Summary
Un protocollo dettagliato per un pannello indicatore di sei multiplex immunofluorescenza è ottimizzato ed eseguito, utilizzando un coloratore automatico per risultati più coerenti e un tempo di procedura più breve. Questo approccio può essere adattato direttamente da qualsiasi laboratorio per studi di immuno-oncologia.
Abstract
Continui sviluppi in immuno-oncologia richiedono una maggiore comprensione dei meccanismi di immunologia del cancro. L'analisi di immunoprofiling dei campioni di tessuto da biopsie (FFPE) formalina-fisso e paraffina-incastonato è diventata uno strumento fondamentale per la comprensione della complessità dell'immunologia dei tumori e alla scoperta di nuovi biomarcatori predittivi per immunoterapia del cancro. Immunoprofiling analisi dei tessuti richiede la valutazione degli indicatori combinati, compreso sottopopolazioni delle cellule infiammatorie e immunitarie Checkpoint, nel microambiente tumorale. L'avvento dei metodi immunohistochemical multisala romanzo consente una più efficiente analisi multiparametrica delle sezioni del tessuto singolo rispetto a standard Levansucrasi immunohistochemistry (IHC). Una immunofluorescenza multiplex disponibile in commercio (se) metodo è basato sull'amplificazione del segnale di microarray e, combinato con l'analisi al microscopio multispettrale, consente una migliore separazione del segnale dei diversi marcatori nel tessuto. Questa metodologia è compatibile con l'uso di anticorpi primari non coniugati che sono state ottimizzate per standard IHC su campioni di tessuto FFPE. Qui descriviamo dettagliatamente un protocollo automatizzato che consente multiplex se etichettatura dei campioni di tessuto di carcinoma con un pannello di sei-marker della malattia multisala composta da PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 e i cytokeratins AE1/AE3 con 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole come una colorazione nucleare delle cellule. Il protocollo di pannello multiplex è ottimizzato in un coloratore automatico di IHC per un tempo di colorazione che è inferiore a quella del protocollo manuale e può essere direttamente applicato e adattato da qualsiasi ricercatore di laboratorio per gli studi di immuno-oncologia su campioni di tessuto umani FFPE. Sono anche descritti diversi controlli e strumenti, tra cui un metodo di controllo di goccia per controllo di qualità fine di un nuovo pannello se multiplex, che sono utili per l'ottimizzazione e convalida della tecnica.
Introduction
Immunoprofiling analisi dei campioni di tessuto tumorale FFPE è diventata una componente essenziale degli studi di immuno-oncologia, in particolare per la scoperta e validazione di nuovi biomarcatori predittivi per immunoterapia del cancro nel contesto di studi clinici1 ,2. Cromogenico IHC, utilizzando cromogeni chimici quali diaminobenzidina, rimane la tecnica standard in patologia diagnostica per il immunolabeling di biopsia del tessuto3. IHC standard può essere utilizzato anche per il cancro del tessuto immunoprofiling, compresa la quantificazione delle sottopopolazioni dei linfociti tumore-collegati e la valutazione dei livelli di espressione di checkpoint immuni come ligando di morte programmata delle cellule 1 (PD-L1)4 ,5. IHC standard è limitata, tuttavia, in quanto solo un antigene possa essere etichettato per ogni sezione del tessuto. Perché gli studi immunoprofiling in genere richiedono l'analisi dell'espressione combinata di parecchi indicatori, l'uso di IHC standard richiederebbe la colorazione di sezioni di tessuto più, ciascuno macchiato con un singolo marker e, pertanto, sarebbe limitata sostanzialmente per l'analisi di piccoli campioni di tessuto quali le biopsie dell'ago di nucleo. Metodi standard di IHC sono anche limitati per la valutazione degli indicatori che sono coespressi di popolazioni di cellule diverse, come è comune con gli indicatori checkpoint immuni quali PD-L1, che è espresso da macrofagi associati al tumore e cellule tumorali. Questa limitazione è stata segnalata in, ad esempio, l'uso di standard Levansucrasi IHC dai patologi per l'analisi quantitativa di un marcatore IHC espresso dalla cella diversi tipi6. Lo sviluppo di tecniche IHC cromogenici multiplex che impiegano diversi cromogene colorate sulla stessa tessuto sezione rappresenta un avanzamento sopra il metodo standard di Levansucrasi IHC,7 anche se rimangono limitato dalla immunolabeling di pochi marcatori e presenti anche un'importante sfida tecnica per la corretta valutazione di marcatori espressi nei compartimenti subcellulari stessi delle stesse popolazioni cellulari.
Le suddette avvertenze relative alla disponibilità di tessuto da campioni clinici, così come le limitazioni delle multisala cromogenici tecniche IHC, hanno dato origine alla necessità di sviluppare metodi migliori multisala per studi di immuno-oncologia basati su Contrassegno fluorescente combinati con sistemi che possono efficacemente separare i segnali di fluorofori più dalla stessa diapositiva di imaging. Una tale tecnica è basata sull'amplificazione di segnale di microarray (TSA) combinato con formazione immagine di microscopia multispettrali per colore efficiente separazione8. Un kit disponibile in commercio basati su TSA impiega fluorofori ottimizzato per imaging multispettrale8 (Vedi Tabella materiali). Un vantaggio fondamentale di questo sistema è la sua compatibilità con gli anticorpi primari senza etichetta stessi che già sono stati convalidati e ottimizzato per standard cromogenico IHC9,10,11. Questo consente non solo di ottimizzazione più veloce ma anche di flessibilità le modifiche al pannello e ottimizzazione che incorporano nuovi obiettivi. Inoltre, il metodo di immunofluorescenza multiplex (mIF) TSA può essere ottimizzato per commercialmente disponibili sistemi automatizzati di stainer IHC, consentendo per un semplice trasferimento da Levansucrasi cromogenico IHC MIF.
