Summary
פרוטוקול מפורט עבור לוח שש-marker immunofluorescence מולטיפלקס אופטימיזציה שבוצעו, באמצעות הוספת גוון לסמלים אוטומטיות עבור תוצאות עקביות יותר זמן הליך קצר יותר. גישה זו ניתן להתאים ישירות על ידי כל מעבדה לחקר חיסונית-אונקולוגיה.
Abstract
המשך ההתפתחויות חיסונית-אונקולוגיה דורשות הבנה מוגברת של המנגנונים של סרטן אימונולוגיה. ניתוח immunoprofiling של דגימות רקמה של פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע ביופסיות (FFPE) הפך להיות כלי מרכזי להבנת המורכבות של הגידול אימונולוגיה, גילוי סמנים ביולוגיים חזוי הרומן על חיסוני סרטן. ניתוח Immunoprofiling של רקמות דורש הערכת סמנים משולב, כולל תאים דלקתיים subpopulations ואת המערכת החיסונית מחסומים, microenvironment הגידול. כניסתו של הרומן immunohistochemical מולטיפלקס שיטות מאפשר ניתוח multiparametric יעיל יותר של מקטעי רקמת בודד מאשר monoplex רגיל אימונוהיסטוכימיה (IHC). אחד immunofluorescence מולטיפלקס זמינים מסחרית (אם) שיטה המבוססת על tyramide-אות הגברה, בשילוב עם ניתוח מיקרוסקופי מולטי ספקטריאליות, מאפשר הפרדה אות טוב יותר של סמני מגוונות בתוך הרקמה. מתודולוגיה זו הוא תואם השימוש unconjugated נוגדנים העיקריים מוטבו עבור IHC רגיל על דגימות רקמה FFPE. במסמך זה אנו נתאר בפירוט פרוטוקול אוטומטית המאפשרת מולטיפלקס אם תיוג של דגימות רקמה קרצינומה עם פאנל נוגדן מולטיפלקס שש-marker הכוללת PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 ו- AE1/AE3 cytokeratins עם 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole כמו counterstain גרעין התא. פרוטוקול לוח רב-חלקים ממוטבת ב הוספת גוון לסמלים IHC אוטומטיות לזמן מוכתמים, כי היא קצרה יותר מזו של פרוטוקול ידני, ניתן ישירות חלה על ידי כל חוקר המעבדה ללימודי חיסונית-אונקולוגית על דגימות רקמה אנושית של FFPE. תיארו גם הם מספר פקדים, כלים, כולל שיטת בקרת ירידה לבקרת איכות בסדר של לוח אם חדש מולטיפלקס, שימושיות עבור אופטימיזציה ואימות של הטכניקה.
Introduction
ניתוח Immunoprofiling של דגימות רקמה FFPE הגידול הפך מרכיב חיוני של מחקרים חיסונית-אונקולוגיה, במיוחד עבור גילוי של אימות של סמנים ביולוגיים חזוי הרומן על חיסוני סרטן בהקשר של ניסויים קליניים1 ,2. IHC הדפסות כסף, שימוש chromogens כימיים כגון diaminobenzidine, נשאר טכניקה סטנדרטית בפתולוגיה אבחון עבור immunolabeling של ביופסיה רקמות3. IHC רגיל יכול לשמש גם עבור סרטן רקמות immunoprofiling, כולל את כימות של subpopulations של לימפוציטים סרטניים הקשורים והערכה של רמות הביטוי של מחסומים מערכת החיסון כגון ליגנד מוות תאים מתוכנת 1 (PD-L1)4 ,5. IHC רגיל הוא מוגבל, אולם זה אנטיגן אחד בלבד יכול להיקרא לכל סעיף הרקמה. מאחר immunoprofiling מחקרים דורשות בדרך כלל הניתוח של הביטוי בשילוב של מספר סמנים, השימוש IHC סטנדרטי ידרוש צביעה של רקמת מקטעים מרובים, אחד צבעונית עם סמן בודד, ויהיה, לכן, מוגבל באופן משמעותי לניתוח של דגימות רקמה קטנות כגון ביופסיות מחט הליבה. בשיטות הרגילות IHC מוגבלים גם להערכה של סמנים הן coexpressed על ידי אוכלוסיות מגוונות תא, כפי שמקובל עם סמנים מחסום מערכת החיסון כגון PD-L1, הבאה לידי ביטוי על ידי מקרופאגים סרטניים הקשורים והן תאים סרטניים. מגבלה זו דווחה על-ידי פתולוגים לניתוח כמותי של סמן IHC לידי תא מגוון סוגי6ב, למשל, השימוש הרגיל monoplex IHC. התפתחות טכניקות IHC הדפסות כסף מולטיפלקס העסקת מגוונות chromogens צבעוניים על מייצג סעיף זהה רקמת קידום על פני השיטה IHC monoplex סטנדרטי,7 למרות הם נשארים מוגבל על-ידי immunolabeling של כמה סמני ולהציג גם מהווה אתגר טכני חשוב על הערכה נכונה של סמני לידי ביטוי באותו התאים subcellular של אוכלוסיות תאים באותו.
ההליכים הנ ל לגבי זמינות הרקמה דגימות קליניות, כמו גם המגבלות של מולטיפלקס טכניקות IHC הדפסות כסף, נתנו עלייה על הצורך לפתח שיטות מולטיפלקס משופרת ללימודי חיסונית-אונקולוגיה בהתאם תיוג פלורסנט בשילוב עם מערכות זה יעיל יכול להפריד את האותות של fluorophores מרובים לאותה השקופית הדמיה. טכניקה אחת כזו מבוססת על tyramide אות הגברה (TSA) בשילוב עם מיקרוסקופ מולטי ספקטריאליות הדמיה עבור צבע יעיל ההפרדה8. ערכת מבוסס-TSA זמינים מסחרית מעסיקה fluorophores אופטימיזציה עבור הדמיה מולטי ספקטריאליות8 (ראה טבלה של חומרים). יתרון קריטי של מערכת זו הוא התאימות שלו עם אותו ללא תווית העיקרי נוגדנים כבר מאומת, אופטימיזציה עבור תקן הדפסות כסף IHC9,10,11. פעולה זו מאפשרת לא רק אופטימיזציה מהירה יותר, אלא גם גמישות ב השינויים אופטימיזציה ו לוח שילוב מטרות חדשות. יתר על כן, ניתן למטב את שיטת TSA מולטיפלקס immunofluorescence (mIF) זמינים מסחרית במערכות הוספת גוון לסמלים IHC אוטומטי, המאפשר העברה ישירה של monoplex IHC הדפסות כסף כדי mIF.
