voeg 3 mL van peroxidase blok in de container.
- Resuspendeer voordat u voorbereidt werken concentraties van fluors, alle gelyofiliseerd fluors door 75 µL van dimethylsulfoxide toe te voegen aan elke fluor buis geleverd door de fabrikant. Meng door pipetteren. Dit is de TSA fluor voorraad. Bewaren bij 4 ° C.
- Zes titratie containers, één voor elke fluor voor te bereiden. Het vereiste volume in microliters is 350 + (150 x [aantal dia's]). Elke fluor zal worden toegepast op 16 dia's in dit geval (acht tonsillen en acht longkanker). De etikettering en de volumes voor alle containers zijn aangegeven in tabel 4.
- Wanneer alle reagentia zijn geregistreerd en bereid, plaatst u elke container op elke locatie op een rek en laden alle reagentia op de geautomatiseerde stainer. De sonde zal het volume van elk reagens bevestigen.
8. geautomatiseerde Stainer: Proeven van Setup en multispectrale kleuring
-
In de geautomatiseerde stainer software, klikt u op Slide Setup bij de bovenkant van het scherm. Klik op Add studie. Vullen van het pop-upvenster met de studie ID, naam van de studie en commentaar.
- Selecteer de naam van de onderzoeker voert de kleuring uitvoeren vanaf de drop-down lijst. Laat het Doseer volume op 150 µL. Selecteer multispectrale Dewax voor voorbereiding Protocol. Klik op OK en dia toevoegen. Typ onder opmerkingen"Multiplex 1 Long 123ABC." De volgende velden in te vullen zoals aangegeven: Weefseltype = Test weefsel; Doseer volume = 150 µL; Staining modus = Single, Routine; Marker = negatief; Kleuring = Typ "7 Multiplex Protocol 1"; Voorbereiding = multispectrale Bake, Dewax 2 h; Here = HIER 20 min met ER1.
- Klik op de dia toevoegen en wijzigen van de opmerkingen en het protocol bij de daling van de controle-dia's en isotype controle dia toevoegen. Wanneer alle dia's zijn toegevoegd aan de studie, sluit het venster Add dia en etiketten afdrukken. Toepassing van de etiketten op het gebied van de geschikte etiket op elke dia.
- Laden van de dia's in de rekken, cover tegels in de juiste stand van de toepassing, de rekken in de geautomatiseerde stainer invoegen en verlagen de schaaltjes. Het apparaat scant de dia-labels.
- Wanneer alle dia's en reagentia zijn gescand en gemeten. De stormloop knop (►) zal actief worden. Als de autostainer eventuele fouten, zoals onvoldoende reagens volume detecteert, weergegeven een geel waarschuwingssymbool door de desbetreffende lade. Als een fout optreedt, klik met de rechtermuisknop het waarschuwingssymbool en verhelpen van de fout.
- Initiëren kleuring onmiddellijk of een vertraagde begin instellen. Het protocol is ongeveer 14 h in duur. Opmerking: Controleer dat het protocol voltooit op een moment wanneer de dia's kunnen worden onmiddellijk verwijderd zoals exess wassen kleuring resultaten kon beïnvloeden.
9. Coverslipping van de multispectrale dia 's
- De dia's te verwijderen uit de geautomatiseerde stainer en bewaar ze in een rek ondergedompeld in 1 x eetlepels
- Monteer de monsters met no. 1.5 coverslips en 15 µL van de media van de montage (Zie Tabel van materialen). Alle bubbels verwijderen door op het dekglaasje aan met een uiteinde van de pipet zachtjes te drukken.
- Laat de dia's te genezen overnachten bij kamertemperatuur op de laboratorium-Bank. Niet-uitgeharde dia's kunnen onmiddellijk worden gescand met zorgvuldige omgang.
10. multispectrale Scanner
- Zet de multispectrale scanner en de computer (Zie Tabel van materialen voor model-en software). Start de software van de controle van de Microscoop. Open de voordeur van de multispectrale scanner door te drukken op de touch-sensitive knoop aan de voorkant van het apparaat. Elke Openspringende vervoerder in de scanner bevat vier dia's. Laden van alle dia's in de vervoerders en de volgorde opnemen voordat de vervoerders in het apparaat laden.
- Selecteer Bewerken Protocol en klikt u op Nieuw...; Maak vervolgens de protocolnaam Multiplex paneel 1 en Drop besturingselementen. De studie naam Multiplex Panel ontwikkelinghebt gemaakt en klik op Maken Protocoltypt Overzicht scannen Filter DAPI; Selecteer vervolgens Hele dia scannen en pixelresolutie 0,50 µm (20 X). Alle filters en banden moeten worden vertegenwoordigd. Als dat niet het geval is, klikt u op Filters bewerken en Bands, alle vijf filters (DAPI, FITC CY3, Texas Red en CY5) selecteren en klik vervolgens op Bewerken posities.
