Summary
Подробный протокол является оптимизированы и шести маркер мультиплекс иммунофлюоресценции группа, с помощью автоматизированных ситечко для получения более надежного результата и продолжительности процедуры. Этот подход может быть непосредственно адаптирована в любой лаборатории для исследования иммуно онкология.
Abstract
Продолжение разработок в иммуно онкологии требуется углубление понимания механизмов иммунологии рака. Immunoprofiling анализ образцов ткани от формалин исправлена, парафин врезанных биопсий (FFPE) стал ключевым инструментом для понимания сложности иммунологии опухоли и открывая Роман интеллектуального биомаркеров для иммунотерапии рака. Immunoprofiling анализ тканей требует оценки комбинированных маркеров, в том числе субпопуляций воспалительных клеток и иммунных контрольно-пропускные пункты, в микроокружения опухоли. Появление Роман мультиплекс иммуногистохимических методов позволяет эффективнее многопараметрических анализа разделов одного ткани чем стандартные monoplex иммуногистохимии (IHC). Один из коммерчески доступных мультиплекс иммунофлюоресценции (если) метод на основе усиления tyramide сигнала и, в сочетании с многоспектральной микроскопического анализа, позволяет для лучшего разделения сигнала различных маркеров в ткани. Эта методология совместим с использованием неконъюгированной первичных антител, которые были оптимизированы для стандартных IHC на FFPE образцов тканей. Здесь мы подробно описать автоматизированных протокол, который позволяет мультиплекс если маркировка образцов ткани железы с шести маркер мультиплекс антитела группы в составе PD-L1, ПД-1, CD68, CD8, Ki-67 и AE1/AE3 cytokeratins с 4, 6-diamidino-2-phenylindole как изображение ядерных клеток. Мультиплекс группы протокол оптимизирован в автоматизированной IHC ситечко для окрашивания время, что короче, чем ручной протокола и можно непосредственно применять и адаптировать любой следователь Лаборатория иммуно онкология исследований на образцах ткани FFPE. Также описаны несколько элементов управления и инструменты, включая падение управления метод для тонкой контроля качества новых мультиплекс если группы, которые полезны для оптимизации и проверки техники.
Introduction
Immunoprofiling анализ образцов ткани тумора FFPE стала важным компонентом исследований иммуно онкологии, особенно для обнаружения и проверки Роман интеллектуального биомаркеров для иммунотерапии рака в контексте клинических испытаний1 ,2. Хромогенный IHC, используя химические chromogens например Диаминобензидин, остается стандартным методом диагностики патологии для immunolabeling биопсия тканей3. Стандартный IHC может также использоваться для immunoprofiling ткани рака, включая количественный субпопуляций лимфоцитов опухольассоциированных и оценки выражения уровни иммунных контрольно-пропускных пунктов как запрограммированной клеточной смерти лигандом 1 (PD-L1)4 ,5. Стандартный IHC является ограниченным, однако в том, что в разделе ткани могут быть помечены только один антиген. Потому что immunoprofiling исследования, как правило, требуют анализа комбинированных выражение несколько маркеров, использование стандартных IHC потребует пятнать несколько разделов ткани, каждый витражи с одного маркера и следовательно, будет существенно ограничены для анализа проб небольших ткани как биопсия иглы ядро. Стандартные методы IHC также ограничены для оценки маркеров, которые coexpressed на различных клеточных популяций, как это обычно происходит с маркерами иммунной контрольно-пропускной пункт, например PD-L1, которая выражается опухольассоциированных макрофагов и раковые клетки. Это ограничение сообщалось в, например, использование стандартных monoplex IHC патологоанатомами для количественного анализа IHC маркера, выраженных клеток различных типов6. Разработка методов мультиплекс хромогенных IHC используя разнообразные цветные chromogens на же представляет раздел ткани выдвижение над стандартным методом ИГХ monoplex,7 , хотя они остаются ограничивается immunolabeling из нескольких маркеры и также представляет важную техническую проблему для надлежащей оценки маркеров, выраженных в же субцеллюлярные отсеков же клеточных популяций.
Вышеупомянутые оговорки относительно наличия ткани из клинических образцов, а также ограничения мультиплекс хромогенных IHC методов, привели к необходимости разработки мультиплекс методов для исследования иммуно онкология, основанные на флуоресцентные метки в сочетании с изображений системы, которые могут эффективно отделить сигналы нескольких флуорофоров от тот же слайд. Один из таких методов на основе усиления сигнала tyramide (АСП) в сочетании с многоспектральной микроскопии изображений для эффективного цвета разделения8. Коммерчески доступных комплект на основе TSA применяет флуорофоров, оптимизированный для многоспектральных изображений8 (см. Таблицу материалы). Важнейшим конкурентным преимуществом этой системы является ее совместимость с же немеченого первичного антитела, которые уже были проверены и оптимизирован для стандартных хромогенных IHC9,10,11. Это позволяет не только быстрее оптимизации, но и гибкость в оптимизации и группа изменений, включения новых целей. Кроме того, метод TSA мультиплекс иммунофлюоресценции (МВС) могут быть оптимизированы для коммерчески доступных автоматизированных систем IHC Стайнер, позволяя для простой передачи от monoplex хромогенных IHC mIF.