Qui presentiamo un protocollo per un pannello di mIF per studi di immuno-oncologia che si basa su mIF TSA colorazione automatizzata e utilizza uno scanner multispettrale per l'imaging. Questo protocollo può essere adattato e modificato da qualsiasi utente di laboratorio con accesso alla strumentazione descritta e reagenti. Il protocollo include un pannello di sei anticorpi primari per l'immunoprofiling dei carcinomi: PD-L1, PD-1, CD68 (come marcatore pan-macrofago), CD8 (cellule T citotossiche), Ki-67 e AE1/AE3 (vaschetta-cytokeratin, utilizzato come indicatore epiteliale per l'identificazione di cellule di carcinoma). Un recente studio descrive l'ottimizzazione di un protocollo di mIF TSA manuale utilizzando cromogenico IHC come uno standard di riferimento per convalidare il multiplex macchiatura12. Il metodo aggiornato qui presentato è stato sviluppato utilizzando un kit TSA commercialmente disponibili, sette colori ottimizzato in un coloratore automatico, accorciando drasticamente il tempo di colorazione da 3 – 5 giorni alle 14h, migliorando anche la consistenza della colorazione. Oltre al protocollo principale dettagliato presentato qui, una sezione di Materiali supplementari include il metodo "goccia-control", un processo di ulteriore controllo di qualità per valutare un nuovo pannello di mIF, come pure le note tecniche per l'ottimizzazione, risoluzione dei problemi e lo sviluppo di nuovi pannelli multiplex per aiutare l'utente di laboratorio per configurare e ottimizzare il metodo TSA mIF per pannelli personalizzati mIF.
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Protocol
Nota: Il protocollo presentato qui viene descritto come eseguire la immunoprofiling di un pannello di mIF utilizzando TSA per sei anticorpi (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 e AE1/AE3) su un coloratore automatico (Vedi Tabella materiali). Il protocollo descrive anche come eseguire i controlli di trascinamento per un controllo di qualità di un nuovo pannello di mIF (Vedi Materiali supplementari). In questo protocollo, la colorazione viene eseguita con FFPE otto vetrini dalla tonsilla umana (controllo positivo) e otto vetrini da adenocarcinoma del polmone umano. La prima diapositiva viene utilizzata per intero multiplex macchiatura con tutti i sei indicatori, la seconda diapositiva per il controllo di isotipo in cui non sono utilizzati anticorpi primari e le rimanenti sei diapositive per i controlli di goccia (Vedi Materiali supplementari). Un ulteriore controllo per tessuto autofluorescenza è altamente consigliato e dovrebbe sempre essere inclusi in un multiplex di studio (Vedi Materiali supplementari). Tuttavia, gli investigatori possono impiegare altri tipi di tumore e controlli secondo i propri obiettivi di progetto. Utenti di laboratorio senza precedente esperienza con il metodo TSA di mIF e tecniche dello scanner multispettrali dovrebbero leggere la Guida di sviluppo di IHC Multiplex (disponibile online su http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Sebbene questa guida descrive un protocollo manuale, ma fornisce anche una buona introduzione per il mIF metodo di colorazione. Tutte le sezioni di tessuto impiegate in questo protocollo sono stati resi anonimi e omologate secondo la dichiarazione di Helsinki.
1. campioni di tessuto
- Selezionare un campione di tonsille umano FFPE contenente l'iperplasia linfoide da utilizzare come controllo positivo e un campione di adenocarcinoma del polmone umano FFPE notoriamente PD-L1 positivo. Esaminare i vetrini ematossilina ed eosina (H & E) i blocchi di cancro del polmone selezionato per confermare la presenza di un tumore. È importante evitare i tumori con abbondanti aree di necrosi, come questo può aumentare la colorazione di fondo non specifici.
Nota: Per questa ottimizzazione, evitare l'utilizzo di blocchetti di paraffina che sono stati conservati per 10 anni o più e tessuto con un'apparenza secco nel blocco di paraffina (consultare un tecnico di istologia). - Con un microtomo, tagliare 10 sezioni seriali consecutive da ogni blocco, 4 µm di spessore. Montare le sezioni su un vetrino positivamente utilizzato per IHC, una sezione per ogni diapositiva.
Nota: Sezioni devono essere montati perfettamente piatto, senza rughe, come le rughe possono generare artefatti di colorazione. Le diapositive delle sezioni seriali da 1 a 10 il numero. - Preparare una nuova diapositiva di H & E sulla prima sezione. Esaminare il vetrino H & E con l'aiuto di un patologo per confermare la presenza di tumore del polmone o del tessuto di tonsilla rimanente nel blocco.
Nota: Questa diapositiva H & E può aiutare, più tardi, con la selezione delle regioni di interesse per l'analisi multispettrali e phenotyping. - Conservare le sezioni non macchiate in una scatola di plastica slide a 4 ° C fino a tre mesi.
2. creazione di un nuovo mIF programma di colorazione su un coloratore automatico: registrazione dei reagenti
Nota: I reagenti devono essere aggiunto all'elenco di reagente nel software coloratore automatico prima che siano disponibili per l'uso nei protocolli. Vedi la Tabella materiali per informazioni sul coloratore automatico modello e versione del software.
- Fare clic sulla scheda reagenti all'interno del software coloratore automatico. Fare clic su Aggiungi per designare un nuovo reagente. Immettere il nome (ad es., "520 TSA reagente") e il nome abbreviato (ad es., "TSA 520"), notare che c'è un massimo di otto caratteri. Selezionare Accessori dal menu a discesa e impostare il fornitore. Non modificare Singola/doppia macchia da Single/sequenziale DS. Impostare il valore predefinito protocollo a F protocollodi colorazione. Impostare il protocollo HIER predefinito a ER1 20.
- Salvare il nuovo reagente e ripetere il passaggio 2.1 per tutti i reagenti elencati nella tabella 1.
3. automatizzato Stainer: Registrazione dei contenitori
- Scrivere il nome del reagente per essere utilizzato sul lato di ogni contenitore. Eseguire la scansione del codice a barre sul lato. Nella finestra a comparsa, selezionare il reagente corretto dall'elenco. Selezionare una data di scadenza e salvare.
- Ripetere la procedura nel passaggio 3.1 per tutti i reagenti elencata nella tabella 1.
- Registrare il Kit Open Research. Entrambi i codici a barre dal lato il kit di scansione e seguire le istruzioni visualizzate sullo schermo. Nome il kit "Multiplex ricerca Kit 1". Registrare il 1 x tris (idrossimetil) amminometano (Tris)-soluzione tampone come parte di questo kit (tabella 1).
4. automatizzato Stainer: Creazione di un protocollo programma mIF
- Il protocollo base multisala è precaricato con il nome Opal 7 Multiplex con nuovi coloratori automatici (Vedi il modello e versione del software nella Tabella materiali). Individuare il protocollo filtrando per «tutti» invece di «preferito» sullo schermo di protocollo. Se il protocollo di base non è presente, quindi di aggiornare il software coloratore automatico con assistenza al produttore.
- Tutte le modifiche devono essere effettuate sulle copie del protocollo originale. Prima di apportare modifiche, salvare l'originale e creare una copia facendo clic sulla scheda protocolli , quindi clic destro il protocollo Opal 7 Multiplex e selezionando copia.