- De allesdrager door het selecteren van de vervoerder met de volledige multiplex van adenocarcinoom van de Long. Selecteer de juiste dia met behulp van de grafische gebruikersinterface. Het weefsel focus handmatig of met behulp van de autofocus. Navigeer naar elk willekeurig deel met aanvaardbare DAPI kleuring en klik op Auto-bloot om de blootstelling in milliseconden (0 – 2.000 ms).
- Herhaal de procedure voor alle vijf filter sets in zowel de hele scannen en MSI regio kolommen. Zorg om te navigeren naar een gebied met aanvaardbare kleuring en heroriëntatie van de Microscoop vóór de blootstelling voor elk filter en vergroting niveau te kunnen vaststellen. Auto-bloot voor alle vijf filters in een 20 x totale scan en 20 x multispectrale beelden (MSI) multispectrale regio's. Selecteer een pixelresolutie van 0,50 µm (20 x). Sla het protocol en klikt u op terug om terug te keren naar het beginscherm van de Vectra software; Klik vervolgens op Dia's scannen.
- Openen van de interface voor elke dia en taak ingesteld op het scannen. Studie aan Multiplex Panel ontwikkeling, ingesteld Protocol Multiplex paneel 1en Drop besturingselementen, en Dia-ID aan Multiplex Lung ABC123, Multiplex CD68 Drop Lung ABC123, enz . Wanneer alle dia's hebben het label en taken zijn ingesteld, klikt u op scannen. De geautomatiseerde multispectrale scanner zal het uitvoeren van volledige-dia scans van alle dia's met behulp van alle vijf filters.
11. multispectrale Scanner: Multispectrale Imaging
- Als de scans voltooid zijn, opent u de QPTIFF -software ("Phenochart") en klik op Load dia in de linkerbovenhoek. Hiermee opent u een QPTIFF, die is een vijf-filter geheel-dia scan. Elke laag bevat gegevens uit meer dan één fluor, dus het hulpprogramma beperkt is, maar de weefsel structuur en brede expressiepatronen zijn duidelijk en kunnen worden gebruikt voor het selecteren van regio's voor MSI.
- Navigeer naar en openen de juiste dia in de studie met behulp van de drop-down boom aan de linkerkant. Log in (rechtsboven) met de initialen van de gebruiker.
- Vijf regio's voor MSI met behulp van het gereedschap stempel op de bovenkant van het scherm selecteren Raadpleeg een patholoog als die beschikbaar is. Selecteer onder Selecteer voor, acquisitie; Selecteer onder grootte in velden, 1 x 1; en selecteer onder veld-beperking, 0,5 µm (20 x). Gebaseerd op cytokeratin (CK) kleuring (voornamelijk in Cy5), Selecteer verschillende regio's met zowel de tumor (CK +) en de stroma (CK-) aan het image van de algehele scan worden gemaakt. Herhaal deze procedure voor elke dia.
- Zodra alle MSIs zijn geselecteerd, sluit het Phenochart software en terugkeren naar de Vectra -software. Wijzigen van de taak van het scannen naar MSI voor elke dia en klik vervolgens op scannen om opnieuw uit te voeren van de MSI-collectie.
12. spectrale randverwijdering
Opmerking: De spectrale unmixing stap is vereist voor Zenderscheiding en beeldanalyse van de dia's. Voordat de spectrale randverwijdering wordt uitgevoerd in de inForm-software, moet de spectrale bibliotheek worden gebouwd met behulp van longkanker adenocarcinoom dia's gekleurd met elk fluor alleen en met DAPI alleen. Deze procedure wordt ook beschreven in het bovengenoemde Multiplex IHC Assay gids van de ontwikkeling.
- Wanneer de verwerving van MSI voltooid is, gebruik van de spectrale unmixing ("InForm") software om bestanden te openen in de map MSI . Deze bestanden eindigen in de .im3 bestandstype extensie.
- Selecteer onder beeldformaat, Multispectral; Selecteer onder Sample-formaat, fluorescentie; en schakel onder spectrale bibliotheek bron, InForm.
- Als fluors, selecteert u en alle zes fluors en DAPI laden vanuit de bibliotheek gebouwd met de Long adenocarcinoom bibliotheek glijbanen. Klik op Alle bereiden (linksonder). Spectrale unmixing software zal het uitvoeren van spectrale randverwijdering op alle geopende afbeeldingen, met behulp van de meegeleverde spectrale profielen.
- Met een patholoog, beoordelen de kleuring patroon tegen chromogenic enkele vlekken van hetzelfde doel in opeenvolgende dia's van de dezelfde weefsel.