Здесь мы представляем протокол МВС группа для исследования иммуно онкология, основанные на автоматизированных mIF TSA окрашивание и использует многоспектрального сканера для воображения. Этот протокол могут быть адаптированы и изменение пользователем любой лаборатории с доступом к описано оборудование и реагенты. Протокол включает в себя группу из шести первичных антител для immunoprofiling карциномы: PD-L1, ПД-1, CD68 (как маркер Пан макрофагов), CD8 (Т-цитотоксические клетки), Ki-67 и AE1/AE3 (pan Цитокератины, используется как эпителиального маркер для идентификации карцинома клетки). Недавнее исследование описывает оптимизации ручной TSA mIF протокола с помощью хромогенных IHC как стандартную ссылку для проверки мультиплекс, окрашивание12. Обновленный метод, представленные здесь была разработана с помощью коммерчески доступных, семь цветов TSA комплект оптимизированы в автоматизированных Стайнер, резко сокращая окрашивания время от 3 – 5 дней до 14 h, а также улучшение согласованности окрашивание. Помимо подробного основного протокола, представленные здесь в разделе Дополнительных материалов включает в себя метод «капля контроль», процесс дополнительного контроля качества для оценки новой группы МВС, а также технические примечания для оптимизации, Устранение неполадок и разработка новых мультиплекс панелей, чтобы помочь пользователю настроить и оптимизировать метод mIF TSA для заказной mIF панелей лаборатории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Протокол, представленные здесь описывается выполнение immunoprofiling mIF группы с помощью TSA для шести антител (CD68, ki67, PD-L1, ПД-1, CD8 и AE1/AE3) на автоматизированных Стайнер (см. Таблицу материалы). Протокол также описывает, как выполнять перетаскивания элементов управления для контроля качества новой группы mIF (см. Дополнительные материалы). В этом протоколе окрашивание выполняется с восьми неокрашенных FFPE слайды из человека миндалин (положительный контроль) и восемь неокрашенных слайды из человеческих легких аденокарциномы. Первый слайд используется для полного мультиплекс окрашивания всех шести маркеров, второй слайд для изотипа управления, в котором используются не первичного антитела и оставшихся шести слайдов для перетаскивания элементов управления (см. Дополнительные материалы). Дополнительный элемент управления для ткани аутофлюоресценция настоятельно рекомендуется и всегда должны быть включены в многозальный кинотеатр исследования (см. Дополнительные материалы). Однако следователи могут использовать другие типы опухоли и контроля согласно их собственных целей проекта. Лаборатория пользователей без предыдущего опыта работы с mIF TSA метода и методики многоспектрального сканера следует читать мультиплекс IHC развития руководство (доступна в Интернете по адресу http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Хотя это руководство описывает ручной протокол, он также обеспечивает хорошее введение в mIF, окрашивания методом. Все разделы ткани, используемые в настоящем протоколе были обезличенные и утвержден в соответствии с Хельсинкской декларации.
1. ткань образцов
- Выберите образец человека миндалины FFPE, содержащие лимфоидной гиперплазии использоваться как положительный контроль и FFPE человеческих легких аденокарциномы образец заведомо PD-L1 положительный. Обзор гематоксилином и эозином (H & E) слайды выбранного легких Рак блоков, чтобы подтвердить наличие опухоли. Важно избежать опухоли с обильными области некроза, как это может увеличить фон неспецифичный пятнать.
Примечание: Для оптимизации, Избегайте использования парафиновых блоков, которые были сохранены для 10 или более лет и ткани с сушеные появление в блоке парафина (консультироваться со специалистом гистология). - Используя микротом, вырежьте 10 последовательных последовательных секций от каждого блока, толщиной 4 мкм. Смонтируйте разделы на положительно заряженный стеклянное скольжение для IHC, один раздел на слайд.
Примечание: Секции должны быть смонтированы совершенно плоские без морщин, как морщины могут генерировать окрашивание артефактов. Число слайдов серийный секций от 1 до 10. - Подготовьте новый H & E слайд на первой секции. Обзор H & E слайд с помощью патологоанатом, чтобы подтвердить наличие легких или ткани опухоли миндалины оставшиеся в блоке.
Примечание: Позднее, этот H & E слайд может помочь с выбором регионах, представляющих интерес для многоспектральный анализ и фенотип. - Храните неокрашенных разделы в коробке пластиковых слайдов на 4 ° C на срок до трех месяцев.
2. Создание новой mIF окрашивания программа автоматизированной Stainer: регистрация реагентов
Примечание: Реагенты должны быть добавлены к списку реагента в программного обеспечения автоматизированной Стайнер прежде чем они станут доступными для использования в протоколах. См Таблицу материалов для информации на автоматизированных Стайнер модель и версия программного обеспечения.
- Щелкните на вкладке реагентов в рамках программного обеспечения автоматизированной ситечко. Нажмите кнопку Добавить , чтобы назначить нового реагента. Введите имя (например, «520 TSA реагент») и сокращенное название (например, «520 TSA»), отметив, что есть не более восьми символов. Выберите вспомогательные из раскрывающегося меню и установите поставщик. Не изменяйте Стандартный пятно от DS сингл/последовательный. Настройка по умолчанию, окрашивание протокол к Протоколу F. Установите протокол по умолчанию HIER ЭР120.
- Сохранение нового реагента и повторите шаг 2.1 для всех реактивов, перечисленных в таблице 1.