- Modificare il nome di protocollo 7 Multiplex 1 nella nuova finestra e selezionare la scheda connessa con il dispositivo corretto (modello da pavimento o da tavolo). Corrispondere il protocollo supplementare tabellaS1. Fare clic su Aggiungere Reagente per aggiungere un passaggio di inibizione di perossidasi di 10 min (non fa parte del protocollo standard) e selezionare l'inibitore perossidasi come il reagente.
- Confermare che la procedura di blocco utilizza un tampone bloccante PKI. Assicurarsi che ogni anticorpo primario riferimento al reagente appropriato, che i passaggi di anticorpo secondario utilizzano un polimero HRP, e quello spettrale 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) fornito con il kit di automazione multispettrali è utilizzata. Confermare tutte le scelte controllando il reagente che è stato designato per ogni rispettivo passaggio nel menu a discesa sullo schermo di protocollo.
5. automatizzato Stainer: Aggiunta di controlli Drop e Isotype Control Protocol
- Copiare il nome protocollo 7 Multiplex 1 e modificarlo in 7 protocollo Multiplex 1 CD68 DROP. Modificare il reagente anticorpo CD68 Mouse IgG e salvare il protocollo.
- Creare più sei nuovi protocolli, uno per ogni controllo di goccia e uno per il controllo completo dell'isotipo (cambiando tutti gli anticorpi per l'appropriato isotipi) nello stesso modo.
6. Stainer automatizzato: Protocollo di preparazione Slide
- Copiare il protocollo prestaining * cuocere e Sparaffinatura e rinominare questo protocollo cuocere multispettrali e Sparaffinatura 2 h.
- Regolare il protocollo per abbinare i reagenti indicati nella tabella 2. Diapositive di cuocere per 2 ore a 60 ° C. Sparaffinatura per 30 s a 72 ° C.
7. automatizzato Stainer: Preparazione dei reagenti
- Preparare un kit di rilevazione di ricerca. Un reagente deve essere permanentemente associato con questo kit, quindi riempire il contenitore aperto 30 mL contrassegnati per soluzione fisiologica tamponata 1x (TBS) con 1 x TBS e individuare questo in posizione 1 (più lontana la maniglia) nel kit rilevamento ricerca designato Multiplex ricerca Kit 1. questo reagente sarà permanentemente associato con questo kit di ricerca e non deve cambiare posizione per un utilizzo futuro.
- Etichetta due contenitori aperti 30ml Blocco multispettrali e Multispettrali secondario. Riempire il contenitore di Blocco multispettrali con 30 mL di tampone/anticorpo blocco diluente dal kit di colorazione multispettrali. Riempire il contenitore Multispettrali secondario con 30 mL di polimero di anticorpo secondario anti-mouse/anti-coniugato dal kit di colorazione multispettrali.
- Preparare dieci contenitori aperti di 7 mL. Il volume richiesto in microlitri è 600 + (150 x [numero di diapositive]). Ogni anticorpo si applicherà a 12 diapositive in questo caso (tonsilla sei e sei del polmone). L'etichettatura e i volumi per tutti i contenitori sono indicati nella tabella 3.
- Per ogni provetta di anticorpo, aggiungere innanzitutto l'anticorpo diluente, seguito dall'anticorpo primario concentrato nei volumi indicati nella tabella 3. Mescolare pipettando delicato.
- Preparare un contenitore aperto di 7 mL per DAPI, utilizzando quattro gocce di concentrato DAPI per millilitro di acqua bidistillata; un totale di 16 sarà colorato con DAPI (600 + [150 x 16] = 3.000 µ l). Aggiungere 3 mL di acqua bidistillata plus 12 gocce di DAPI spettrale nel contenitore. Preparare fresco DAPI per ogni esecuzione.
- Preparare un contenitore aperto di 7 mL inibitore perossidasi. Tutte le 16 diapositive saranno trattate con inibitore perossidasi (600 + [150 x 16] = 3.000 µ l). Aggiungere 3 mL di blocco della perossidasi nel contenitore.
- Prima di preparare le concentrazioni di lavoro di fluors, risospendere tutti fluors liofilizzato aggiungendo 75 µ l di solfossido dimetilico ad ogni tubo fluor fornito dal produttore. Mescolare pipettando. Questo è lo stock di fluor TSA. Conservare a 4 ° C.
- Preparare sei contenitori di titolazione, uno per ogni fluor. Il volume richiesto in microlitri è 350 + (150 x [numero di diapositive]). Ogni fluor si applicherà a 16 vetrini in questo caso (tonsilla otto e otto del polmone). L'etichettatura e i volumi per tutti i contenitori sono indicati nella tabella 4.
- Quando tutti i reagenti sono stati registrati e preparati, posizionare ogni contenitore in qualsiasi posizione su una cremagliera e caricare tutti i reagenti sul coloratore automatico. La sonda confermerà il volume di ogni reagente.
8. automatizzato Stainer: Campione Setup e macchiatura multispettrali
-
Nel software coloratore automatico, fare clic su installazione di diapositiva nella parte superiore dello schermo. Fare clic su Aggiungi studio. Compilare la finestra pop-up con la studio ID, nome studio e i commenti.
- Selezionare il nome del ricercatore conducendo la corsa colorazione dall'elenco a discesa. Lasciare il volume di distribuzione 150 µ l. Selezionare multispettrali Sparaffinatura per protocollo di preparazione. Fare clic su OK e Aggiungi slide. In Commento, digitare "Multiplex 1 polmone 123ABC." Completare i seguenti campi come indicato: Tessuto tipo = tessuto Test; Volume di distribuzione = 150 µ l; Modalità di colorazione = singolo, Routine; Indicatore = negativo; La macchiatura = Digitare "7 Multiplex protocollo n. 1"; Preparazione = multispettrali Bake, Sparaffinatura 2h; HIER = HIER 20 min con ER1.
- Fare clic su Aggiungi slide e modificare i commenti e il protocollo per aggiungere i vetrini di controllo discesa e isotype vetrino di controllo. Quando tutte le diapositive sono state aggiunte allo studio, chiudere la finestra Aggiungi slide e stampare le etichette. Applicare le etichette per l'area di etichetta appropriata su ogni diapositiva.
- Caricare i vetrini in rack, applicare piastrelle di copertura con l'orientamento corretto, inserire le cremagliere coloratore automatico e abbassare i vassoi. Il dispositivo esegue la scansione delle etichette di diapositiva.
- Quando tutte le diapositive e i reagenti sono stati analizzati e misurati. Il pulsante di marcia (►) diventerà attivo. Se autostainer rileva eventuali errori, ad esempio il volume di Reagente insufficiente, apparirà un simbolo di attenzione giallo dal vassoio interessato. Se si verifica un errore, fare clic destro il simbolo di attenzione e rimediare l'errore.