13. evaluatie van de intensiteit van de fluorescentie en signaal demping
Opmerking: Het hulpmiddel van de graven, die wordt weergegeven als een pijl met een kleine bruine doos, is het belangrijkste instrument voor de optimalisatie van de multiplex en moeten vaak worden gebruikt (Zie Aanvullende materialen). Hulpprogramma voor het graven in de spectrale unmixing software, beoordelen de signal-to-noise verhouding, die minimaal moet meer bedragen dan 10:1 (Zie Aanvullende materialen voor het oplossen van problemen en voor de evaluatie van de multiplex kleuring met de daling van de controles).
- 13.1. met een afbeelding geopend in de spectrale unmixing software, gaan de graven tool en enquête beelden te beoordelen van de intensiteit van de fluorescentie van elk kanaal. De intensiteit van de doelgroep in longweefsel is tussen 10 en 20 genormaliseerde graven. De genormaliseerde graven tool is afgebeeld in Figuur 1.
- Dia's met maximaal signaal graven van minder dan 10 of normale signaal gebied graven van minder dan vijf voor elke hoofdstukmarkering uitsluiten zodat autofluorescence en uit-target vlekken niet met het authentieke signaal concurreren.
- Uitsluiten dia's met maximum telt meer dan 30 voor elk kanaal om te voorkomen dat de spectrale bloeden of inefficiënte spectrale randverwijdering.
- Adres hoog of laag genormaliseerd graven door de TSA concentratie aan te passen.
14. multispectrale beeldanalyse
- Open een of meer MSI in de spectrale unmixing software en alleen Selecteer fluors voor randverwijdering die zijn vertegenwoordigd in ten minste één afbeelding openen. Klik op Alle bereiden om unmix alle geopende kleurenafbeeldingen om spectraal ongemengde beelden opleveren.
- Selecteer het gereedschap graven graven enquête over elk beeld door zweefde over het (de) gebied(en) van belang.
- Selecteer het pictogram van het oog om de weergave-editor te openen. Selecteer en pas de intensiteit van de weergave van elk onafhankelijk kanaal.
- Selecteert u configureren om te openen de weefsel segmentatie, cel segmentatie fenotypering en scoren modules. Deze hulpprogramma's zijn nodig voor de objectieve validatie van multiplex kleuring tegen chromogenic enkele vlekken en kunnen worden gebruikt voor het genereren van gegevens van de kwantitatieve phenoptic (Figuur S1).
- Gebruik het tabblad exporteren te slaan grijswaarden, TL, pathview-stijl ongecomprimeerde TIFF- en gegevensbestanden van de phenoptic analyse modules voor verdere analyse, archivering en presentaties (Figuur S1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol hier beschreven zal produceren resultaten zoals aangegeven in Figuur 2. Beginnen met een evaluatie van de kleuring in het besturingselement van de tonsillen, beginnend met de oppervlakte squamous cell epitheel. De histologie van het monster van de tonsillen kan worden herzien met een patholoog, met de H & E dia als referentie. Als chromogenic IHC secties worden uitgevoerd met de dezelfde markers op hetzelfde weefsel blok, kunnen dan deze worden gebruikt ter bevestiging van de dichtheid en de distributie van iedere markeerdraad op de dia mIF. Zoals blijkt uit Figuur 2A, het weefsel van de tonsillen dienen duidelijk omschreven AE1/AE3 cytokeratin vlekken in de tonsillen oppervlakte squamous epitheel (Figuur 2A; aangeduid als rode kleurcorrectie), zonder achtergrond in de lymfoïde weefsel. De kleuring moet cytoplasmatische, af en toe met membraan accentuering, en de kernen moet negatief zijn. De reticulated epitheel in de cryptes moet positief zijn voor zowel de Cytokeratines (rood) en de PD-L1 (Figuur 2; groene kleurcorrectie). De folliculaire germinal centra van de tonsillen moeten vervolgens worden geïdentificeerd. De germinal centra moeten gemakkelijk herkenbaar en moeten rijk aan Ki-67-positieve lymfocyten (Figuur 2; gele kleurcorrectie). Ki-67 kleuring moet altijd nucleaire. De macrofagen aanwezig in de germinal centra moet ook gemakkelijk herkenbaar, soms als grotere cellen (ook wel "tingible instanties" genoemd). Zij zullen tonen positieve kleuring voor CD68 als een granulaire cytoplasmatische vlek (Figuur 2; oranje kleurcorrectie). Een wisselende verhouding van CD68 cellen buiten de germinal centra is ook te verwachten. Membraan voor PD-L1 kleuring kunnen worden weergegeven door macrofagen. Dit is meestal bleker in intensiteit dan kleuring voor PD-L1 in het reticulated epithelium. Moet er geen nucleaire CD68 kleuring. CD8 moet vlek lymfocyten met een T-cel-distributie (minder in de germinal centra en een groter aandeel in de interfollicular gebieden; Zie Figuur 2A, cyaan kleurcorrectie). CD8 + lymfocyten zijn gewoonlijk kleine cellen met weinig cytoplasma, dus het is vrijwel onmogelijk om het membraan versus cytoplasma in de lymfocyten te onderscheiden. PD-1 kleine lymfocyten in de germinal centrum-gebied, meestal gegroepeerd aan de rand van de germinal centra (Figuur 2; magenta kleurcorrectie) sterk zal vlekken, evenals lymfocyten in de interfollicular regio, meestal verspreid toont een lagere kleuring intensiteit dan die op het gebied van germinal center. Net als bij CD8, is het niet mogelijk om een duidelijk onderscheid maken-membraan en cytoplasmatische kleuring in kleine lymfocyten gekleurd met PD-1. Omdat een wisselende verhouding van CD8 cellen coexpress PD-1, is het raadzaam voor kwaliteitscontrole doeleinden dat de kleuring patroon en distributie van iedere markeerdraad die is gekleurd in de dezelfde weefsels worden vergeleken met chromogenic IHC referentie glijbanen, zoals voorgesteld in eerder gepubliceerde protocollen12.