3. автоматизированный Stainer: Регистрация контейнеров
- Напишите имя реагента для использования на стороне каждого контейнера. Сканирование штрих-кода на стороне. В всплывающем окне выберите правильный реагент из списка. Выберите дату окончания срока действия и сохранить.
- Повторите процедуру на шаге 3.1 для всех реактивов, перечисленных в таблице 1.
- Зарегистрируйте открытые исследования Kit. Сканировать как штрих-кода на стороне комплект и следуйте указаниям на экране. Имя комплекта «Мультиплексного исследования Kit 1.» Зарегистрировать 1 x tris (гидроксиметил) aminomethane (Tris)-буфер солевой раствор как часть комплекта (Таблица 1).
4. Автоматизированная Stainer: Создание протокола программы mIF
- Базовый протокол мультиплекс предварительно с именем Опал 7 мультиплекс на новых автоматизированных stainers (см. модель и версия программного обеспечения в Таблице материалы). Найдите протокола путем фильтрации для «всех» вместо «предпочтительный» на экране протокол. Если отсутствует базовый протокол, затем обновите программное обеспечение автоматизированных ситечко с помощи от производителя.
- Все изменения должны проводиться на копии оригинального протокола. Прежде чем вносить изменения, сохраните оригинал и создать копию, выбрав вкладку протоколы , затем щелкните правой кнопкой мыши Опал 7 мультиплекс протокол копирования.
- Измените имя на 7 мультиплекс протокол 1 в новом окне и выберите вкладку связанные с правильным устройством (слово модель или benchtop). Матч с протоколом в Дополнительной таблице S1. Нажмите кнопку Добавить реагент для добавления 10 мин пероксидазы ингибирование шаг (не является частью стандартного протокола) и выберите пероксидазы ингибитором как реагент.
- Подтвердите, что блокирующий шаги использовать PKI блокирующий буфер. Убедитесь, что каждое основное антитело относится к соответствующим реактивом, что вторичное антитело шаги используют HRP полимера, и что спектральные 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Комплект многоспектральных автоматизации используется. Подтвердите выбор, проверяя реагента, который был назначен для каждого соответствующего шага в раскрывающемся меню на экране протокол.
5. Автоматизированная Stainer: Добавление перетаскивания элементов управления и протокол управления Isotype
- Скопируйте имя 7 мультиплекс протокол 1 и изменить его на 7 мультиплекс протокол 1 CD68 DROP. Измените реагент Антитело CD68 Мыши IgG и сохранить протокол.
- Создание шести более новых протоколов, один для каждого элемента управления раскрывающегося и один для управления полным изотипа (изменение всех антитела к соответствующим изотипов) таким же образом.
6. автоматизированные Stainer: Слайд подготовка протокола
- Скопируйте prestaining протокол * испечь и Dewax и переименовать этот протокол многоспектральных испечь и Dewax 2 h.
- Настройте протокол для соответствия реагентов, показано в таблице 2. Выпекать слайды втечение 2 ч при температуре 60 ° C. DEWAX за 30 сек при 72 ° C.
7. Автоматизированная Stainer: Подготовка реагентов
- Подготовьте один комплект для обнаружения исследований. Один Реагент должен быть постоянно связан с этим комплектом, поэтому заполнить 30 мл открытый контейнер для 1 x трис амортизированное saline (TBS), отмеченные 1 x TBS и найти это в позиции 1 (габаритной ширины ручки) в комплект исследований обнаружения места для мультиплексного исследования Kit 1. этот реагент будет постоянно связан с этим комплектом исследования и не должны изменять позицию для использования в будущем.
- Ярлык два открытых контейнеров 30 мл Многоспектральных блока и Многоспектральных среднего. Заполните контейнер Многоспектральных блок с 30 мл блокирующий буфер/антитела разбавителя от многоспектральных окрашивание комплект. Заполните Многоспектральных вторичный контейнер с 30 мл mouse/анти-rabbit вторичное антитело полимера от многоспектральных окрашивание комплект.
- Подготовьте десять 7 мл открытые контейнеры. Необходимый объем в микролитров составляет 600 + (150 x [количество слайдов]). Каждое антитело будет применяться к 12 слайдов в данном случае (шесть миндалин и шесть легких). Маркировки и томов для всех контейнеров, обозначены в таблице 3.
- Для каждого антитела трубки, сначала добавьте антитела разбавителя, следуют сосредоточено основное антитело в объемах, указанных в таблице 3. Смешайте нежно закупорить.
- Подготовка 7 мл открытый контейнер для DAPI, используя четыре капли DAPI концентрата на миллилитр двойной дистиллированной воды; в общей сложности 16 будет быть запятнано с DAPI (600 + [150 x 16] = 3000 мкл). Добавьте 3 мл двойной дистиллированной воды плюс 12 капель спектральных DAPI в контейнер. Подготовьте свежие DAPI для каждого запуска.
- Подготовьте 7 мл открытый контейнер для пероксидазы ингибитора. Все 16 слайды будут рассматриваться с пероксидазой ингибитора (600 + [150 x 16] = 3000 мкл). Добавьте 3 мл конъюгат блока в контейнер.
- Перед подготовкой рабочей концентрации fluors, Ресуспензируйте все лиофилизированные fluors путем добавления 75 мкл диметилсульфоксида пробирки Флуор, предоставляемых производителем. Смешать, закупорить. Это акции Флуор TSA. Хранить при 4 ° C.