- Avviare immediatamente la macchiatura o programmare la partenza ritardata. Il protocollo è circa 14 h in durata. Nota: Garantire che il protocollo verrà completata in un momento quando le diapositive possono essere rimossi immediatamente quanto exess lavaggio potrebbe influire risultati della colorazione.
9. coprioggetto delle diapositive multispettrali
- Rimuovere le diapositive dal coloratore automatico e memorizzarli in un rack sommerso in 1 x TBS.
- Montare i campioni con vetrini coprioggetti n. 1,5 e 15 µ l del supporto di montaggio (Vedi Tabella materiali). Rimuovere eventuali bolle premendo delicatamente il vetrino coprioggetti con un puntale.
- Lasciare i vetrini curare una notte a temperatura ambiente su banco di laboratorio. Non polimerizzati diapositive possono essere analizzati immediatamente con un'attenta gestione.
10. multispectral Scanner
- Accendere lo scanner multispettrale e al suo computer (Vedi Tabella materiali per informazioni modello e software). Avviare il software di controllo del microscopio. Aprire lo sportello anteriore dello scanner multispettrali premendo il tasto sensibile al tocco sulla parte anteriore del dispositivo. Ogni vettore a molla nello scanner detiene quattro diapositive. Caricare tutte le diapositive in vettori e registrare l'ordine prima di caricare i supporti nel dispositivo.
- Selezionare Edit protocollo e fare clic su nuovo...; quindi, creare il nome del protocollo 1 pannello Multiplex e controlli Drop. Creare il nome di Studio Multiplex pannello sviluppo, fare clic su Creare protocolloe digitare Panoramica scansione filtro DAPI; quindi, selezionare Intero Slide scansione e Risoluzione Pixel 0,50 µm (X 20). Tutti i filtri e bande dovrebbero essere rappresentati. In caso contrario, fare clic su Modifica filtri e gruppi, selezionare tutte le cinque filtri (DAPI, FITC, Texas Red, CY3 e CY5) e quindi fare clic su Modificare le esposizioni.
- Caricare il vettore selezionando l'elemento portante con il multiplex completo dell'adenocarcinoma del polmone. Selezionare la diapositiva corretta utilizzando l'interfaccia grafica utente. Concentrare il tessuto manualmente o utilizzando la messa a fuoco automatica. Passate a qualsiasi area con la colorazione DAPI accettabile e fare clic su Auto-esporre per impostare l'esposizione in millisecondi (0 – 2.000 ms).
- Ripetere la stessa procedura per tutti i cinque set di filtri nelle colonne scansione intero e regione di MSI. Essere sicuri di passare a un'area con la macchiatura accettabile e rimettere a fuoco il microscopio prima di impostare l'esposizione per ogni livello di ingrandimento e filtro. Auto-esporre per tutti e cinque i filtri in un 20 x scansione complessiva e 20 x multispectral imaging multispettrale regioni per (MSI). Selezionare una risoluzione di pixel di 0,50 µm (20x). Salvare il protocollo e fare clic su indietro per tornare alla schermata iniziale del software Vectra; quindi, fare clic su Scansione diapositive.
- Aprire l'interfaccia per ogni diapositiva e impostare attività per eseguire la scansione. Impostata Studio Multiplex pannello sviluppo, impostare protocollo ai controlli Drop e Multiplex pannello 1e impostato ID di diapositiva Multiplex polmone ABC123, Multiplex CD68 Drop polmone ABC123, ecc . Quando tutte le diapositive sono state etichettate e vengono impostate le attività, fare clic su scansione. Lo scanner multispettrale automatizzato esegue scansioni full-diapositiva di tutte le diapositive utilizzando tutti i cinque filtri.
11. multispectral Scanner: Multispectral Imaging
- Una volta completate le scansioni, aprire il software QPTIFF ("Phenochart") e fare clic su Diapositiva di carico in alto a sinistra. Questo aprirà un QPTIFF, che è una scansione di tutto-diapositive di cinque-filtro. Ogni livello contiene informazioni da più di un fluor, quindi l'utilità è limitata, ma la struttura dei tessuti e modelli ampia espressione sono evidenti e possono essere utilizzati per selezionare le regioni per MSI.
- Individuare e aprire la diapositiva corretta nello studio utilizzando l'elenco a discesa albero sulla sinistra. Il login (alto a destra) con iniziali dell'utente.
- Selezionare cinque regioni per MSI utilizzando lo strumento timbro nella parte superiore dello schermo. Consultare un patologo se disponibile. In selezionare per, selezionare acquisizione; in dimensione nei campi, selezionare 1 x 1; e sotto restrizione di campo, selezionare 0,5 µm (20x). Base il cytokeratin (CK) colorazione (principalmente in Cy5), selezionare diverse regioni con lo stroma (CK-) essere imaged dalla scansione complessiva sia di tumore (CK +). Ripetere questa procedura per ogni diapositiva.
- Una volta selezionati tutti i file MSI, chiudere il software Phenochart e tornare al software di Vectra . Modificare l'attività da eseguire la scansione di MSI per ogni diapositiva e, quindi, fare clic su scansione per eseguire la raccolta di MSI.
12. spectral Unmixing
Nota: Il passo di unmixing spettrale è necessario per la separazione dei canali e l'analisi di immagini delle diapositive. Prima unmixing spettrale viene eseguita nel software inForm, la libreria spettrale deve essere costruita utilizzando diapositive dell'adenocarcinoma del polmone macchiati con ogni fluor da solo e con DAPI da solo. Questa procedura è descritta anche nella suddetta Multiplex IHC Assay Guida allo sviluppo.
- Una volta completata l'acquisizione di MSI, è possibile utilizzare il software di ("informare") unmixing spettrale ad per aprire un file nella cartella MSI . Questi file terminano con l'estensione di file di tipo .im3.
- In formato immagine, selezionare Multispectral; in formato campione, selezionare fluorescenza; e in origine libreria spettrale, selezionare InForm.
- Per selezionare fluors, selezionare e caricare tutti i sei fluors e DAPI dalla biblioteca costruita con le diapositive di biblioteca dell'adenocarcinoma del polmone. Fare clic su Preparare tutti (basso a sinistra). Software unmixing spettrale si esibirà unmixing spettrale su tutte le immagini aperte, utilizzando i profili spettrali forniti.
- Con un patologo, valutare il modello di macchiatura contro macchie cromogeniche singole dello stesso bersaglio in diapositive in sequenza dello stesso tessuto.