Nadat het verwachte patroon van de kleuring is bevestigd in de tonsillen weefsel controle, overgaan tot het evalueren van de kleuring in de Long kankersteekproef (Figuur 2B). Omdat de tumor weefsels worden verwacht om te laten zien van een variabele en heterogene expressie van de markers, is het erg belangrijk tijdens het optimaliseren van een nieuw mIF paneel te vergelijken de kleuring patroon voor elke individuele hoofdstukmarkering waargenomen in de mIF methode en haar expressie in de standaard chromogenic IHC dia, evaluatie van de hoeveelheid en verdeling van de positieve cellen als eerder beschreven12waargenomen. Niettemin, het basispatroon kleuring moet worden bewaard; bijvoorbeeld, moeten Cytokeratines worden nageleefd in het cytoplasma van epitheliale cellen en nooit in een kern; CD68 moet worden weergegeven als het korrelig cytoplasmatische kleuring in macrofagen, enz. Nog belangrijker is, in sommige markeringen, kan de intensiteit van kleuring veranderen van de tonsillen controle aan het weefsel van de kanker; bijvoorbeeld, PD-1 en PD-L1 prima overweg met lagere intensiteit vlekken in het weefsel van de tumor ten opzichte van de zeer hoge expressie waargenomen in tonsillen controle. Het is daarom belangrijk voor het uitvoeren van de evaluatie en optimalisatie met het hulpprogramma graven in de inForm software, met behulp van voorbeelden van tumor weefsels in plaats van de tonsillen besturingselementen.
Tot slot, isotype-negatief en drop besturingselementen moeten worden geëvalueerd, niet alleen voor de detectie van achtergrond- en autofluorescence, maar ook voor paraplu effecten en spectrale afloopgebied (Figuur 3 en Figuur 4). Isotype-besturingselementen moeten niet blijk geven van enige immunokleuring over de dia; Indien een kleuring wordt waargenomen, moet vervolgens de beeldvorming of kleuring procedure worden herzien. Drop besturingselementen zijn belangrijk voor het evalueren van potentiële artefacten in de kleuring, zoals spectrale afloopgebied of paraplu effecten, als gevolg van de methode mIF tijdens de optimalisatie van een nieuwe multiplex paneel (Zie Figuur 5, Aanvullende figuur S2, Aanvullende figuur S3, en aanvullende materialen). Fluorescerende monoplex en neerzetten besturingselementen moeten worden geëvalueerd en vergeleken met de volledige multiplex paneel. Elk besturingselement daling moet hetzelfde kleuring patroon met uitzondering van de enkele primair antilichaam, dat moet worden verwijderd op elk specifiek besturingselement weergeven Verdere details vindt u in de sectie Aanvullende materialen .