- Подготовьте шесть контейнеров титрования, один для каждого Флуор. Необходимый объем в микролитров составляет 350 + (150 x [количество слайдов]). Каждый Флуор будет применяться к 16 слайдов в данном случае (восемь миндалин и восемь легких). Маркировки и томов для всех контейнеров, обозначены в таблице 4.
- Когда все реагенты были зарегистрированы и подготовлен, место каждого контейнера в любом месте на стойке и загрузить все реагенты на автоматизированных ситечко. Зонд подтвердит объем каждого реагента.
8. Автоматизированная Stainer: Образец установки и многоспектральных пятнать
-
В программное обеспечение автоматизированных Стайнер щелкните слайд Настройка в верхней части экрана. Нажмите кнопку Добавить исследования. Заполните всплывающего окна с идентификатором исследование, исследование имя и комментарии.
- Выберите имя исследователя проводит окрашивание запуска из раскрывающегося списка. Оставьте объем дозировки в 150 мкл. Выберите многоспектральных Dewax для подготовки протокола. Нажмите кнопку OK и добавить слайд. В разделе Комментариивведите «Мультиплекс 1 легких 123ABC.» Заполните следующие поля, как указано: Ткани типа = тест ткани; Объем дозировки = 150 мкл; Окрашивания режим = сингл, обычные; Маркер = отрицательный; Пятнать = типа «7 мультиплекс протокол 1»; Подготовка = многоспектральных пекут, Dewax 2 ч; HIER = 20 мин с ЭР1 HIER.
- Нажмите кнопку добавить слайд и изменить комментарии и протокол для добавления раскрывающегося элемента управления слайды и изотипа управления слайд. Когда все слайды были добавлены к исследованию, закройте окно добавить слайд и печатать этикетки. Применение метки в области соответствующей метки на каждом слайде.
- Загрузить слайды в стойки, применяют покрытия плитки в правильной ориентации, вставить стойки в автоматизированных ситечко и Нижняя лотков. Устройство будет проверять этикетки слайд.
- Когда все слайды и реагенты отсканированы и измеряется. Кнопку запуска (►) станет активным. Если autostainer обнаруживает любые ошибки, такие как объем недостаточным реагента, символом желтое предупреждение появится, пострадавших лоток. Если возникает ошибка, щелкните правой кнопкой мыши символ осторожность и исправить ошибку.
- Инициировать, окрашивание немедленно или запланировать отложенный запуск. Протокол является приблизительно 14 h в продолжительности. Примечание: Убедитесь, что протокол будет завершена в то время, когда слайды могут быть удалены сразу как Эксес стирки может повлиять на результаты окрашивания.
9. Coverslipping многоспектральных слайдов
- Удалить слайды из автоматизированных ситечко и хранить их в шкаф, погруженной в 1 x TBS.
- Установите образцы с № 1,5 coverslips и 15 мкл монтажные средства массовой информации (см. Таблицу материалы). Удалите все пузырьки, нажав осторожно на coverslip с кончиком пипетки.
- Разрешить слайды для лечения на ночь при комнатной температуре на лабораторном столе. Невулканизованная слайды могут быть отсканированы сразу с тщательной обработке.
10. многоспектральный сканер
- Мощность на многоспектрального сканера и его компьютера (см. Таблицу материалы для сведения модели и программного обеспечения). Запустите программное обеспечение управления микроскопом. Откройте дверь многоспектрального сканера, сенсорные кнопки на передней части устройства. Каждый пружинный перевозчик в сканер проводит четыре слайды. Загрузить все слайды в перевозчиков и записать порядок перед загрузкой носителей в устройство.
- Выберите Изменить протокол и нажмите кнопку новый...; Затем создайте имя протокола мультиплекс группы 1 и удаления элементов управления. Создайте имя исследования Мультиплекс группы разработки, нажмите кнопку Создать протоколи введите Обзор сканирования фильтра DAPI; затем выберите Сканировать весь слайд и пикселей 0,50 мкм (20 X). Все фильтры и группы должны быть представлены. Если нет, нажмите кнопку изменить фильтры и группы, выберите все пять фильтров (DAPI, FITC, CY3, Техас красный и CY5) и затем нажмите кнопку Редактировать воздействия.
- Загрузите перевозчик, выбрав перевозчика с полной мультиплекс аденокарциноме легкого. Выберите правильный слайд с помощью графического пользовательского интерфейса. Фокус ткани, либо вручную, либо с использованием автофокуса. Перейдите к любой области с приемлемым DAPI окрашивание и нажмите кнопку Auto подвергать установить экспозицию в миллисекундах (0-2000 мс).
- Повторите ту же процедуру для всех пяти наборов фильтров в столбцах весь сканирования и MSI региона. Убедитесь, что для перехода к области с приемлемым окрашивание и переориентировать микроскопа перед установкой экспозиции для каждого фильтра и увеличение уровня. Авто выставить для всех пяти фильтров в 20 x общей проверки и 20 x многоспектральных изображений мультиспектрального регионов (MSI). Выберите разрешение пиксела 0,50 мкм (20 x). Сохраните протокол и нажмите кнопку назад для возврата на главный экран Vectra программного обеспечения; Нажмите кнопку Сканировать слайды.