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור לוח mIF ללימודי חיסונית-אונקולוגיה המבוסס על אוטומטי mIF TSA מכתים ומשתמש בסורק מולטי ספקטריאליות עבור הדמיה. פרוטוקול זה יכול להיות הותאם, שונה על ידי כל משתמש מעבדה עם גישה מכשור המתואר, ריאגנטים. הפרוטוקול כולל פאנל של שישה ראשי נוגדנים עבור immunoprofiling של קרצינומות: PD-L1, PD-1, CD68 (כמו סמן פאן-מקרופאג), CD8 (תאי T-ציטוטוקסיות), Ki-67, ו AE1/AE3 (פאן-cytokeratin, משמש סמן אפיתל לצורך הזיהוי קרצינומה של תאים). מחקר שנערך לאחרונה מתאר אופטימיזציה של פרוטוקול mIF TSA ידנית באמצעות הדפסות כסף IHC כהפניה סטנדרטי כדי לאמת את תירגע צביעת12. השיטה מעודכן המובאת כאן פותחה באמצעות ערכת TSA זמינים מסחרית, שבע-צבע באופן ממוכנת הוספת גוון לסמלים, באופן דרסטי קיצור הזמן מכתימים מ 3 – 5 ימים ש 14, תוך גם שיפור מרקם של ההכתמה מיטבי. בנוסף הראשי פרוטוקול מפורט המובאת כאן, מקטע תוספת חומרים כולל שיטת "טיפה-שליטה", תהליך בקרת איכות נוספים כדי להעריך את פאנל mIF חדש, כמו גם הערות טכניות עבור אופטימיזציה, פתרון בעיות, פיתוח של פאנלים מולטיפלקס חדשים כדי לסייע למשתמש מעבדה כדי להגדיר ולמטב את השיטה TSA mIF לפאנלים mIF מותאם אישית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול המובאת כאן מתאר כיצד לבצע immunoprofiling של לוח mIF באמצעות TSA עבור שישה נוגדנים (CD68, ki67, PD-L1, PD-1 CD8, AE1/AE3) על הוספת גוון לסמלים אוטומטית (ראה טבלה של חומרים). הפרוטוקול גם מתאר כיצד לבצע את הפקדים טיפה לבקרת איכות של פאנל mIF חדש (ראה תוספת חומרים). ב פרוטוקול זה, מכתים מתבצע בעזרת שקופיות FFPE וללא רבב שמונה מן האדם שקדים (בקרה חיובית) שמונה מוכתם שקופיות מחלוקה אמבריולוגיה אדנוקרצינומה. השקופית הראשונה משמש מלאה מולטיפלקס מכתים עם כל הסמנים שש, השקופית השניה עבור הפקד isotype שבו מנוצלים אין נוגדנים הראשי את שש שקופיות הנותרים עבור הפקדים טיפה (ראה תוספת חומרים). פקד נוסף בשביל לרקמות autofluorescence מומלץ בחום ולא תמיד להיכלל מתחם בתי קולנוע ללמוד (ראה תוספת חומרים). עם זאת, החוקרים יכולים להעסיק הגידול סוגים אחרים של פקדים על-פי מטרות הפרוייקט שלהם. מעבדה משתמשים ללא ניסיון קודם עם שיטת TSA mIF וטכניקות סורק מולטי ספקטריאליות צריך לקרוא את מדריך פיתוח IHC מולטיפלקס (זמין באינטרנט, בכתובת http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). למרות מדריך זה מתאר פרוטוקול ידנית, הוא גם מספק דרך טובה להכיר mIF מכתימה את השיטה. כל מקטעי רקמת המועסקים פרוטוקול זה היו anonymised ואושר על פי הצהרת הלסינקי.
1. דגימות רקמה
- בחר מדגם אנושי שקדים FFPE המכיל היפרפלזיה הלימפה כדי לשמש מדגם אדנוקרצינומה אמבריולוגיה FFPE ידוע PD-L1 ובקרה חיובית חיובית. סקור את hematoxylin אאוזין (H & E) ומגלשות מאבני סרטן ריאות שנבחר כדי לאשר הנוכחות של גידול. חשוב למנוע גידולים עם אזורי שופע של נמק כפי זה עשוי להגדיל את צביעת הרקע לא ספציפית.
הערה: עבור מיטוב זה, להימנע משימוש בלוקים פרפין אוחסנו עבור 10 שנים או יותר רקמות עם מראה מיובשים בבלוק פרפין (התייעץ עם טכנאי היסטולוגיה). - שימוש של מיקרוטום, חותכים 10 סעיפים טורי ברציפות מ כל בלוק, עבה 4 מיקרומטר. הר הסעיפים על משטח זכוכית הטעון חיובית המשמש IHC, מקטע אחד לכל שקופית.
הערה: חייב להיות מותקן מקטעים שטוח לחלוטין ללא קמטים, כמו קמטים עשויה ליצור חפצים מוכתמים. מספר השקופיות של הסעיפים טורי מ- 1 עד 10. - הכנת שקופית חדשה H & E על החלק הראשון. סקור את השקופית H & E עם העזרה של פתולוג כדי לאשר הנוכחות של שקדים גידול רקמות או ריאה שנותרה בגוש.
הערה: בשקופית זו H & E יכול לעזור, מאוחר יותר, עם המבחר של האזורים של ריבית עבור ניתוח מולטי ספקטריאליות ו- phenotyping. - חנות מוכתם מקטעים בתוך קופסת פלסטיק שקופיות ב 4 ° C עד שלושה חודשים.
2. בריאת mIF החדש התוכנית Staining על הוספת גוון לסמלים האוטומטית: רישום של ריאגנטים
הערה: ריאגנטים להתווסף לרשימה ריאגנט בתוכנות אוטומטיות הוספת גוון לסמלים לפני הם זמינים עבור שימוש בפרוטוקולים. ראה את הטבלה של חומרים למידע על הגירסה דגם ותוכנות אוטומטיות הוספת גוון לסמלים.
- לחץ על הכרטיסיה ריאגנטים בתוך התוכנה הוספת גוון לסמלים אוטומטית. לחץ על הוסף כדי לייעד ריאגנט חדש. הזן את השם (למשל, "520 TSA ריאגנט") ואת השם המקוצר (למשל, "520 TSA"), וציין כי יש לכל היותר שמונה תווים. בחר משניים מתוך התפריט הנפתח ולהגדיר את הספק. אל תשנה יחיד/זוגי כתם של יחיד/שקריאה DS. להגדיר את ברירת המחדל מכתים פרוטוקול פרוטוקול F. מוגדר פרוטוקול ברירת המחדל חיר ER1 20.
- שמור את מגיב חדש, וחזור על שלב מספר 2.1 עבור כל ריאגנטים המפורטים בטבלה1.
3. אוטומטית הוספת גוון לסמלים: רישום של המכולות
- לכתוב את שמו של הכימית כדי לשמש בצד לכל מכולה. סרוק את הברקוד על הצד. בחלון הנפתח, בחר הכימית הנכון מהרשימה. בחר תאריך תפוגה ושמירה.
- חזור על הפעולות בשלב 3.1 עבור כל ריאגנטים המפורטים בטבלה1.
- לרשום את ערכת מחקר פתוח. לסרוק ברקודים הן בצד של ערכת ובצע מציגה על המסך. שם ערכת "מולטיפלקס מחקר ערכת 1." לרשום את aminomethane x tris (hydroxymethyl) 1 (טריס)-באגירה תמיסת מלח כחלק הקיט הזה (טבלה 1).
4. אוטומטית הוספת גוון לסמלים: בריאת mIF פרוטוקול תוכנית
- פרוטוקול מולטיפלקס הבסיס הוא מראש עם השם אופל 7 מולטיפלקס על stainers האוטומטי החדש (ראה הגירסה דגם ותוכנות טבלה של חומרים). אתר את הפרוטוקול באמצעות סינון לפי "all" במקום "מועדף" על המסך פרוטוקול. אם הפרוטוקול הבסיסי לא קיים, לעדכן את התוכנה הוספת גוון לסמלים אוטומטית עם סיוע מהיצרן.