13. valutazione dell'intensità di fluorescenza e attenuazione del segnale
Nota: Lo strumento conta, che appare come una freccia con una piccola scatola marrone, è lo strumento più importante per l'ottimizzazione dei multiplex e dovrebbe essere usato frequentemente (Vedi Materiali supplementari). Utilizzando il tool di conteggi nel software unmixing spettrale, valutare il rapporto segnale-rumore, che come minimo dovrebbe superare 10:1 (Vedi Materiali supplementari per la risoluzione dei problemi e per la valutazione del multisala macchiatura con i controlli di goccia).
- 13.1. con un'immagine aperta nel software unmixing spettrale, avviare lo strumento di conteggi e indagine immagini per valutare l'intensità di fluorescenza di ogni canale. L'intensità di destinazione nel tessuto polmonare è tra 10 e 20 conteggi normalizzati. Lo strumento di conteggi normalizzato è illustrato nella Figura 1.
- Escludere diapositive con i conteggi di massima del segnale dei conteggi di area inferiore a 10 o normale segnale di meno di cinque per ogni marcatore affinché autofluorescenza e macchiatura fuori bersaglio non sono in concorrenza con il segnale autentico.
- Escludi diapositive con massimo conta superiore a 30 per qualsiasi canale evitare emorragie spettrale o inefficiente unmixing spettrale.
- Indirizzo alta o bassa normalizzato conteggi regolando la concentrazione di TSA.
14. multispettrali Image Analysis
- Aprire uno o più MSI nel software unmixing spettrale e solo selezionare fluors per unmixing che sono rappresentati in almeno un immagine aperta. Fare clic su Preparare tutti per unmix tutte le immagini a colori attualmente aperto per produrre immagini spettralmente non miscelati.
- Selezionare lo strumento di conteggi per conteggi di indagine attraverso ogni immagine passando sopra le aree di interesse.
- Selezionare l'icona occhio per aprire l'editor di visualizzazione. Selezionare e regolare l'intensità di visualizzazione di ogni canale indipendente.
- Selezionare Configura per aprire la segmentazione del tessuto, segmentazione delle cellule, phenotyping e moduli di punteggi. Questi strumenti sono necessari per la convalida oggettiva di multiplex colorazione contro le macchie singole cromogeniche e possono essere utilizzati per generare dati quantitativi phenoptic (Figura S1).
- Utilizzare la scheda Esporta per salvare in scala di grigi, fluorescente, pathview-stile non compresso TIFF e file di dati dai moduli di analisi phenoptic per ulteriore analisi, archiviazione e presentazioni (Figura S1).
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Representative Results
Il protocollo descritto qui fornirà risultati come quelli mostrati nella Figura 2. Iniziare con una valutazione della colorazione nel controllo della tonsilla, cominciando con l'epitelio di superficie delle cellule squamose. L'istologia del campione tonsilla possa essere esaminata con un patologo, utilizzando la diapositiva di H & E come riferimento. Se sezioni IHC cromogenici vengono eseguiti con gli stessi marcatori nello stesso isolato del tessuto, questi può utilizzati per confermare la densità e la distribuzione di ogni segno sulla diapositiva mIF. Come illustrato nella Figura 2A, il tessuto della tonsilla dovrebbe fornire chiaramente definiti il cytokeratin AE1/AE3 macchiatura nell'epitelio squamous di superficie della tonsilla (Figura 2A; etichettato come rosso pseudocolor), senza sfondo nella linfoide tessuto. La colorazione dovrebbe essere citoplasmatica, occasionalmente con l'accentuazione di membrana, e i nuclei devono essere negativi. L'epitelio reticolata nelle cripte dovrebbe essere positivo per i cytokeratins (rossi) e PD-L1 (Figura 2A; pseudocolor verde). I centri germinali follicolari della tonsilla dovrebbero, quindi, essere identificati. I centri germinali dovrebbero essere facilmente riconoscibili e dovrebbero essere ricchi in linfociti di Ki-67-positive (Figura 2A; pseudocolor giallo). Ki-67 che macchia dovrebbe essere sempre nucleare. I macrofagi presenti in centri germinali dovrebbero anche essere facilmente riconoscibili, a volte come più grandi cellule (chiamate anche "tingible del corpo"). Essi vi mostrerà la macchiatura positive per CD68 come una macchia citoplasmica granulare (Figura 2A; pseudocolor arancione). Una proporzione variabile di cellule CD68 fuori i centri germinali deve anche essere previsto. I macrofagi possono mostrare membrana macchiatura per PD-L1. Questo è in genere più pallido in intensità di macchiatura per PD-L1 nell'epitelio reticolata. Non ci dovrebbe essere nessun CD68 nucleare colorazione. CD8 dovrebbe macchiare i linfociti con una distribuzione di T-cellula (meno nei centri germinali e una percentuale maggiore nelle aree interfollicular; Vedi Figura 2A, pseudocolor ciano). Linfociti CD8 + sono solitamente piccole cellule con citoplasma limitato, quindi è praticamente impossibile distinguere membrana contro citoplasma nei linfociti. PD-1 fortemente macchierà piccoli linfociti in zona centro germinativo, cluster di solito alla periferia dei centri germinali (Figura 2A; pseudocolor magenta), come pure sparsi linfociti nella regione interfollicular, solitamente mostrando una bassa intensità di colorazione rispetto a quelli in zona centro germinale. Come con CD8, non è possibile distinguere chiaramente tra membrana e colorazione citoplasmatica in piccoli linfociti macchiati con PD-1. Poiché una proporzione variabile di cellule CD8 coesprimere PD-1, è consigliabile per scopi di controllo di qualità che il modello e la distribuzione di ogni segno che si è macchiato negli stessi tessuti colorazione essere paragonata cromogenici diapositive di riferimento IHC, come suggerito in protocolli precedentemente pubblicati12.
Dopo il previsto modello di macchiatura è stato confermato nel controllo del tessuto delle tonsille, procedere per valutare la colorazione del campione di cancro del polmone (Figura 2B). Perché i tessuti del tumore sono tenuti a mostrare un'espressione variabile ed eterogenea dei marcatori, è molto importante durante l'ottimizzazione di un nuovo pannello di mIF per confrontare il modello di macchiatura per ogni indicatore individuale osservata nel metodo mIF e la sua espressione osservato nelle slide IHC cromogenico standard, valutando la quantità e la distribuzione delle cellule positive come descritto in precedenza12. Tuttavia, il modello di macchiatura base deve essere conservato; ad esempio, i cytokeratins dovrebbe essere osservati nel citoplasma delle cellule epiteliali e mai in un nucleo; CD68 dovrebbe apparire come colorazione citoplasmatica granulare in macrofagi, ecc. Importante, in alcuni marcatori, l'intensità di colorazione potrebbe cambiare dal controllo della tonsilla in tessuto del cancro; ad esempio, PD-1 e PD-L1 può mostrare minore intensità di colorazione nel tessuto del tumore rispetto l'espressione molto elevato osservato nel controllo della tonsilla. Pertanto, è importante eseguire la valutazione e l'ottimizzazione con lo strumento di conteggi nel software inForm, utilizzando esempi di tessuti del tumore piuttosto che i controlli della tonsilla.