- Откройте интерфейс для каждого слайда и задать задачу для сканирования. Установите исследование Мультиплекс группы развития, установить протокол мультиплекс группы 1и падение управления и установить Идентификатор слайда Мультиплекс легких ABC123, Мультиплекс CD68 Drop легких ABC123, и т.д. . Когда все слайды были помечены, и ставятся задачи, нажмите кнопку Сканировать. Автоматизированный многоспектральный сканер будет выполнять полный авто сканирования всех слайдов, используя все пять фильтров.
11. многоспектральный сканер: Многоспектральных изображений
- После завершения сканирования, откройте программное обеспечение QPTIFF («Phenochart») и нажмите кнопку Load слайд в верхнем левом углу. Это откроет QPTIFF, который является пяти фильтра целом слайд сканирования. Каждый слой содержит информацию из более чем одной Флуор, поэтому утилита является ограниченным, но структура ткани и широкое выражение модели являются очевидными и может использоваться для выбора областей для MSI.
- Перейдите к и открыть правильный слайд в исследовании с помощью раскрывающегося списка дерева на левой стороне. Войти (вверху справа) с инициалами пользователя.
- Выберите пяти регионов для MSI, используя инструмент « штамп » в верхней части экрана. Консультироваться патологоанатом, если таковой доступен. В разделе выбратьвыберите приобретения; в группе Размер в поляхвыберите 1 x 1; и сужение поля зрения, выберите 0,5 мкм (20 x). На основе Цитокератины (CK) окрашивание (главным образом в Cy5), выберите несколько регионов с опухолью (CK +) и стромы (CK-) для записи образа из общей проверки. Повторите эту процедуру для каждого слайда.
- После выбора всех MSI-файлов, закройте программного обеспечения Phenochart и вернуться к Vectra программного обеспечения. Измените задачу из сканирования на MSI для каждого слайда и затем нажмите сканирование снова выполнять коллекции MSI.
12. спектральные расслоение
Примечание: Спектральная unmixing шаг необходим для разделения канала и анализа изображений слайдов. Перед выполнением спектральных расслоение в программном обеспечении Информ, спектральной библиотеки должны быть построены с помощью слайды аденокарциномы легкого витражи с каждым Флуор самостоятельно и с DAPI только. Также эта процедура описана в вышеупомянутых мультиплекс IHC Assay развития руководстве.
- После завершения приобретения MSI используют спектральные unmixing программного обеспечения («Информ») для открытия файлов в папке MSI . Эти файлы заканчиваться расширением файла тип .im3.
- В разделе Формат изображениявыберите Multispectral; в разделе формат сэмплавыберите флуоресценции; и в разделе источник спектральной библиотеки, выберите Информ.
- Чтобы выбрать fluors, выбрать и загрузить все fluors шесть и DAPI из библиотеки построены с горками библиотека аденокарциномы легкого. Щелкните Подготовить все (внизу слева). Спектральная unmixing программного обеспечения будет выполнять спектральных расслоение на всех открытых изображений, используя предоставленный спектральные профили.
- С патологоанатом оцените окрашивание шаблон хромогенных одного пятна же целевого объекта в последовательном слайды же ткани.
13. Оценка интенсивности флуоресценции и затухание сигнала
Примечание: Графов инструмент, который выглядит как стрелка с коричневый коробочка, является наиболее важным инструментом для оптимизации мультиплекс и должны быть использованы часто (см. Дополнительные материалы). Используя средство графов в спектральных unmixing программного обеспечения, оцените соотношение сигнал шум, который как минимум должен превышать 10:1 (см. Дополнительные материалы для устранения неполадок и для оценки мультиплекс, окрашивание с перетаскивания элементов управления).
- 13.1. с изображением открытой в спектральных unmixing программного обеспечения привлекать средства графов и обследования изображений для оценки интенсивности флуоресценции каждого канала. Между 10 и 20 нормализованных графов целевой интенсивность в легочной ткани. Средство нормализованных графов показан на рисунке 1.
- Исключать слайды с рассчитывает максимальный сигнал графов области меньше, чем 10 или нормального сигнала менее пяти для любой маркер, чтобы аутофлюоресценция и пятнать пробить не конкурировать с подлинный сигнал.
- Исключить слайды с максимальной подсчитывает больше чем 30 для любого канала, чтобы избежать спектральных кровотечение или неэффективных спектральных расслоение.
- Решения высокой или низкой нормализованных графов, регулируя TSA концентрации.
14. анализ многоспектральных изображений
- Открыть один или несколько MSI в спектральных unmixing программного обеспечения , и только выбрать fluors для расслоение, представлены в по крайней мере один открыть изображение. Щелкните Подготовить все для unmix все в настоящее время открыт цветных изображений для получения изображения спектральным несмешанных.
- Выберите инструмент графов для обследования рассчитывает через каждого изображения путем колебаться над области интереса.
- Выберите значок глаза, чтобы открыть редактор представлений. Выберите и настройте интенсивность отображения каждого независимого канала.
- Выберите настроить , чтобы открыть сегментации ткани, клетки сегментации, фенотипа и скоринга модули. Эти инструменты необходимы для объективной проверки мультиплекс, окрашивание против хромогенных одного пятна и может использоваться для создания данных количественных phenoptic (Рисунок S1).