- כל השינויים צריך להתנהל על העתקי הפרוטוקול המקורי. לפני ביצוע שינויים, להציל את המקור וליצור עותק על-ידי לחיצה על הכרטיסיה פרוטוקולים , ואז לחיצה ימנית פרוטוקול אופאל 7 מולטיפלקס ובחירה עותק.
- לשנות את השם ל 7. הפרוטוקול מולטיפלקס 1 בחלון חדש, בחר את הכרטיסיה המשויך את המכשיר הנכון (דגם קומה או benchtop). להתאים את הפרוטוקול S1 טבלה משלימה. לחץ על הוספת ריאגנט הוסף שלב עיכוב peroxidase 10 דקות (לא במסגרת הפרוטוקול הסטנדרטי), בחר את המדכא peroxidase הכימית.
- לאשר השלבים חסימה לנצל את מאגר חסימה PKI. ודא כי כל נוגדן ראשוני מתייחס הכימית המתאים, כי נוגדנים משני שלבים לנצל של פולימר HRP, הזה ספקטרלי 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מסופק עם הקיט אוטומציה מולטי ספקטריאליות הוא מנוצל. לאשר כל האפשרויות על-ידי בדיקת הכימית זה שנקבע עבור כל שלב המתאימות בתפריט הנפתח על המסך פרוטוקול.
5. ממוכנות הוספת גוון לסמלים: תוספת של פקדים טיפה, פרוטוקול בקרה Isotype
- להעתיק את שם פרוטוקול מולטיפלקס 7 1 ולשנות אותו 7לפרוטוקול מולטיפלקס 1 CD68 טיפה. לשנות הכימית נוגדן CD68 העכבר אג ולשמור את הפרוטוקול.
- ליצור שישה פרוטוקולים חדשים יותר, אחד עבור כל פקד טיפה ואחד עבור הפקד isotype מלאה (שינוי לכל הנוגדנים isotypes המתאים) באופן זהה.
6. אוטומטית הוספת גוון לסמלים: שקופית הכנת פרוטוקול
- העתק פרוטוקול prestaining * אופים ו Dewax ולשנות את פרוטוקול זה לאפות מולטי ספקטריאליות ו- h Dewax 2.
- התאם את פרוטוקול כדי להתאים את ריאגנטים שמוצג בטבלה 2. אופים שקופיות עבור 2 h ב 60 מעלות צלזיוס. Dewax ל 30 s ב- 72 מעלות צלזיוס.
7. אוטומטית הוספת גוון לסמלים: הכנה של ריאגנטים
- להכין ערכת זיהוי מחקר אחד. מגיב אחד חייב להיות מקושר באופן קבוע עם ערכה זו, כך מילוי המיכל פתוח 30 מ ל המסומנים עבור 1 x באגירה טריס מלוחים (TBS) 1 x TBS, אתר זה בעמדה 1 (המרוחק ביותר הידית) מחקר לזיהוי ערכת המיועד מולטיפלקס ערכה מחקר 1. הזה ריאגנט ישויכו לצמיתות ערכה מחקר זו, אל תשנה מיקום לשימוש עתידי.
- תווית שני 30 מ ל פתוח מכולות בלוק מולטי ספקטריאליות , מולטי ספקטריאליות משנית. למלא את מיכל בלוק מולטי ספקטריאליות 30 מ של חסימה מאגר/נוגדן diluent הערכה מכתימים מולטי ספקטריאליות. למלא את מיכל מולטי ספקטריאליות משני 30 מ של אנטי-mouse/אנטי-rabbit משני נוגדן פולימר הערכה מכתימים מולטי ספקטריאליות.
- הכינו 10 7 mL מכולות פתוחות. האחסון הנדרש ב- microliters הוא 600 + (150 x [מספר השקופיות]). כל נוגדן יוחלו על 12 שקופיות במקרה זה (שקדים 6 ו- 6 ריאות). תיוג ואמצעי אחסון עבור כל מכולות מסומנים בטבלה3.
- לכל שפופרת נוגדן, תחילה להוסיף הנוגדן diluent, ואחריו נוגדן ראשוני מרוכז הכרכים המצוין בטבלה3. מערבבים על-ידי pipetting עדין.
- להתכונן מכולה פתוחה 7 mL דאפי, באמצעות 4 טיפות דאפי להתרכז למיליליטר מזוקק פעמיים מים; סכום כולל של 16 להיות מוכתם דאפי (600 + [150 x 16] = 3,000 µL). להוסיף 3 מ ל מים מזוקקים-זוגי בתוספת 12 טיפות של דאפי ספקטרלי לתוך המיכל. להכין דאפי טריים עבור כל הפעלה.
- היכונו מכולה פתוחה 7 mL peroxidase מעכב. כל השקופיות 16 יטופלו עם מעכב peroxidase (600 + [150 x 16] = 3,000 µL). להוסיף 3 מ"ל של גוש peroxidase לתוך המיכל.
- לפני הכנת עבודה ריכוזים של fluors, resuspend כל fluors lyophilized על-ידי הוספת µL 75 של דימתיל סולפוקסיד כל שפופרת עבור חיל הים המסופקים על ידי היצרן. מערבבים על-ידי pipetting. . זה המניה עבור חיל הים TSA חנות ב 4 º C.
- להכין שישה מיכלי טיטור, אחד עבור כל עבור חיל הים. אמצעי האחסון הנדרש ב microliters הוא 350 + (150 x [מספר השקופיות]). כל עבור חיל הים יוחלו על השקופיות 16 במקרה זה (שקדים שמונה, שמונה ריאות). תיוג ואמצעי אחסון עבור כל מכולות מסומנים בטבלה4.
- כאשר כל ריאגנטים רשום והכינו, למקם לכל מכולה בכל מיקום ארון תקשורת ולטעון ריאגנטים כל על גבי הוספת גוון לסמלים אוטומטית. החללית יאשר את הנפח של כל מגיב.
8. אוטומטית הוספת גוון לסמלים: לטעום מולטי ספקטריאליות מכתים וההתקנה
-
התוכנה הוספת גוון לסמלים ממוכנת, לחץ על שקופית ההתקנה בחלק העליון של המסך. לחץ על הוסף המחקר. אכלס את החלון המוקפץ עם מזהה מחקר, לימוד שם, הערות.
- בחר את שם החוקר ניצוח מכתימים הפעל מתוך הרשימה הנפתחת. להשאיר את העוצמה dispense 150 µL. בחר מולטי ספקטריאליות Dewax עבור הכנת פרוטוקול. לחץ על הלחצן ' אשר ' הוסף שקופית. תחת הערות, הקלד "מגה-פלקס 123ABC ריאות 1." למלא את השדות הבאים כמצוין: סוג הרקמה = בדיקת רקמות; Dispense נפח = 150 µL; Staining מצב = יחיד, שוטף; סמן = שלילי; צביעת = הקלד "7 מגה-פלקס פרוטוקול 1"; הכנה = אופים מולטי ספקטריאליות, Dewax 2 h; חיר = חיר 20 דקות עם ER1.
- לחץ על הוסף שקופית ולשנות את ההערות ואת פרוטוקול כדי להוסיף על שקופיות בקרת ירידה והחלק שליטה isotype. כאשר כל השקופיות נוספו המחקר, סגור את חלון הוספת שקופיות ולהדפיס תוויות. להחיל את התוויות על אזור התוויות המתאים בכל שקופית.