Figuur 1 : Tool telt informeren. Het inForm software graven gereedschap wordt geactiveerd door de beige vak-pictogram te selecteren. Genormaliseerde graven zijn gecorrigeerd voor bitdiepte, belichtingstijd, winst en weggooien. De beelden werden genomen bij 20 X vergroting; de schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatieve resultaten. Tonsillen (A) en (B) nonsmall-cel longcarcinoom werden gekleurd met PD-L1 (520 TSA, groen), CD8 (540 TSA, cyaan), Ki67 (570 TSA, geel), CD68 (620 TSA, oranje), cytokeratin (650 TSA, rood), en PD-1 (690 TSA, magenta). Afzonderlijke kanalen worden afzonderlijk weergegeven onder in kleine panelen. De markering is aangegeven in de rechterbovenhoek van elke afbeelding. De beelden werden genomen bij 20 X vergroting; Schaal bar = 50 (of 250 µm). Aangegeven in deelvenster A zijn 1) lymfoïde follikel, 2) germinal center, 3) interfollicular gebied en 4) gestratificeerd squamous epitheel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : TSA blokkeren/paraplu effect. Dit is een voorbeeld van 690 TSA afgezet door een PD-1 antilichaam-blokkerende CD3 signaal op een wijze afhankelijk van de hoeveelheid TSA aanwezig. De helderste 690 TSA signaal blokkeert de 620 TSA signaal optimaal (nonsmall-cel longcarcinoom gekleurd met anti-PD-1 D4W2J voor 30 min op 0.52 µg/mL of isotype gevolgd door een 10 min 690 TSA detectie op 1:100; dan anti-CD3 F7.2.38 gedurende 30 minuten op 0,14 µg Mo/mL gevolgd door een 10 min 620-TSA detectie op 1:100). De beelden werden genomen bij 20 X vergroting; de schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Spectrale afloopgebied. Nonsmall-cel carcinoom longweefsel was gekleurd met het Ki-67 drop-control protocol (volledige multiplex met Ki-67 antilichaam weggelaten). De 540 TSA zender (CD8) en de 570 TSA zender (Ki-67) worden weergegeven. Geen nucleaire kleuring patroon blijkt echter een verkleinde kopie van de CD8 kleuring patroon wordt waargenomen in het 570 TSA-kanaal. Dit is best aangepakt door te zorgen voor vergelijkbare kleuring intensiteiten in alle kanalen. In dit geval zal de toevoeging van een robuuste Ki-67-signaal (genormaliseerde telt tussen 10 en 20) corrigeren de spectrale bloeden. De beelden werden genomen bij 20 X vergroting; de schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Drop besturingselementen. Deze afbeelding ziet u een samengestelde afbeelding van een volledige multiplex vergeleken met dezelfde regio van opeenvolgende dia's van adenocarcinoom van de Long gekleurd met drop besturingselementen waarin de aangegeven primair antilichaam werd weggelaten. De beelden werden genomen bij 20 x vergroting; Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Naam | Afgekort naam | Type | Container | Groep |
| PKI blokkeren Buffer | OPALBLOK | Nevendiensten | Open 30 mL | Algemene |
| Opaal polymeer HRP | OPAAL 2AB | Nevendiensten | Open 30 mL | Algemene |
| OPAL 1 x TBS | OPAL1TBS | Nevendiensten | Open 30 mL | Det. Kit |
| CD68 0,30 µg/mL PG-M1 Mus | OPALCD68 | Nevendiensten | Open 7 mL | Algemene |
| ki67 0.61 µg/mL MIB-1 Mus | OPALki67 | Nevendiensten | Open 7 mL | Algemene |
| PD-L1 0.20 µg/mL SP263 Rab | OPALPDL1 | Nevendiensten | Open 7 mL | Algemene |
| PD-1 0.52 µg/mL D4W2J Rab | OPAAL PD1 | Nevendiensten | Open 7 mL | Algemene |
| CD8 0.70 µg/mL SP239 Rab | OPAAL CD8 | Nevendiensten | Open 7 mL | Algemene |
| CK 0,24 µg/mL AE1/AE3 Mus | OPAAL CK | Nevendiensten | Open 7 mL | Algemene |
| Muis IgG | OPAAL MUS | Nevendiensten | Open 7 mL | Algemene |
| Konijn IgG | OPAAL RAB | Nevendiensten | Open 7 mL | Algemene |
| OPAAL Peroxidase blok | OPALPERX | Nevendiensten | Open 7 mL | Algemene |
| Spectrale DAPI | OPALDAPI | Nevendiensten | Titratie 6 mL | Algemene |
| Opaal 520 reagens | OPAAL 520 | Nevendiensten | Titratie 6 mL | Algemene |
| Opaal 540 reagens | OPAAL 540 | Nevendiensten | Titratie 6 mL | Algemene |
| Opaal 570 reagens | OPAAL 570 | Nevendiensten | Titratie 6 mL | Algemene |
| Opaal 620 reagens | OPAAL 620 | Nevendiensten | Titratie 6 mL | Algemene |
| Opal 650 reagens | OPAL 650 | Nevendiensten | Titratie 6 mL | Algemene |
| Opaal 690 reagens | OPAAL 690 | Nevendiensten | Titratie 6 mL | Algemene |
Tabel 1: Leica Bond RX Protocol, Opal reagentia
| Reagens | Tijd (h) | Temperatuur (graden Celsius) | |
| 1 | Geen reagens | 120:00 | 60 |
| 2 | Bond Dewax oplossing | 0:30 | 72 |
| 3 | Bond Dewax oplossing | 0:00 | 72 |
| 4 | Bond Dewax oplossing | 0:00 | Ambient (kamertemperatuur) |
Tabel 2: OPAL voorbereiding Protocol
| Doel | µg Mo/mL | Kloon | Bron | Veel | Voorraad µg Mo/mL | µL verdunningsmiddel | ΜL AB |
| CD68 | 0.3 | PG-M1 | Dako | 20043031 | 30 | 2376 | 24 |
| ki67 | 0.61 | MIB-1 | Dako | 20049476 | 46 | 2368.17 | 31.83 |
| PD-L1 | 0.2 | SP263 | Vent. | F09591 | 1.61 | 2101.86 | 298.14 |
| PD-1 | 0.52 | D4W2J | CST | 1 | 100 | 2387.52 | 12,48 |
| CD8 | 0,7 | SP239 | Ventana | 160318 | 70 | 2376 | 24 |
| CK | 0,24 | AE1/AE3 | Dako | 10129428 | 179.5 | 2396.79 | 3,21 |
| Mus IgG | 0.61 | ||||||
| Rab IgG | 0,7 |
Tabel 3: Primaire antilichamen voorbereiding.