Infine, comandi isotipo-negativi e controlli drop devono essere valutati, non solo per la rilevazione di sfondo e autofluorescenza, ma anche per gli effetti di ombrello e sanguinare spettrale (Figura 3 e Figura 4). Isotype controlli non dovrebbero dimostrare qualsiasi immunostaining tutta la diapositiva; Se si osserva una qualsiasi colorazione, l'imaging o la procedura di colorazione deve essere rivisitato. Controlli di goccia sono importanti per valutare i potenziali artefatti nella macchiatura, quali effetti spettrali sanguinare o ombrello, a causa del metodo mIF durante l'ottimizzazione di un nuovo pannello multiplex (Vedi Figura 5, Complementare figura S2, Figura complementare S3e materiali supplementari). Controlli Levansucrasi e goccia fluorescenti dovrebbero saranno valutati e confrontati con il pannello intero multiplex. Ogni goccia di controllo dovrebbe mostrare il modello di macchiatura stesso fatta eccezione per il singolo anticorpo primario, che dovrebbe essere rimosso su ogni controllo specifico. Ulteriori dettagli sono forniti nella sezione Materiali supplementari .
Figura 1 : informare strumento conta. Lo strumento di conteggi di inForm software viene attivato selezionando l'icona di scatola beige. Normalizzato conteggi sono corretti per la profondità di bit, tempo di esposizione, guadagno e binning. Le immagini sono state scattate a 20 ingrandimenti; la barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Risultati rappresentativi. Carcinoma del polmone nonsmall-cellula della tonsilla (A) e (B) sono stati macchiati con PD-L1 (TSA 520, verde), CD8 (540 TSA, ciano), Ki67 (570 TSA, giallo), CD68 (620 TSA, arancio), il cytokeratin (650 TSA, rosso) e PD-1 (690 TSA, magenta). Singoli canali sono rappresentate separatamente sotto in piccoli pannelli. Il marcatore è indicato in alto a destra di ogni immagine. Le immagini sono state scattate a 20 ingrandimenti; Barra della scala = 50 (o 250 µm). Indicato nel pannello sono 1 ) follicolo linfoide, 2) germinal center, zona 3) interfollicular ed epitelio squamous 4) stratificato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Effetto di blocco/ombrello TSA. Questo è un esempio di 690 TSA depositato da un segnale di CD3 diblocco PD-1 in un modo dipenda dalla quantità di presente di TSA. Il segnale più brillanti di TSA 690 blocca il segnale TSA 620 più efficacemente (carcinoma polmonare nonsmall cellule colorate con D4W2J anti-PD-1 per 30 min a 0,52 µ g/mL o isotipo seguita da una rilevazione di TSA 10 min 690 a 1: 100; poi, anti-CD3 F7.2.38 per 30 min a 0,14 µ g/mL seguita da una rilevazione di TSA 620 10 min a 1: 100). Le immagini sono state scattate a 20 ingrandimenti; la barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Spettrale sanguinare. Tessuto di carcinoma polmonare a cellule nonsmall era macchiato con il protocollo di controllo di goccia di Ki-67 (multisala protocollo completo con omesso l'anticorpo Ki-67). Sono mostrati il canale TSA 540 (CD8) e il canale TSA 570 (Ki-67). Nessun modello di macchiatura nucleare è evidente, ancora una copia ridotta del CD8 modello di macchiatura è osservata nel canale TSA 570. Questo è meglio affrontato garantendo intensità di colorazione paragonabile in tutti i canali. In questo caso, l'aggiunta di un segnale robusto di Ki-67 (normalizzati conteggi tra 10 e 20) correggerà il sanguinare spettrale. Le immagini sono state scattate a 20 ingrandimenti; la barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Trascinare controlli. Questa figura mostra un'immagine composita di un pieno multiplex rispetto alla stessa area di diapositive in sequenza dell'adenocarcinoma del polmone macchiato con controlli di drop in cui è stato omesso l'anticorpo primario indicato. Le immagini sono state scattate a 20 ingrandimenti; Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome | Nome abbreviato | Tipo | Contenitore | Gruppo |
| PKI blocco Buffer | OPALBLOK | Accessorie | Aprire 30 mL | Generale |
| Opal polimero HRP | OPAL 2AB | Accessorie | Aprire 30 mL | Generale |
| OPAL 1 x TBS | OPAL1TBS | Accessorie | Aprire 30 mL | Kit di part. |
| CD68 0.30 µ g/mL PG-M1 Mus | OPALCD68 | Accessorie | Aprire 7ml | Generale |
| KI67 0,61 µ g/mL MIB-1 Mus | OPALki67 | Accessorie | Aprire 7ml | Generale |
| PD-L1 0,20 µ g/mL SP263 Rab | OPALPDL1 | Accessorie | Aprire 7ml | Generale |
| PD-1 0,52 µ g/mL D4W2J Rab | OPAL PD1 | Accessorie | Aprire 7ml | Generale |
| CD8 0.70 µ g/mL SP239 Rab | OPAL CD8 | Accessorie | Aprire 7ml | Generale |
| 0.24 µ g/mL CK AE1/AE3 Mus | OPAL CK | Accessorie | Aprire 7ml | Generale |
| Mouse IgG | OPAL MUS | Accessorie | Aprire 7ml | Generale |
| IgG di coniglio | OPAL RAB | Accessorie | Aprire 7ml | Generale |
| Blocco della perossidasi di opale | OPALPERX | Accessorie | Aprire 7ml | Generale |
| DAPI spettrale | OPALDAPI | Accessorie | Titolazione 6ml | Generale |
| Reagente di opale 520 | OPAL 520 | Accessorie | Titolazione 6ml | Generale |
| Reagente di opale 540 | OPAL 540 | Accessorie | Titolazione 6ml | Generale |
| Reagente di opale 570 | OPAL 570 | Accessorie | Titolazione 6ml | Generale |
| Reagente di opale 620 | OPAL 620 | Accessorie | Titolazione 6ml | Generale |
| Reagente di opale 650 | OPAL 650 | Accessorie | Titolazione 6ml | Generale |
| Reagente di opale 690 | OPAL 690 | Accessorie | Titolazione 6ml | Generale |
Tabella 1: Leica Bond RX protocollo, opale reagenti
| Reagente | Tempo (h) | Temperatura (gradi Celsius) | |
| 1 | Nessun reagente | 120:00 | 60 |
| 2 | Bond Sparaffinatura soluzione | 0:30 | 72 |
| 3 | Bond Sparaffinatura soluzione | 0:00 | 72 |
| 4 | Bond Sparaffinatura soluzione | 0:00 | Temperatura ambiente (temperatura ambiente) |
Tabella 2: Protocollo di preparazione OPAL
| Destinazione | µ g/mL | Clone | Fonte | Sacco | Stock µ g/mL | µ L diluente | Μ L AB |
| CD68 | 0.3 | PG-M1 | Dako | 20043031 | 30 | 2376 | 24 |
| KI67 | 0.61 | MIB-1 | Dako | 20049476 | 46 | 2368.17 | 31.83 |
| PD-L1 | 0.2 | SP263 | Vent. | F09591 | 1.61 | 2101.86 | 298.14 |
| PD-1 | 0,52 | D4W2J | CST | 1 | 100 | 2387.52 | 12,48 |
| CD8 | 0,7 | SP239 | Ventana | 160318 | 70 | 2376 | 24 |
| CK | 0,24 | AE1/AE3 | Dako | 10129428 | 179.5 | 2396.79 | 3.21 |
| Mus IgG | 0.61 | ||||||
| Rab IgG | 0,7 |
Tabella 3: Preparazione di anticorpi primari.