- לטעון את השקופיות לתוך ארונות תקשורת, החל אריחי חיפוי לכיוון הנכון, להכניס ארונות הוספת גוון לסמלים אוטומטיות ולאחר להנמיך את המגשים. המכשיר יסרוק את תוויות שקופיות.
- כאשר כל השקופיות ריאגנטים כבר שנסרקו והם יהיו נמדד. לחצן הפעלה (◄) יהפוך לפעיל. אם autostainer מזהה שגיאות, כגון עוצמת ריאגנט לא מספיקות, סמל אזהרה צהוב יופיע על-ידי המגש המושפעת. אם מתרחשת שגיאה, וימינה לחץ על סמל התראה, לתקן את השגיאה.
- ליזום מכתים מיד או לקבוע מועד התחלה מושהית. הפרוטוקול הוא כ 14 h במשך. הערה: ודא שהפרוטוקול ישלים בכל פעם כאשר השקופיות ניתן להסיר באופן מיידי כפי exess שטיפה יכול להשפיע תוצאות מוכתמים.
9. Coverslipping של השקופיות מולטי ספקטריאליות
- להסיר את השקופיות הוספת גוון לסמלים אוטומטיות ולאחסן אותם במעמד שקועים 1 x TBS.
- הר הדגימות עם 1.5 מס coverslips, 15 µL של התקשורת הרכבה (ראה טבלה של חומרים). להסיר את כל הבועות על ידי לחיצה על בעדינות coverslip עם טיפ פיפטה.
- לאפשר את השקופיות לרפא ללילה בטמפרטורת החדר על הספסל מעבדה. ניתן לסרוק שקופיות משומרים מיד עם טיפול זהיר.
10. מולטי ספקטריאליות סורק
- כוח על הסורק מולטי ספקטריאליות, המחשב שלה (לקבלת מידע מודל ותוכנות, ראה טבלה של חומרים ). הפעל את תוכנת שליטה מיקרוסקופ. פתח דלת הכניסה של הסורק מולטי ספקטריאליות על-ידי לחיצה על כפתור רגיש למגע על החלק הקדמי של המכשיר. כל מנשא קפיץ בסורק בעל ארבע שקופיות. לטעון כל השקופיות לתוך נושאות ולהקליט את הסדר לפני טעינת נושאות לתוך המכשיר.
- בחר פרוטוקול ערוך ולחץ על בניו...; לאחר מכן, צור שם פרוטוקול 1 לוח מולטיפלקס ופקדים טיפה. ליצור את שם המחקר מולטיפלקס פיתוח לוח, לחץ על פרוטוקול ליצורוהקלד סקירה לסרוק מסנן דאפי; לאחר מכן, בחר כל שקופית סרוק , רזולוציה פיקסל 0.50 מיקרומטר (20 X). צריך להיות מיוצג כל להקות ומסננים. אם לא, לחץ על עריכה ומסננים להקות, בחר כל המסננים חמש (דאפי, FITC, CY3, טקסס Red ו- CY5) ולאחר מכן, לחץ על ערוך חשיפות.
- לטעון המוביל על-ידי בחירת חברת ההובלה עם תירגע מלא של ריאות אדנוקרצינומה. בחר את השקופית הנכונה באמצעות ממשק משתמש גרפי. פוקוס הרקמה באופן ידני או באמצעות פוקוס אוטומטי. נווט אל כל אזור עם צביעת דאפי מקובל ולחץ על חשיפה אוטומטי כדי להגדיר את החשיפה באלפיות שניה (0 – 2,000 ms).
- חזור על הפרוצדורה זהה עבור כל חמש מערכות סינון בעמודות לסרוק כל והן אזור MSI. הקפד לנווט לאזור בו מקובל מכתים ומקדו המיקרוסקופ לפני הגדרת החשיפה עבור כל רמת סינון ואת ההגדלה. Auto-חושפים עבור כל המסננים חמש 20 x הסריקה הכולל, 20 x מולטי ספקטריאליות הדמיה (MSI) אזורים מולטי ספקטריאליות. בחר רזולוציה פיקסל של 0.50 מיקרומטר (20 x). לשמור את הפרוטוקול ולחץ שוב כדי לחזור למסך הבית של התוכנה וקטרה; לאחר מכן, לחץ על סריקת שקופיות.
- לפתוח את הממשק עבור כל שקופית וקבע פעילות לסריקה. הגדר מחקר פיתוח לוח מולטיפלקס, מוגדר פרוטוקול 1 לוח מולטיפלקס ופקדים זרוקולאחר שקופית מזהה ערכת אבג123 ריאות מולטיפלקס, CD68 מולטיפלקס זרוק אבג123 ריאות, וכו ' . כאשר כל השקופיות סומנו כאנטי משימות מוגדרות, לחץ על סריקה. הסורק האוטומטי מולטי ספקטריאליות יבצע סריקות שקופית מלא של כל השקופיות באמצעות כל המסננים חמש.
11. מולטי ספקטריאליות סורק: הדמיות מולטי ספקטריאליות
- ברגע הסריקות הושלמו, לפתוח את התוכנה QPTIFF ("Phenochart") ולחץ על עומס שקופיות בפינה השמאלית העליונה. פעולה זו תפתח QPTIFF, וזו סריקת כל שקופית 5-מסנן. כל שכבה מכילה מידע אחד או יותר עבור חיל הים, אז השירות הוא מוגבל, אבל מבנה רקמות ודפוסים ביטוי רחב ניכרים והוא יכול לשמש כדי לבחור אזורי עבור MSI.
- נווט אל ופתח לשקופית הנכונה בחדר העבודה באמצעות עץ הנפתחת בצד השמאל. להיכנס (למעלה מימין) ראשי התיבות של המשתמש.
- בחר חמישה אזורים עבור MSI באמצעות הכלי חותמת בחלק העליון של המסך. התייעץ עם הפתולוג אם הם זמינים. תחת בחר עבור, בחר רכישה; תחת גודל שדות, בחר 1 x 1; תחת הגבלת שדה, בחר 0.5 מיקרומטר (20 x). בהתבסס על cytokeratin (CK) צביעת (בעיקר באזור Cy5), בחר במספר אזורים עם הגידול (CK +) וגם משתית (CK-) לדימות מהסריקה הכללית. חזור על הליך זה עבור כל שקופית.
- לאחר שבחרת את כל קבצי msi של, לסגור את התוכנה Phenochart ולחזור על התוכנה וקטרה . לשנות את המשימה מ סרוק ל- MSI עבור כל שקופית, לאחר מכן, לחץ על סרוק שוב לבצע את האוסף MSI.
12. ספקטרלי Unmixing
הערה: הצעד unmixing ספקטרלי נדרש עבור ערוץ ההפרדה וניתוח תמונה של השקופיות. לפני unmixing ספקטרלי מתבצע בתוכנה ידע, הספרייה ספקטרלי להיבנות באמצעות ריאות אדנוקרצינומה שקופיות מוכתם כל עבור חיל הים לבד ועם דאפי לבדה. הליך זה מתואר גם במדריך הנ ל מולטיפלקס IHC Assay פיתוח.
- עם השלמת הרכישה MSI, להשתמש בתוכנה ("ידע") unmixing ספקטרלי לפתוח קבצים בתיקיה MSI . קבצים אלה מסתיימות בסיומת סוג קובץ .im3.
- תחת תבנית תמונה, בחר Multispectral; תחת תבנית המדגם, בחר זריחה; ובחר תחת ספריית ספקטרלי מקור, ידע.