- Используйте Экспорт вкладку, чтобы сохранить оттенки серого, флуоресцентные, pathview стиль несжатого TIFF и файлов данных из модулей анализа phenoptic для дальнейшего анализа, архивирования и презентаций (Рисунок S1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, описанные здесь будет обеспечивать результаты, как показано на рисунке 2. Начните с оценки пятнать в элементе миндалин, начиная с поверхности плоскоклеточный эпителий. Гистология миндалин образца могут пересматриваться с патологоанатом, используя H & E слайд в качестве образца. Если хромогенный IHC секции выполняются с же маркеров на один и тот же блок ткани, это может использоваться для подтверждения плотности и распределения каждого маркера на слайде mIF. Как показано на рисунке 2A, ткани миндалин должны обеспечить четко определенных AE1/AE3 Цитокератины окрашивание поверхности плоского эпителия миндалин (рис. 2A; помечены как красный цвет), без фона в лимфоидных ткани. Окрашивание должно быть цитоплазмы, иногда с мембраной акцентуации, и ядра должен быть отрицательным. Сетчатые эпителия в склепы должно быть положительным для cytokeratins (красный) и PD-L1 (рис. 2A; зеленый цвет). Следует затем определить фолликулярной зародышевых центров миндалин. Зародышевых центров должны быть легко узнаваемыми и должна быть богата Ki-67-положительные лимфоциты (рис. 2A; желтый цвет). Ki-67 пятнать всегда должно быть ядерное. Макрофаги в зародышевых центров также должно быть легко узнаваемы, иногда как крупных клеток (также называется «окрашивающийся тела»). Они будут показывать положительный пятнать для CD68 как гранулированный цитоплазматических пятно (рис. 2A; оранжевый цвет). Также ожидается переменная доля CD68 клеток вне зародышевых центров. Макрофаги могут показать мембраны, пятнать для PD-L1. Это обычно бледнее по интенсивности окрашивания для PD-L1 в эпителии сетчатые. Там должно быть без ядерных CD68 пятнать. CD8 должен пятно лимфоцитов с распределением Т-клеток (меньше в зародышевых центров и большую долю в межфолликулярных областях; см. рис. 2А, голубой цвет). CD8 + лимфоцитов являются обычно небольшие клетки с скудной цитоплазмой, поэтому практически невозможно отличить мембраны против цитоплазмы в лимфоцитах. PD-1 будет сильно пятно малых лимфоцитов в зародышевого центра области, обычно сгруппированы на периферии зародышевых центров (рис. 2A; пурпурный цвет), а также рассеянных лимфоцитов в регионе межфолликулярных, обычно показаны ниже интенсивности окрашивания чем те в районе зародышевого центра. Как и в случае с CD8, невозможно четко различать мембраны и цитоплазматических пятнать в малых лимфоцитов, окрашенных с PD-1. Поскольку переменная доля CD8 клетки коэкспрессируют PD-1, рекомендуется для целей контроля качества, что окрашивание шаблон и распределения каждого маркера, что окрашенные в тканях же сравнивать с хромогенных IHC ссылка слайды, как это предлагается в ранее опубликованных протоколов12.
После ожидаемого окрашивание шаблон был подтвержден в элементе ткани миндалин, провести оценки пятнать в образце рака легких (рис. 2B). Потому что опухоль тканей, как ожидается, показать выражение переменной и гетерогенных маркеров, это очень важно во время оптимизации новой группы МВС для сравнения окрашивание шаблон для каждого индивидуального маркера наблюдается в mIF метода и его выражения наблюдается в стандартной хромогенных IHC слайд, оценки количества и распределения позитивных клеток как описано12. Тем не менее должны быть сохранены основные окрашивание шаблон; к примеру cytokeratins должны соблюдаться в цитоплазме эпителиальных клеток и никогда не в ядре; CD68 должен появиться как гранулированный цитоплазматических пятнать в макрофагах, и т.д.. Важно отметить, что в некоторых маркеров, интенсивность окрашивания может изменяться от управления миндалин в ткани рака; например PD-1 и PD-L1 может Показать нижний интенсивности окрашивания в опухолевой ткани по сравнению с очень высокой выражение в миндалинах управления. Таким образом, важно для выполнения оценки и оптимизации с помощью графов инструмента в Информ программного обеспечения, используя примеры опухолевых тканей, вместо того, чтобы элементы миндалин.
Наконец isotype отрицательных и перетаскивания элементов управления должны оцениваться не только для обнаружения фона и аутофлюоресценция, но и для эффектов зонтик и спектральные кровотечение (рис. 3 и рис. 4). Isotype элементы управления не должны продемонстрировать любые иммуноокрашивания через слайд; Если наблюдается любой окраски, необходимо пересмотреть изображений или пятная процедуру. Перетаскивания элементов управления имеют важное значение для оценки потенциальных артефакты в окрашивание, такие как спектральные кровотечение или зонтик эффекты, благодаря метод mIF в процессе оптимизации новой мультиплекс группы (см. Рисунок 5, Дополнительная цифра S2, Дополнительная цифра S3и Дополнительные материалы). Флуоресцентный monoplex и падение управления следует оценить и по сравнению с полным мультиплекс группы. Каждый элемент управления перетаскивания должен показать тот же шаблон окрашивание, за исключением одного основного антитела, которые должны быть удалены для каждого конкретного элемента управления. Дополнительная информация представлена в разделе Дополнительных материалов .