| Opal Fluor | Diapositive | Diluizione | µ L diluente | µ L opale Fluor |
| Opal 520 | 16 | 1: 200 | 2736.3 | 13,8 |
| Opal 540 | 16 | 1:700 | 2746.1 | 3.9 |
| Opal 570 | 16 | 1: 150 | 2731.7 | 18,3 |
| Opal 620 | 16 | 1: 100 | 2722.5 | 27.5 |
| Opal 650 | 16 | 1: 350 | 2742.1 | 7.9 |
| Opal 690 | 16 | 1: 150 | 2731.7 | 18,3 |
Tabella 4: OPAL Fluor preparazione.
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Supplementare tabella 2: riepilogo e confronto di multiplex completo, controlli drop e controlli di isotipo completo. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
La rivoluzione di immunoterapia del cancro in corso è romanzo di apertura e promettente opzioni terapeutiche per i pazienti di cancro13. Progressi nel campo della immuno-oncologia richiederanno una maggiore conoscenza del microenvironment del tumore infiammatorio, non solo per capire la biologia dei meccanismi immunologici coinvolti nella carcinogenesi, ma anche per trovare biomarcatori predittivi per il nuovo trattamenti basati sull'immunoterapia1,2. A causa della complessa biologia di immunologia del cancro, interrogatorio di campioni di tessuto del tumore è solitamente richiesto per sviluppare un crescente elenco di indicatori immuni, che interagiscono tra loro e spesso sono coespressi da popolazioni di diverse cellule nel tessuto1 ,2,5. Studi clinici di solito impiegano piccole biopsie, come nucleo ago o biopsie endoscopiche, che sono raccolti in diversi punti della terapia per valutare e monitorare la risposta del paziente. Tali biopsie forniscono limitate quantità di tessuto, che a sua volta limita il numero di sezioni di tessuto che possono essere impiegati per cancro immunoprofiling. Questa limitazione è particolarmente onerosa quando vengono utilizzate tecniche tradizionali, come standard Levansucrasi IHC. C'è, quindi, evidente bisogno per nuovi metodi per il cancro immunoprofiling che fanno uso di multiplex tecniche con la capacità di valutare contemporaneamente il coexpression di diversi biomarcatori e per fare un uso più efficiente degli esemplari del tessuto prezioso.
Nella macchiatura multiplex e metodi di imaging multispettrali, descritti in dettaglio qui, un pannello di mIF è utilizzato per gli studi di immuno-oncologia sui tessuti FFPE quali le biopsie da un test clinico. Questo metodo è stato precedentemente descritto, convalidato e applicato con successo al cancro immunoprofiling8,9,10,11,12,14, 15. protocolli precedentemente pubblicati hanno descritto mIF simili metodi con sistemi basati su TSA, ad esempio il kit di sette colori, che richiede tempo e richiede circa 4 giorni di lavoro di un laboratorio dedicato scienziato12 di colorazione ,15. In risposta a queste carenze, questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando un commercialmente disponibile stainer automatizzato, accorciando notevolmente il tempo a 14 h di colorazione ed eliminando la variabilità introdotta da operatori manuali. La formazione immagine è condotta su uno scanner multispettrale in grado di separare gli spettri dei segnali fluorescenti sette o più nelle diapositive multisala, tra cui autofluorescenza, che può essere rimosso in modo efficiente senza degradare la qualità del segnale. Questo protocollo può essere replicato, per volta ed eseguita da qualsiasi utente di laboratorio con accesso per gli strumenti e i reagenti dettagliati nella Tabella materiali.
Punti critici in questo protocollo sono sezioni 7, 10, 11, 12. Sezione 7 riguarda la preparazione dei reagenti. Una preparazione accurata dei reagenti per la macchiatura multisala è essenziale, che richiedono l'attenzione di un laboratorio scienziato o tecnico per evitare variazione operatore-dipendente. Per esempio, uno dei principali problemi con il metodo della multisala sta macchiando variabilità, che può essere ridotto mediante l'accurata preparazione delle diluizioni dei reagenti, in particolare i coloranti TSA. Articoli 10 e 11 sono legate alla acquisizione di immagini. Un rischio importante è la sovraesposizione o la sovrasaturazione delle immagini, che può portare a sanguinare spettrale, un manufatto in cui il segnale da un altro canale interferisce con il canale essere imaged (Vedi Materiali supplementari). Attentamente che regolano i tempi di esposizione può aiutare a prevenire la sovrasaturazione e sanguinare spettrale. Unmixing spettrale è condotto nella sezione 12. Questo si basa sulla preparazione della libreria spettrale (descritta nella multisala IHC Assay Guida allo sviluppo, disponibili online). In questo passaggio, il software di informare è "addestrato" a riconoscere specificamente i colori per ogni colorante TSA. La libreria spettrale è creata usando le sezioni da un tessuto di controllo, quali la tonsilla umana, macchiata con un pennarello uniformemente espresso, quali CD20, accoppiata con ogni singolo colorante TSA su singole diapositive. Inoltre, diapositive di autofluorescenza (descritti anche nella Guida allo sviluppo di test IHC Multiplex) sono necessarie per addestrare il software inForm a riconoscere e a sottrarre tessuto autofluorescenza. Vetrini di controllo autofluorescence dovrebbero essere preparati utilizzando campioni dai tessuti stessi in fase di studio (come il cancro del polmone, ecc.), trattati nello stesso modo come le diapositive di mIF e incubate con anticorpi primari e secondari, ma senza il colorante TSA. Solo un profilo spettrale di autofluorescenza singolo può essere selezionato, quindi deve fare attenzione a selezionare una rappresentazione del autofluorescence osservabile che può provenire da collagene, fibrosi, globuli rossi, pigmenti endogeni e altre fonti. Creazione di una libreria spettrale all'inizio di ogni nuovo progetto e utilizzando uno spettro di autofluorescenza rappresentativo degli esemplari di studio del tessuto, nonché in esecuzione gli stessi blocchi di tessuto come il controllo positivo per ogni batch all'interno dello stesso progetto, sono preziosi passaggi metodologici che contribuiranno a migliorare la coerenza della spettrale unmixing attraverso diversi campioni all'interno del progetto stesso.