- כדי לבחור fluors, בחר ולאחר לטעון כל fluors 6, דאפי מהספריה בנוי עם ריאות אדנוקרצינומה ספריית השקופיות. לחץ על הכנת כל (השמאלי התחתון). תוכנה unmixing ספקטרלי יבצע ספקטרלי unmixing על כל התמונות פתוח, באמצעות הפרופילים ספקטרלי המוצעים.
- עם פתולוגית, להעריך את התבנית מכתימים מפני כתמים יחיד הדפסות כסף של אותו יעד בשקופיות רציפים של הרקמה זהה.
13. הערכה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית, אותות והחלשות של אותות
הערה: הכלי ספירות, המופיע כמו חץ עם חום תיבה קטנה, הוא הכלי החשוב ביותר עבור מיטוב מולטיפלקס, אמור לשמש בתדירות גבוהה (ראה תוספת חומרים). באמצעות הכלי ספירות בתוכנה unmixing ספקטרלי, להעריך את יחס אות לרעש, אשר לכל הפחות יעלה 10:1 (ראה תוספת חומרים עבור פתרון בעיות, הערכת תירגע מכתים עם הפקדים טיפה).
- 13.1. עם תמונה פתוחה בתוכנה unmixing ספקטרלי, לעסוק בכלי ספירות, סקר תמונות כדי להעריך את עוצמת קרינה פלואורסצנטית לכל ערוץ. עוצמת היעד ברקמת הריאה הוא בין 10 ל- 20 סעיפים מנורמל. הכלי ספירות מנורמל מוצג באיור1.
- הכללת שקופיות עם האות המרבי ספירות אות פחות מ 10 או רגיל עבירות שטח של פחות מ-5 עבור כל סמן כך autofluorescence מכתים את המטרה לא להתחרות עם האות אותנטי.
- אל תכלול שקופיות עם מקסימום מונה גדול מ- 30 עבור כל ערוץ למנוע דימום ספקטרלי או unmixing ספקטרלי לא יעיל.
- כתובת ספירות מנורמל גבוה או נמוך על-ידי התאמת את הריכוז TSA.
14. ניתוח תמונות מולטי ספקטריאליות
- פתח אחד או יותר MSI ספקטרלי תוכנה unmixing , fluors בחר רק עבור unmixing זה מיוצגים בתמונה פתוחה לפחות אחת. לחץ על הכנת כל כדי unmix כל התמונות הצבע הנוכחי הפתוח להניב תמונות spectrally החלקיות.
- בחרו בכלי ספירות סקר ספירת על-פני כל תמונה על-ידי ריחוף מעל area(s) של עניין.
- בחר סמל העין כדי לפתוח את עורך נוף. לבחור ולכוונן את עוצמת התצוגה של כל אחד מערוצי עצמאית.
- בחרו קביעת תצורה כדי לפתוח את פילוח רקמות, פילוח תא, phenotyping ומודולים הבקיע. כלים אלה נדרשים לשם אימות אובייקטיבית מולטיפלקס מכתים מפני כתמים יחיד הדפסות כסף והוא יכול לשמש כדי להפיק נתונים כמותיים phenoptic (איור S1).
- השתמש את ייצוא tab כדי להציל את גווני אפור, פלורסנט, לא דחוס pathview בסגנון TIFF וקבצי נתונים מן המודולים ניתוח phenoptic עוד ניתוח, אחסון בארכיון של מצגות (איור S1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר כאן יספק תוצאות כאלה באיור 2. להתחיל עם הערכה של ההכתמה של הפקד שקדים, החל האפיתל משטח תאים קשקשיים. היסטולוגיה של המדגם שקדים ניתן לסקור עם פתולוגית, באמצעות השקופית H & E כנקודת התייחסות. אם מקטעים IHC הדפסות כסף מבוצעות באמצעות הסמנים באותה רקמה באותו רחוב, ואז אלה ניתן להשתמש כדי לאשר את צפיפות, התפלגות של כל סמן בשקופית mIF. כפי שמוצג באיור 2א, רקמת שקדים צריך לספק ברורה cytokeratin AE1/AE3 מכתים באפיתל קשקשיים משטח שקדים (איור 2א; כאנטי מדומה אדום), ללא רקע הלימפה רקמות. ההכתמה צריך להיות cytoplasmic, לעיתים עם קרום נחץ, הגרעינים חייב להיות שלילי. האפיתל רשת לסופרמרקטים באולמות צריכה להיות חיובית עבור cytokeratins (אדום) ו- PD-L1 (איור 2א; מדומה ירוק). המרכזים נבטי הזקיקים של שקדים, ואז, לזהות. המרכזים נבטי צריך להיות קל לזיהוי, צריך להיות עשיר ב- Ki-67-חיוביות לימפוציטים (איור 2א; מדומה צהוב). Ki-67 מכתים צריך תמיד להיות גרעיני. המקרופאגים נוכח במרכזים נבטי גם צריך להיות קל לזיהוי, לפעמים כמו תאים גדול יותר (נקרא גם "גופים tingible"). הם יציגו חיובי צביעת עבור CD68 כמו כתם cytoplasmic פרטנית (איור 2א; מדומה תפוזים). שיעור משתנה של תאים CD68 מחוץ למרכזי נבטי הוא גם היה צפוי. מקרופאגים עשוי להראות ממברנה צביעת עבור PD-L1. . זה בדרך כלל חיוורת בעוצמתם צביעת עבור PD-L1 ב רשת לסופרמרקטים האפיתל. צריך להיות CD68 גרעיני לא מכתים. CD8 צריך כתם לימפוציטים עם התפלגות T-cell (פחות מרכזי נבטי, חלק גדול יותר באזורים interfollicular; ראה איור 2א, מדומה ציאן). CD8 + לימפוציטים הם תאים קטנים בד עם ציטופלזמה לתהודה, אז זה כמעט בלתי. אפשרי להבחין ממברנה לעומת הציטופלסמה של לימפוציטים. PD-1 בתוקף אכתים לימפוציטים קטנים באזור מרכז נבטי, בדרך כלל מקובצים באשכולות בפריפריה המרכזים נבטי (איור 2א; מגנטה מדומה), כמו גם מפוזרים לימפוציטים באזור interfollicular, בדרך כלל מראה של עוצמת מכתימים נמוכה יותר מאשר אלה באזור מרכז נבטי. כמו עם CD8, זה לא אפשרי להבחין בבירור ממברנה, צביעת cytoplasmic לימפוציטים קטנים מוכתם PD-1. מכיוון שיעור משתנה של תאי CD8 coexpress PD-1, מומלץ לצורך בקרת איכות צביעת דפוס והפצה של כל סמן זה יהיה מוכתם ברקמות זהה שניתן להשוותו הדפסות כסף שקופיות הפניה IHC, כפי שהוצע פרוטוקולים שפורסמו בעבר12.