Рисунок 1 : информировать подсчитывает инструмент. Информ программного обеспечения графов инструмент активируется, выбрав значок бежевые коробки. Нормализованное графов исправлены битовая глубина, время экспозиции, выгоды и сегментирования. Изображения были взяты при 20-кратном; в баре шкалы = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель результаты. Миндалин (A) и (B) легких nonsmall клеточной карциномы окрашивали PD-L1 (520 TSA, зеленый), CD8 (540 TSA, голубой), Ki67 (570 TSA, желтый), CD68 (620 TSA, оранжевый), Цитокератины (650 TSA, красный) и PD-1 (690 TSA, пурпурный). Ниже в небольших групп отдельно представлены отдельные каналы. Маркер отображается в верхнем правом углу каждого изображения. Изображения были взяты при 20-кратном; Шкалы бар = 50 (или 250 мкм). Указано в группе A , 1) лимфоидных фолликулов, 2) зародышевого центра, 3) межфолликулярных области и 4) стратифицированных плоского эпителия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Эффект блокировки/Зонты TSA. Это пример 690 TSA, сданный PD-1 блокирующие антитела CD3 сигнал образом зависит количество TSA настоящего. Яркая 690 сигнала TSA наиболее эффективно блокирует 620 сигнала TSA (легких nonsmall клеточной карциномы витражи с анти PD-1 D4W2J на 30 мин в 0.52 мкг/мл или изотипа следуют TSA обнаружения мин 10 690 1: 100; затем, анти CD3 F7.2.38 на 30 мин в 0,14 мкг/мл После обнаружения 620 TSA 10 мин при 1: 100). Изображения были взяты при 20-кратном; в баре шкалы = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Спектральный кровоточить. Ткани легких nonsmall клеточной карциномы был окрашенных с Ki-67 управлением падения протокол (полный мультиплекс с антитело Ki-67 опущены). Показано 540 TSA канале (CD8) и 570 TSA (Ki-67). Нет ядерной окрашивание шаблон является очевидной, но уменьшилось копию CD8 пятнать шаблон наблюдается в 570 TSA канале. Это лучше всего решать путем обеспечения сопоставимых окрашивание интенсивности во всех каналах. В этом случае добавление надежный сигнал Ki-67 (нормализованное засчитывается между 10 и 20) будет исправить спектральных кровоточить. Изображения были взяты при 20-кратном; в баре шкалы = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Падение управления. Эта цифра показывает составное изображение полного Мультиплексный по сравнению с того же региона последовательных слайды аденокарциномы легкого, окрашенных с перетаскивания элементов управления, в которых указано основное антитело был опущен. Изображения были взяты при 20-кратном; Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Имя | Имя сокр. | Тип | Контейнер | Группа |
| Блокирует буфер PKI | OPALBLOK | Вспомогательные | Открытие 30 мл | Общие |
| Опал полимер HRP | ОПАЛ 2AB | Вспомогательные | Открытие 30 мл | Общие |
| OPAL 1 x TBS | OPAL1TBS | Вспомогательные | Открытие 30 мл | Det. Kit |
| PG-M1 Mus CD68 0.30 мкг/мл | OPALCD68 | Вспомогательные | Открыто 7 мл | Общие |
| MIB-1 Mus Ki67 0,61 мкг/мл | OPALki67 | Вспомогательные | Открыто 7 мл | Общие |
| PD-L1 0,20 мкг/мл SP263 раб | OPALPDL1 | Вспомогательные | Открыто 7 мл | Общие |
| PD-1 0,52 мкг/мл D4W2J раб | ОПАЛ PD1 | Вспомогательные | Открыто 7 мл | Общие |
| CD8 0,70 мкг/мл SP239 раб | ОПАЛ CD8 | Вспомогательные | Открыто 7 мл | Общие |
| CK 0,24 мкг/мл AE1/AE3 муз | ОПАЛ CK | Вспомогательные | Открыто 7 мл | Общие |
| Мыши IgG | ОПАЛ MUS | Вспомогательные | Открыто 7 мл | Общие |
| IgG кролика | ОПАЛ РАБ | Вспомогательные | Открыто 7 мл | Общие |
| Опал пероксидазы блок | OPALPERX | Вспомогательные | Открыто 7 мл | Общие |
| Спектральные DAPI | OPALDAPI | Вспомогательные | Титрование 6 мл | Общие |
| Опал 520 реагент | ОПАЛ 520 | Вспомогательные | Титрование 6 мл | Общие |
| Опал 540 реагент | ОПАЛ 540 | Вспомогательные | Титрование 6 мл | Общие |
| Опал 570 реагент | ОПАЛ 570 | Вспомогательные | Титрование 6 мл | Общие |
| Опал 620 реагент | ОПАЛ 620 | Вспомогательные | Титрование 6 мл | Общие |
| Опал 650 реагент | ОПАЛ 650 | Вспомогательные | Титрование 6 мл | Общие |
| Опал 690 реагент | ОПАЛ 690 | Вспомогательные | Титрование 6 мл | Общие |
Таблица 1: Leica Бонд RX протокол, опал реагентов
| Реагент | Время (h) | Температура (градусы Цельсия) | |
| 1 | Не реагент | 120:00 | 60 |
| 2 | Бонд Dewax решение | 0:30 | 72 |
| 3 | Бонд Dewax решение | 0:00 | 72 |
| 4 | Бонд Dewax решение | 0:00 | Ambient (комнатной температуры) |
Таблица 2: Опал подготовка протокола
| Цель | мкг/мл | Клон | Источник | Много | Запасов мкг/мл | Мкл растворителя | МКЛ AB |
| CD68 | 0,3 | PG-M1 | Дако | 20043031 | 30 | 2376 | 24 |
| Ki67 | 0,61 | MIB-1 | Дако | 20049476 | 46 | 2368.17 | 31.83 |
| PD-L1 | 0.2 | SP263 | Вентиляционное отверстие. | F09591 | 1.61 | 2101.86 | 298,14 |
| PD-1 | 0,52 | D4W2J | КНТ | 1 | 100 | 2387.52 | 12.48 |
| CD8 | 0,7 | SP239 | Вентана | 160318 | 70 | 2376 | 24 |
| CK | 0,24 | AE1/AE3 | Дако | 10129428 | 179,5 | 2396.79 | 3.21 |
| Муз IgG | 0,61 | ||||||
| Раб IgG | 0,7 |
Таблица 3: Подготовка первичных антител.