Il multisala metodo descritto in questo protocollo offre diversi strumenti di risoluzione dei problemi, tra cui un analizzatore di segnale-rumore (strumento di conteggi), controlli di drop (Materiali supplementari) e una vista di patologia per il controllo di qualità della colorazione. Lo strumento di conteggi consente di valutare l'intensità della colorazione e il livello di sfondo. Se l'intensità e/o livelli di fondo sono alti, il primo approccio è quello di ridurre la diluizione della tintura TSA. Se il problema persiste, le diapositive IHC cromogeniche utilizzate per l'ottimizzazione di quel particolare marcatore dovrebbero essere riesaminate con un patologo, cercando la presenza di sfondo. La vista di patologia è generata dal software inForm, utilizzando una rappresentazione simile diaminobenzidina pseudocolor della fluorescenza dal fluor TSA-collegato, così come una rappresentazione di ematossilina finto generato da tutti i segnali fluorescenti, tra cui DAPI . Guida di immagini dalla visualizzazione di patologia con la valutazione visiva dei pattern di colorazione da un patologo per una migliore colorazione. Questi strumenti dovrebbero sempre essere impiegati durante l'ottimizzazione di un nuovo pannello e come passi di controllo di qualità durante la colorazione del flusso di lavoro.
Il metodo mIF richiede l'uso di anticorpi primari che sono stati correttamente convalidato e ottimizzato per standard cromogenico IHC su tessuti fissati in formalina. Per esempio, uno dei vantaggi principali del metodo mIF TSA è la sua compatibilità con l'uso di anticorpi primari che sono stati convalidati e ottimizzati sia in laboratorio patologia anatomica per uso clinico12. Questo vantaggio significa che i Pannelli multiplex possono essere personalizzati dall'utente laboratorio per rispondere alle domande di immunologia del cancro specifico senza la necessità di anticorpi preconjugated, uno sviluppo rapido e dinamico pannello. A questo proposito, il flusso di lavoro effettivo per l'ottimizzazione di un nuovo pannello inizia con la convalida e l'ottimizzazione degli anticorpi con standard cromogenico IHC, cercando la migliore diluizione e condizioni che forniranno la macchiatura pulito e coerente la macchiatura. Il passo successivo, utilizzando le stesse diluizioni ottimizzate per IHC, è di trasferire la colorazione utilizzando fluors TSA invece diaminobenzidina e confrontare i risultati di Levansucrasi TSA immunofluorescente con l'IHC cromogenico come riferimento. Infine, gli anticorpi possono essere combinati in mIF colorazione, utilizzando sempre il cromogenico IHC che macchia il modello come un riferimento al controllo per regolare i mIF TSA colorazione parametri, principalmente le diluizioni di tintura TSA e la sequenza di colorazione. Durante questo processo, la collaborazione con un patologo è strumentale per valutare la qualità della colorazione.
Limitazioni di questa tecnica includono il tempo e sforzo richiesto per l'ottimizzazione e validazione dei nuovi pannelli e l'analisi di immunophenotyping dei pannelli di mIF. La preoccupazione principale, tuttavia, è la corretta convalida dei metodi di mIF. La mancanza di corretta convalida di queste tecniche comporta il rischio di generare risultati non validi, che possono aggiungere dati confusi alla letteratura, ostacolando così i tentativi di acquisire una migliore comprensione della biologia del cancro immunologia16. Spetta, pertanto, l'investigatore a compiere ogni sforzo per convalidare correttamente multisala metodi, tra cui garantire la stretta partecipazione e valutazione dai patologi con addestramento ed esperienza nella convalida e valutazione del tessuto L'istopatologia e tecniche basate su IHC17,18,19,20. Il protocollo presentato qui include alcuni degli strumenti che possono aiutare con la convalida di un nuovo pannello multiplex, ivi compresa la valutazione di patologia di H & E diapositive prima di colorazione e analisi, l'uso di IHC cromogenico come riferimento per ottimizzare il mIF TSA colorazione, il metodo di controllo di goccia per il controllo di qualità di un nuovo multiplex pannello e l'uso di isotipo, autofluorescenza e rilasciare i controlli. Nonostante la complessità tecnica del mIF metodi, tecnologie come l'imaging multispettrale con unmixing spettrale, così come altre piattaforme multiplex romanzo, sono aprendo una nuova era per l'analisi di campioni di tessuto dai pazienti e la generazione di nuove forme di dati che non sono possibili con IHC standard da solo. Di conseguenza, lo sviluppo e l'applicazione delle tecniche di mIF continuerà a crescere, diventando strumenti potenti per la immunoprofiling di cancro delle biopsie per test clinici e contribuire a identificare nuovi biomarcatori predittivi multiparametrico per immunoterapia, Grazie, soprattutto, il malato di cancro.
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Disclosures
Questo lavoro è stato supportato da MedImmune, il biologics global R & D braccio di AstraZeneca. C.W., K.R. e C.C.H. sono dipendenti di Perkin Elmer, che produce i reagenti (kit di TSA) e multispectral scanner che sono stati utilizzati in questo lavoro. M.S., K.D., A.H., W.Z., C. Bagnall, C. Brown, J.C., A.L., K.S., M.R. e J.R.C sono dipendenti di MedImmune con proprietà di riserva e/o interessi di stock o opzioni in AstraZeneca.
Acknowledgments
Supporto editoriale è stato fornito da Deborah Shuman di MedImmune.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
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