לאחר צביעת הדפוס הצפוי אושרה בפקד רקמת שקדים, להמשיך להעריך את ההכתמה במדגם סרטן ריאות (איור 2B). בגלל גידול רקמות צפויים להראות ביטוי משתנה, הטרוגניות של הסמנים, חשוב מאוד במהלך אופטימיזציה של פאנל mIF חדש כדי להשוות את התבנית מכתימים עבור כל סמן בודדים נצפו השיטה mIF לבין ביטויה נצפתה סטנדרטי הדפסות כסף IHC בשקופית, הערכת כמות והפצה של תאים חיוביים כמו שתואר לעיל12. בכל זאת, צריך להישמר מכתימים התבנית הבסיסית; לדוגמה, cytokeratins להתייחס בציטופלסמה של תאי אפיתל, מעולם לא גרעין; CD68 אמור להופיע בתור מכתים cytoplasmic פרטנית ב מקרופאגים, ועוד. חשוב לציין, לכמה נקודות ציון, עוצמת מכתימים עשויות להשתנות מהפקד שקדים רקמת סרטן; לדוגמה, PD-1 ו- PD-L1 יכולה להראות נמוך עוצמה להכתים ברקמת הגידול לעומת הביטוי גבוהה מאוד נצפתה בשליטה שקדים. חשוב, לכן לבצע את ההערכה ואת אופטימיזציה בעזרת הכלי סעיפים בהתוכנה ידע, באמצעות דוגמאות של גידול רקמות מאשר את הפקדים שקדים.
לבסוף, isotype-שלילי הפקדים ופקדי ירידה צורך להעריך, לא רק עבור זיהוי הרקע ואת autofluorescence, אלא גם עבור אפקטים מטריה וגלישה ספקטרלי (איור 3 ו- 4 באיור). Isotype פקדים לא לבטא את כל immunostaining לרוחב השקופית; אם כל מכתים נצפית, ואז ההדמיה או צביעת הליך חייב לערער ירידה הבקרות חשוב להעריך את פוטנציאל חפצים ב ההכתמה, כגון אפקטים הבליד או מטריה ספקטרלי, בשל פעולת mIF במהלך אופטימיזציה של פאנל מולטיפלקס חדש (ראה איור 5, S2 איור משלים, איור משלים S3, ואת תוספת חומרים). פקדים monoplex ושחרור פלורסנט צריך להיות מוערכים, לעומת הלוח מלא זמנית. כל פקד טיפה צריך להראות אותו דפוס מכתימים. חוץ נוגדן ראשוני יחיד, אשר יוסר על כל פקד מסוים. פרטים נוספים ניתנים בסעיף תוספת חומרים .
איור 1 : ליידע את הכלי שנחשב. הכלי ספירות ידע תוכנות מופעל על-ידי בחירה בסמל תיבת בז. מנורמל ספירות מתוקנות עומק סיביות, זמן החשיפה, רווח של binning. התמונות צולמו בהגדלה X 20; סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תוצאות נציג. קרצינומה של תאים nonsmall ריאות שקדים (A) ו- (B) היו מוכתמים PD-L1 (520 TSA, ירוק), CD8 (540 מהטי ציאן), Ki67 (570 TSA, צהוב), CD68 (620 TSA, כתום), cytokeratin (650 TSA, אדום), ו- PD-1 (690 TSA, מגנטה). ערוצים בודדים מיוצגים בנפרד להלן לוחות קטנים. דה מרקר מסומן בפינה הימנית העליונה של כל תמונה. התמונות צולמו בהגדלה X 20; סרגל קנה מידה = 50 (או 250 מיקרומטר). המצוין בלוח A הן 1) זקיקי הלימפה, מרכז נבטי 2), אזור 3) interfollicular, מרובדת 4) אפיתל קשקשיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : אפקט חוסם/מטריה TSA- זוהי דוגמה של 690 TSA שהופקדו על ידי PD-1 חוסם נוגדן CD3 אות באופן תלוי כמות TSA הנוכחי. האות TSA 690 המבריקים חוסם את האות TSA 620 בצורה היעילה ביותר (קרצינומה של תאים nonsmall ריאות צבעונית עם אנטי-PD-1 D4W2J למשך 30 דקות-0.52 µg/mL או isotype אחריו על ידי זיהוי TSA 10 דקות 690-1: 100; ואז, אנטי-CD3 F7.2.38 למשך 30 דקות ב- 0.14 µg/mL ואחריו 10 דקות 620 זיהוי TSA-1: 100). התמונות צולמו בהגדלה X 20; סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : בליד ספקטרלי. רקמת הריאה nonsmall-תא קרצינומה הוכתם פרוטוקול בקרת ירידה Ki-67 (פרוטוקול מולטיפלקס להשלים עם נוגדן Ki-67 הושמט). הערוץ TSA 540 (CD8) וערוץ 570 TSA (Ki-67) מוצגים. אין דפוס מכתימים גרעיני הוא לכאורה, עדיין עותק מופחתת של CD8 צביעת דפוס נצפית בערוץ TSA 570. הכי טוב זה נשלח על ידי הבטחת דומות מכתימים עוצמות של כל הערוצים. במקרה זה, התוספת של אות Ki-67 חזקים (מנורמל ספירות בין 10 ל- 20) יתקן את הדימום ספקטרלי. התמונות צולמו בהגדלה X 20; סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : להוריד פקדים. איור זה מציג תמונה מורכבת של מלא מולטיפלקס לעומת באותו האזור של שקופיות רציפה של ריאות אדנוקרצינומה צבעונית עם פקדים טיפה שבו הושמט הנוגדן ראשי המצוין. התמונות צולמו בהגדלה x 20; סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שם | שם רשות | סוג | מיכל | קבוצה |
| מאגר חסימת PKI | OPALBLOK | חיובים משניים | לפתוח 30 מ | כללי |
| אופאל פולימר HRP | אופאל 2AB | חיובים משניים | לפתוח 30 מ | כללי |
| אופל 1 x TBS | OPAL1TBS | חיובים משניים | לפתוח 30 מ | ערכת כבלש |
| CD68 0.30 µg/mL PG-M1 Mus | OPALCD68 | חיובים משניים | פתח 7 mL | כללי |
| ki67 0.61 µg/mL MIB-1 Mus | OPALki67 | חיובים משניים | פתח 7 mL | כללי |
| PD-L1 0.20 µg/mL SP263 ראב | OPALPDL1 | חיובים משניים | פתח 7 mL | כללי |
| PD-1 0.52 µg/mL D4W2J ראב | אופל PD1 | חיובים משניים | פתח 7 mL | כללי |
| CD8 0.70 µg/mL SP239 ראב | אופאל CD8 | חיובים משניים | פתח 7 mL | כללי |
| CK 0.24 µg/mL AE1/AE3 Mus | אופאל CK | חיובים משניים | פתח 7 mL | כללי |
| העכבר אג | אופאל MUS | חיובים משניים | פתח 7 mL | כללי |
| ארנב אג | אופאל ראב | חיובים משניים | פתח 7 mL | כללי |
| אופאל Peroxidase בלוק | OPALPERX | חיובים משניים | פתח 7 mL | כללי |
| דאפי ספקטרלי | OPALDAPI | חיובים משניים | טיטור 6 מ ל | כללי |
| ריאגנט אופאל 520 | אופאל 520 | חיובים משניים | טיטור 6 מ ל | כללי |
| ריאגנט אופאל 540 | אופאל 540 | חיובים משניים | טיטור 6 מ ל | כללי |
| ריאגנט אופאל 570 | אופאל 570 | חיובים משניים | טיטור 6 מ ל | כללי |
| ריאגנט אופאל 620 | אופאל 620 | חיובים משניים | טיטור 6 מ ל | כללי |
| ריאגנט אופאל 650 | אופאל 650 | חיובים משניים | טיטור 6 מ ל | כללי |
| ריאגנט אופאל 690 | אופאל 690 | חיובים משניים | טיטור 6 מ ל | כללי |
טבלה 1: לייקה בונד RX פרוטוקול, ריאגנטים האופל
| מגיב | הזמן (h) | טמפרטורה (מעלות צלזיוס) | |
| 1 | לא מגיב | 120:00 | 60 |
| 2 | בונד Dewax פתרון | 0:30 | 72 |
| 3 | בונד Dewax פתרון | 0:00 | 72 |
| 4 | בונד Dewax פתרון | 0:00 | אמביינט (טמפרטורת החדר) |
טבלה 2: אופל הכנת פרוטוקול
| היעד | µg/mL | שיבוט | מקור | הרבה | µG מניות/mL | µL diluent | ΜL אלב |
| CD68 | 0.3 | PG-M1 | Dako | 20043031 | 30 | 2376 | 24 |
| ki67 | 0.61 | MIB-1 | Dako | 20049476 | 46 | 2368.17 | 31.83 |
| PD-L1 | 0.2 | SP263 | אוורור. | F09591 | 1.61 | 2101.86 | 298.14 |
| PD-1 | 0.52 | D4W2J | CST | 1 | 100 | 2387.52 | 12.48 |
| CD8 | 0.7 | SP239 | Ventana | 160318 | 70 | 2376 | 24 |
| CK | 0.24 | AE1/AE3 | Dako | 10129428 | 179.5 | 2396.79 | 3.21 |
| Mus אג | 0.61 | ||||||
| ראב אג | 0.7 |
טבלה 3: הכנת נוגדנים העיקרי.