| Opaal Fluor | Dia 's | Verdunning | µL verdunningsmiddel | µL opal Fluor |
| Opaal 520 | 16 | 1:200 | 2736.3 | 13,8 |
| Opaal 540 | 16 | 1:700 | 2746.1 | 3.9 |
| Opaal 570 | 16 | 1:150 | 2731.7 | 18.3 |
| Opaal 620 | 16 | 1:100 | 2722.5 | 27,5 |
| Opal 650 | 16 | 1:350 | 2742.1 | 7,9 |
| Opaal 690 | 16 | 1:150 | 2731.7 | 18.3 |
Tabel 4: OPAL Fluor voorbereiding.
Aanvullende materiële Word-Document: Gelieve Klik hier om dit document te downloaden.
Aanvullende figuur 1: Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.
Aanvullende figuur 2: Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.
Aanvullende figuur 3: Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.
Aanvullende tabel 1: Leica Bond RX Opal Multiplex Protocol. Klik hier om te downloaden van deze tabel.
Aanvullende tabel 2: overzicht en vergelijking van volledige multiplex, daling van de besturingselementen en volledige isotype besturingselementen. Klik hier om te downloaden van deze tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De lopende kanker immunotherapie revolutie is opening nieuwe en veelbelovende therapeutische opties voor kanker patiënten13. Vooruitgang op het gebied van immuno-oncologie vergt meer kennis van de inflammatoire tumor communicatie, niet alleen om te begrijpen van de biologie van de immunologische mechanismen die betrokken zijn bij carcinogenese, maar ook om voorspellende biomarkers voor nieuwe immunotherapie gebaseerde behandelingen1,2. Als gevolg van de complexe biologie van kanker immunologie, is ondervraging van weefselmonsters van de tumor gewoonlijk nodig voor het ontwikkelen van een het groeien lijst van immuun markers, die interactie met elkaar en zijn vaak coexpressed door diverse cel populaties in het weefsel1 ,2,5. Klinische proeven dienst meestal kleine biopsieën, zoals kern naald of Endoscopische biopsieën, die zijn verzameld op verschillende tijdstippen van de therapie te evalueren en controleren van de reactie van de patiënt. Deze biopten bieden beperkte hoeveelheden weefsel, die op zijn beurt beperkt het aantal weefselsecties die kan worden ingezet voor kanker immunoprofiling. Deze beperking is vooral belastend wanneer traditionele technieken, zoals standaard monoplex IHC, worden gebruikt. Er is dus een duidelijke moet voor nieuwe methoden voor kanker immunoprofiling waardoor gebruik van multiplex technieken met de capaciteit om de coexpression van verschillende biomerkers gelijktijdig en efficiënter gebruik van waardevolle weefsel specimens te maken.
In de multiplex kleuring en multispectrale beeldvormende methoden die hier in detail worden beschreven, is een panel van mIF gebruikt voor immuno-oncologie studies over FFPE weefsels zoals Biopten van een klinische proef. Deze methode is eerder beschreven, gevalideerd, en met succes toegepast op kanker immunoprofiling8,9,10,11,12,14, 15. eerder gepubliceerde protocollen hebben beschreven soortgelijke mIF kleuring van methoden met TSA-gebaseerde systemen, zoals de zeven-kleur-kit, die is tijdrovend en vereist ongeveer 4 dagen werk door een toegewijde laboratorium wetenschapper12 ,15. In reactie op deze tekortkomingen, is dit protocol geoptimaliseerd met behulp van een commercieel beschikbare geautomatiseerde brandschilderen, drastisch verkorten de kleuring van tijd om 14u en het elimineren van de variabiliteit geïntroduceerd door handmatige exploitanten. Imaging wordt uitgevoerd op een multispectrale scanner staat van het scheiden van de spectra van de zeven of meer fluorescerende signalen in de multiplex dia's, met inbegrip van autofluorescence, die efficiënt kan worden verwijderd zonder aan te tasten de signaalkwaliteit. Dit protocol kan worden gerepliceerd, bewerkt en uitgevoerd door een laboratorium gebruiker met toegang tot de instrumenten en reagentia gedetailleerd in de Tabel van materialen.
Kritische stappen in dit protocol zijn secties 7, 10, 11, 12. Sectie 7 heeft betrekking op de voorbereiding van de reagentia. Een zorgvuldige voorbereiding van de reagentia voor multiplex kleuring is essentieel, waarbij de aandacht van een wetenschapper van het laboratorium of de technicus om te voorkomen dat de exploitant-afhankelijke variant. Bijvoorbeeld, is een van de grote problemen met de multiplex methode variabiliteit, die kan worden verminderd door de zorgvuldige voorbereiding van de verdunningen van de reagentia, specifiek de TSA kleurstoffen kleuring. Secties 10 en 11 hebben betrekking op Beeldacquisitie. Een belangrijk risico is de overmatige blootstelling of overbelichtingseffecten van de beelden, die kunnen leiden tot spectrale bloeden, een artefact waarin het signaal van een andere zender interfereert met het kanaal image wordt gemaakt (Zie Aanvullende materialen). Zorgvuldig reguleren de belichtingstijden kan helpen om te voorkomen dat overbelichtingseffecten en spectrale bloeden. Spectrale randverwijdering wordt uitgevoerd in sectie 12. Dit is gebaseerd op de voorbereiding van de spectrale bibliotheek (beschreven in de Multiplex IHC Assay Development Guide, beschikbaar online). In deze stap is de inForm-software "getraind" in het specifiek herkennen de kleuren voor elk TSA kleurstof. De spectrale bibliotheek is gemaakt met behulp van secties van een controle-weefsel, zoals menselijke tonsillen, gekleurd met een gelijkmatig uitgedrukt marker, zoals CD20, in combinatie met elke individuele TSA kleurstof op afzonderlijke dia's. Daarnaast zijn autofluorescence dia's (ook beschreven in de gids van de Multiplex IHC Assay ontwikkeling) nodig om te trainen de inForm software te herkennen en weefsel autofluorescence aftrekken. Autofluorescence controle dia's moeten worden bereid met behulp van monsters uit de dezelfde weefsels bestudeerd (zoals longkanker, enz.), op de dezelfde wijze behandeld als de mIF dia's en geïncubeerd met primaire en secundaire antilichamen, maar zonder de TSA kleurstof. Slechts een enkele autofluorescence spectrale profiel kan worden geselecteerd, zodat moet worden gezorgd om te selecteren van een vertegenwoordiging van de waarneembare autofluorescence die uit collageen, fibrose, rode bloedcellen, endogene pigmenten en andere bronnen komen kan. Creëren van een nieuwe spectrale bibliotheek aan het begin van elk nieuw project en met behulp van een autofluorescence-spectrum die representatief is voor de weefsel studie specimens, evenals het uitvoeren van de dezelfde weefsel blokken als positieve controle voor elke partij binnen hetzelfde project waardevolle methodologische stappen die helpen zullen om de consistentie van de spectrale zijn randverwijdering over verschillende monsters binnen hetzelfde project.
De multiplex in dit protocol beschreven methode biedt verschillende hulpprogramma's voor probleemoplossing, met inbegrip van een beoordelaar signal-to-noise (tellingen tool), drop besturingselementen (Aanvullende materialen) en de weergave van een pathologie voor kwaliteitscontrole van de kleuring. De tellingen is een hulpmiddel om de intensiteit van de kleuring en het niveau van de achtergrond te evalueren. Als de intensiteit en/of de achtergrondniveaus hoog zijn, is de eerste benadering het verminderen van de verdunning van de TSA kleurstof. Als het probleem zich blijft voordoen, moeten de chromogenic IHC slides die gebruikt worden voor de optimalisatie van die bijzondere markering worden herzien met een patholoog, op zoek naar de aanwezigheid van de achtergrond. De weergave van de pathologie wordt gegenereerd door de inForm software, met behulp van een diaminobenzidine-achtige kleurcorrectie vertegenwoordiging van de fluorescentie van de TSA-linked fluor, alsmede een vertegenwoordiging van de faux Haematoxyline gegenereerd op basis van alle fluorescerende signalen, met inbegrip van de DAPI . Beelden van de pathologie weergave helpen met de visuele beoordeling van de kleuring patronen door een patholoog voor verbeterde kleuring. Deze hulpmiddelen moeten altijd worden gebruikt tijdens de optimalisatie van een nieuw paneel en als kwaliteitscontrole stappen tijdens de kleuring workflow.