| אופאל עבור חיל הים | שקופיות | דילול | µL diluent | µL האופל עבור חיל הים |
| אופאל 520 | 16 | 1:200 | 2736.3 | 13.8 |
| אופאל 540 | 16 | 1:700 | 2746.1 | 3.9 |
| אופאל 570 | 16 | 1:150 | 2731.7 | 18.3 |
| אופאל 620 | 16 | בטחונות | 2722.5 | 27.5 |
| אופאל 650 | 16 | 1:350 | 2742.1 | 7.9 |
| אופאל 690 | 16 | 1:150 | 2731.7 | 18.3 |
טבלה 4: אופל הכנה עבור חיל הים.
מסמך Word גשמי משלימה: אנא לחץ כאן כדי להוריד מסמך זה.
משלימה איור 1: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלימה איור 2: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלימה איור 3: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלימה טבלה 1: לייקה בונד RX אופאל מולטיפלקס פרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.
משלימה בטבלה 2: סיכום והשוואה בין אולמות הקולנוע מלא, פקדי טיפה ופקדים מלא isotype. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המהפכה חיסוני סרטן מתמשך הוא פתיחת הרומן ומבטיח אפשרויות טיפוליות עבור חולי סרטן13. ההתקדמות בתחום חיסונית-אונקולוגיה דורשים ידע מוגברת של microenvironment גידול דלקתי, לא רק כדי להבין את הביולוגיה של מנגנוני החיסון המעורבים carcinogenesis, אלא גם למצוא חזוי סמנים ביולוגיים חדשים חיסוני מבוססי טיפולים1,2. בשל מורכבות הביולוגיה של הסרטן אימונולוגיה, חקירתו של דגימות רקמה הגידול בדרך כלל נדרש לפתח הרשימה המתארכת של סמני המערכת החיסונית, אשר לתקשר אחד עם השני, הם לעתים קרובות coexpressed על ידי אוכלוסיות מגוונות תא ברקמה1 ,2,5. ניסויים קליניים בדרך כלל מעסיקים ביופסיות קטנים, כגון מחט הליבה או ביופסיות אנדוסקופי, אשר נאספו בנקודות שונות של טיפול כדי להעריך ולפקח על התגובה המטופל. ביופסיות כאלה מספקים כמויות מוגבלות של רקמות, אשר בתורו מגבילה את מספר מקטעי רקמת זה יכול להיות מועסק על סרטן immunoprofiling. מגבלה זו היא שנלווים במיוחד כאשר בטכניקות מסורתיות, כגון תקן monoplex IHC, משמשים. יש, לכן, ברור צריך שיטות חדשות לטיפול בסרטן immunoprofiling שגורמים לשימוש של טכניקות מולטיפלקס עם היכולת להעריך את coexpression של סמנים ביולוגיים שונים בו זמנית, לעשות שימוש יעיל יותר של דגימות רקמה יקרי ערך.
צביעת מולטיפלקס, מולטי ספקטריאליות שיטות הדמיה תיאר בפירוט כאן, משמש לוח mIF חיסונית-אונקולוגיה מחקרים על FFPE רקמות כגון ביופסיות מן בניסוי קליני. בשיטה זו יש שתואר קודם לכן, לאמת, הוחלו בהצלחה סרטן immunoprofiling8,9,10,11,12,14, 15. פרוטוקולים שפורסמו בעבר תיארו mIF דומה מכתים שיטות עם מערכות מבוססות-TSA, כגון ערכת 7-צבע, אשר הוא זמן רב ודורש כ 4 ימים של עבודה על ידי מדען מעבדה ייעודית12 ,15. בתגובה חסרונות אלה, פרוטוקול זה מוטבה באמצעות זמינים מסחרית אוטומטיות הוספת גוון לסמלים, קיצור דרמטי מכתים לשהות 14 h ולהיפטר השונות שהוצגו על ידי מפעילי ידנית. הדמיה מתנהל על סורק מולטי ספקטריאליות מסוגל להפריד את הספקטרום של אותות פלואורסצנט שבעה או יותר בשקופיות מולטיפלקס, כולל autofluorescence, אשר ניתן להסירו ביעילות מבלי לפגוע באיכות האות. פרוטוקול זה יכול להיות משוכפלת, שונה, המבוצעת על-ידי כל משתמש מעבדה עם גישה כלי נגינה, ריאגנטים מפורט בטבלה של חומרים.
השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הינם סעיפים 7, 10, 11, 12. בסעיף 7 מתייחס הכנת נוגדנים. קורס הכנה זהירה של ריאגנטים צביעת מולטיפלקס היא חיונית, הדורשים את תשומת הלב ממוקדת של המעבדה מדענית או טכנאי כדי להימנע תלוי המפעיל וריאציה. למשל, אחת הבעיות הגדולות עם השיטה מולטיפלקס מכתימה השתנות, אשר יכול להיות מופחת על ידי הכנת דילולים של ריאגנטים, במיוחד צבעי TSA זהיר. ייבוא תמונות קשורות סעיפים 10 ו-11. סיכון חשוב הוא חשיפת יתר או oversaturation של התמונות, דבר שעלול להוביל ספקטרלי לדמם, חפץ שבו האות מערוץ אחר משבשת הערוץ להיות עם תמונה (ראה תוספת חומרים). בזהירות המסדיר את פעמים חשיפה שיכולים לסייע לך למנוע oversaturation וגלישה ספקטרלי. Unmixing ספקטרלי מבוצע במסגרת סעיף 12. זה מסתמך על ההכנה של הספרייה ספקטרלי (המתוארים במדריך מולטיפלקס IHC Assay פיתוח, זמין באינטרנט). בשלב זה, התוכנה ידע "מאומן" להכיר את הצבעים עבור כל צבע TSA במיוחד. הספרייה ספקטרלי שנוצרו באמצעות מקטעים של טישו בקרה, כגון שקדים אנושי, מוכתם סמן ביטוי בצורה אחידה, כגון CD20, יחד עם כל צבע TSA נפרדים בשקופיות נפרדות. בנוסף, שקופיות autofluorescence (גם המתוארות מולטיפלקס IHC Assay פיתוח המדריך) יש צורך להכשיר את התוכנה ידע לזהות ולחסר רקמות autofluorescence. Autofluorescence הבקרה שקופיות צריך להיות שהוכנו על ידי באמצעות דגימות מן הרקמות באותו נחקר (כגון סרטן הריאות, וכו '), טיפל באותה צורה השקופיות mIF, מודגרות עם נוגדנים והמשניים אבל בלי לצבוע TSA. רק autofluorescence אחד פרופיל הספקטרלי ניתן לבחור, אז חייבים להקפיד לבחירת ייצוג של autofluorescence הנצפה אשר עשוי לבוא קולגן, פיברוזיס, כדוריות דם אדומות, פיגמנטים אנדוגני, מקורות אחרים. יצירת ספריה ספקטרלי חדש בתחילת כל פרויקט חדש באמצעות ספקטרום של autofluorescence אשר הוא נציג של דגימות רקמה המחקר, כמו גם מפעיל את גושי רקמה באותו של הפקד חיובי עבור כל אצווה בתוך אותו פרוייקט, הם צעדים מתודולוגי יקר שיעזרו לשפר את מרקם של הפירוק הספקטרלי unmixing מדגמים שונים בתוך אותו פרוייקט.
מולטיפלקס השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה מציע מספר כלים לפתרון בעיות, כולל של המאבחן אות לרעש (כלי ספירות), ירידה פקדים (תוספת חומרים) תצוגה פתולוגיה עבור בקרת איכות של ההכתמה. הכלי ספירות מסייע להעריך את עוצמת ההכתמה ואת רמת של הרקע. אם עוצמת ו/או רקע רמות גבוהות, הגישה הראשונה היא לצמצם את הדילול של לצבוע TSA. אם הבעיה נמשכת, יש להותירה השקופיות IHC הדפסות כסף המשמש עבור אופטימיזציה של הטוש מסוים עם פתולוגית, מחפש את הנוכחות של הרקע. הנוף פתולוגיה נוצר על ידי התוכנה ידע, באמצעות ייצוג מדומה, כמו diaminobenzidine של זריחה מ עבור מקושרים-TSA חיל הים, כמו גם ייצוג hematoxylin מלאכותי שנוצר מתוך כל אותות פלואורסצנט, כולל דאפי . תמונות מתצוגת פתולוגיה עזרה בהערכת חזותי של הדפוסים מכתימים על ידי פתולוג עבור צביעת משופרת. כלים אלה צריך תמיד להיות מועסק במהלך אופטימיזציה של פאנל חדש וכן צעדים בקרת איכות במהלך זרימת העבודה מוכתמים.
השיטה mIF מחייב השימוש של נוגדנים הראשי יש כראוי לאמת, אופטימיזציה עבור תקן IHC הדפסות כסף על רקמות פורמלין-קבוע. למשל, אחד היתרונות הגדולים של השיטה TSA mIF הוא התאימות שלו עם השימוש העיקרי נוגדנים מאומת וממוטב במעבדה לפתולוגיה אנטומיים שימוש קליני12. יתרון זה אומר כי הלוחות מולטיפלקס יכול להיות מותאם אישית על ידי המשתמש מעבדה לענות על שאלות אימונולוגיה סרטן ספציפיים ללא צורך נוגדנים preconjugated, מתן מהירה ודינמית פאנל פיתוח. בהקשר זה, זרימת העבודה בפועל עבור אופטימיזציה של פאנל חדש מתחיל עם אימות, אופטימיזציה של הנוגדנים עם IHC הדפסות כסף רגיל, מחפש דילול הטוב ביותר והוא מכתים את התנאים אשר יספקו נקי ועקבית מכתים. השלב הבא, שימוש של דילולים באותו אופטימיזציה עבור IHC, הוא להעביר את ההכתמה באמצעות TSA fluors במקום diaminobenzidine, להשוות את התוצאות של monoplex TSA immunofluorescent עם IHC הדפסות כסף כהפניה. לבסוף, הנוגדנים, ניתן לשלב mIF מכתים, תמיד באמצעות את IHC הדפסות כסף מכתים דפוס כהפניה בקרה להתאמת mIF TSA מכתימים הפרמטרים, בעיקר של דילולים לצבוע TSA ואת הרצף מוכתמים. במהלך תהליך זה, שיתוף פעולה עם הפתולוג הוא אינסטרומנטלי כדי להעריך את איכות ההכתמה.
מגבלות של טכניקה זו כוללים את הזמן והמאמץ הנדרש עבור אופטימיזציה ו אימות של פאנלים חדשים וניתוח immunophenotyping של לוחות mIF. החשש המרכזי, אולם, היא האימות המתאים של שיטות mIF. חוסר אימות תקינה של טכניקות אלה נושאת את הסיכון של יצירת תוצאות לא חוקיים, אשר יכול להוסיף נתונים מבלבל בספרות, ובכך פוגע ניסיונות להשיג הבנה טובה יותר של הביולוגיה של הסרטן אימונולוגיה16. זה, לכן, שחובה על החוקר לעשות כל מאמץ כדי לאמת כהלכה את שיטות מולטיפלקס, כולל השתתפות קרוב מבטיחות כי הערכה על ידי פתולוגים בעלי הכשרה וניסיון באימות והערכה של רקמות histopathology, טכניקות מבוססות IHC17,18,19,20. פרוטוקול המוצג כאן כולל כמה כלים שיכולים לעזור עם האימות של פאנל מולטיפלקס חדש, כולל הערכת פתולוגיה שקופיות H & E לפני צביעת וניתוח, השימוש IHC הדפסות כסף כהפניה כדי למטב את mIF TSA מכתים, את שיטת הבקרה טיפה עבור בקרת איכות חדש מגה-פלקס לוח, ושימוש isotype, autofluorescence, ושחרר את הפקדים. למרות המורכבות הטכנית של שיטות mIF, טכנולוגיות כגון הדמיה מולטי ספקטריאליות עם unmixing ספקטרלי, כמו גם פלטפורמות מולטיפלקס, הרומן השני פותח עידן חדש של הניתוח של דגימות רקמות מחולים, הדור של צורות חדשות נתונים זה לא אפשרי עם תקן IHC לבד. לפיכך, פיתוח, יישום של טכניקות mIF ימשיך לגדול, להיות כלים רבי-עוצמה immunoprofiling סרטן של ביופסיות ניסויים קליניים, עוזר לזהות סמנים ביולוגיים חדש multiparametric חזוי, עבור חיסוני, הנהנה, ומעל לכל, החולה בסרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
עבודה זו נתמכה על ידי MedImmune, תכשירים הכללית R & D זרוע של חברת AstraZeneca. . סי-וו, K.R. ו- C.C.H. הם עובדים של מין הולל אלמר, אשר מייצר את ריאגנטים (TSA קיט) וסורקים מולטי ספקטריאליות ששימשו בעבודה זו. טרשת נפוצה, ארגז, A.H., W.Z., Bagnall ג, ג בראון, ג'יי, א. ל, K.S., M.R. ו J.R.C. עובדים של MedImmune עם בעלות מניות ו/או אינטרסים מניות או אפשרויות בחברת AstraZeneca.
Acknowledgments
תמיכה העריכה סופק על ידי דבורה Shuman של MedImmune.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