De methode mIF vereist het gebruik van primaire antilichamen die goed zijn gevalideerd en geoptimaliseerd voor standaard chromogenic IHC op formaline vaste weefsels. Bijvoorbeeld, is een van de grote voordelen van de methode van de TSA mIF de verenigbaarheid ervan met het gebruik van primaire antilichamen die zijn gevalideerd en geoptimaliseerd in de anatomo-pathologie laboratorium voor klinische gebruik12. Dit voordeel houdt in dat de multiplex panelen kunnen worden aangepast door de gebruiker van het laboratorium voor specifieke kanker immunologie vragen zonder de noodzaak van preconjugated antilichamen, bieden snelle en dynamische deelvenster ontwikkeling. In dit verband begint de workflow voor het optimaliseren van een nieuw deelvenster met de validatie en de optimalisatie van de antistoffen met standaard chromogenic IHC, op zoek naar de beste verdunning en kleuring van voorwaarden die zal bieden schone en consistente kleuring. De volgende stap, met behulp van de dezelfde verdunningen geoptimaliseerd voor IHC, is overbrengen van de kleuring met behulp van TSA fluors in plaats van diaminobenzidine en de resultatenvan monoplex vergelijken immunefluorescentie TSA met de chromogenic IHC als referentie. Tot slot kunnen de antilichamen worden gecombineerd in mIF kleuring, altijd met behulp van de chromogenic IHC kleuring patroon als een verwijzing naar het besturingselement aan te passen de mIF TSA kleuring parameters, voornamelijk de TSA kleurstof verdunningen en de kleuring volgorde. Tijdens dit proces is de samenwerking met een patholoog instrumentale te evalueren van de kwaliteit van de kleuring.
Beperkingen van deze techniek zijn de tijd en de inspanning die nodig is voor de optimalisatie en validatie van nieuwe panelen en de analyse van de immunophenotyping van mIF panelen. De voornaamste zorg, echter, is de juiste validering van mIF methoden. Het gebrek aan goede validatie van deze technieken draagt het risico van het genereren van ongeldige resultaten, die verwarrend gegevens aan de literatuur toevoegen kunnen, waardoor het belemmeren van pogingen om een beter inzicht van de biologie van kanker immunologie16. Het is daarom, zittende op de onderzoeker inspannen correct valideren multiplex methoden, waaronder waarborgen van nauwe deelname en evaluatie door pathologen met opleiding en ervaring in validatie en evaluatie van weefsel histopathologie en IHC gebaseerde technieken17,18,19,20. Het hier gepresenteerde protocol bevat enkele van de tools die met de validatie van een nieuwe multiplex Configuratiescherm helpen kunnen, met inbegrip van de evaluatie van de pathologie van H & E dia's voordat kleuring en analyse, het gebruik van chromogenic IHC als een verwijzing naar het optimaliseren van de mIF TSA kleuring, de daling van de beheermethode voor kwaliteitscontrole van een nieuwe multiplex paneel, en het gebruik van isotype, autofluorescence, en controles neerzetten. Ondanks de technische complexiteit van mIF methoden opent technologieën zoals multispectrale beeldbewerking met de spectrale randverwijdering, evenals andere nieuwe multiplex platformen, een nieuw tijdperk voor de analyse van weefsel monsters van patiënten en de generatie van nieuwe vormen van gegevens die niet met standaard IHC alleen mogelijk. Dus, de ontwikkeling en toepassing van mIF technieken zal blijven groeien, steeds krachtige hulpmiddelen voor de kanker immunoprofiling van biopten voor klinische proeven en bijdragen tot het identificeren van nieuwe multiparametric voorspellende biomarkers voor immunotherapie, profiteren, vooral de kankerpatiënt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit werk werd gesteund door MedImmune, de wereldwijde biologics R & D arm van AstraZeneca. C.W., K.R. en C.C.H. zijn werknemers van Perkin Elmer, die de reagentia (TSA kit produceert) en multispectrale scanners die werden gebruikt in dit werk. M.S., K.D., A.H., W.Z. C. Bagnall, C. Brown, J.C., A.L., K.S., M.R. en J.R.C. zijn werknemers van MedImmune met stock eigendom en/of voorraad belangen of opties in AstraZeneca.
Acknowledgments
Redactionele ondersteuning werd geleverd door Deborah Shuman van MedImmune.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