| Флуор опал | Слайды | Разбавление | Мкл растворителя | Флуор опал мкл |
| Опал 520 | 16 | 1: 200 | 2736.3 | 13,8 |
| Опал 540 | 16 | 1:700 | 2746.1 | 3.9 |
| Опал 570 | 16 | 1: 150 | 2731.7 | 18.3 |
| Опал 620 | 16 | 1: 100 | 2722.5 | 27,5 |
| Опал 650 | 16 | 1: 350 | 2742.1 | 7.9 |
| Опал 690 | 16 | 1: 150 | 2731.7 | 18.3 |
Таблица 4: Подготовка Fluor опал.
Дополнительного материала Word документ: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот документ.
Дополнительные рисунок 1: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.
Дополнительные рисунок 2: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.
Дополнительная цифра 3: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.
Справочная таблица 1: Leica Бонд RX опал мультиплекс протокол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Справочная таблица 2: обзор и сравнение полного мультиплекс, падение и элементы управления полностью изотипа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Продолжающихся рака иммунотерапия революция является открытие Роман и обещая терапевтические возможности для раковых больных13. Достижения в области иммуно онкологии потребует расширения знаний воспалительной опухолью микроокружения, не только понять биологии иммунологические механизмы, участвующие в канцерогенеза, но и найти интеллектуального биомаркеров для новых Иммунотерапия основе лечения1,2. Из-за сложных биологии рака иммунологии допроса образцов ткани опухоли обычно требуется для разработки растущий список иммунных маркеров, которые взаимодействуют друг с другом и часто coexpressed от различных клеточных популяций в ткани1 ,2,5. Клинические испытания обычно используют небольшие биопсий, таких как ядро иглы или эндоскопической биопсий, которые собираются в различных точках терапии для оценки и мониторинга реакции больного. Такие биопсий предоставляют ограниченное количество ткани, которая в свою очередь ограничивает количество разделов ткани, которые могут быть использованы для рака immunoprofiling. Это ограничение является особенно обременительным, когда используются традиционные методы, такие как стандартный monoplex МГС. Таким образом, существует четкая нужны новые методы для рака immunoprofiling, которые делают использования методов мультиплекс мощностью одновременно оценить ИССЛЕДОВАНИџ различных биомаркеров и более эффективно использовать ценные ткани образцов.
В мультиплекс окрашивание и многоспектральных изображений методов, подробно описано здесь mIF панель используется для исследования иммуно онкологии на FFPE ткани, такие как биопсий клинических испытаний. Этот метод описанный ранее, проверки и успешно применяется для рака immunoprofiling8,9,10,11,12,14, 15. ранее опубликованные протоколы описали аналогичные mIF пятная методы с TSA-систем на основе, например, семь цветов комплект, который занимает много времени и требует около 4 дней работы на выделенный лаборатории ученого12 ,15. В ответ на эти недостатки этот протокол был оптимизирован с помощью коммерчески доступных автоматизированных Стайнер, резко сокращать окрашивания время до 14 h и ликвидации изменчивость, введены вручную операторами. Визуализация проводится на многоспектральный сканер, способный отделять спектры семь или более флуоресцентные сигналов в мультиплекс слайды, включая аутофлюоресценция, которые могут быть эффективно удалены без ухудшения качества сигнала. Этот протокол можно реплицировать, изменение и выполнена любым пользователем лаборатории с доступом к документам и реагенты, подробно изложены в Таблице материалов.
Важные шаги в этом протоколе содержатся разделы 7, 10, 11, 12. Статья 7 относится к подготовке реагентов. Тщательная подготовка реагентов для мультиплекс пятнать важно, требующих пристального внимания лаборатории ученого или техник, чтобы избежать изменения зависит от оператора. Например одна из основных проблем с мультиплексной метод пятнает изменчивость, которая может быть уменьшена путем тщательной подготовки растворов реагентов, специально TSA красители. Разделы 10 и 11 связанные с приобретением изображений. Важным риском является чрезмерное или перенасыщения изображений, которые могут привести к спектральной отвода, артефакта, в котором сигнал от другой канал мешает с каналом изображаемого (см. Дополнительные материалы). Тщательно регулирующего воздействия раз может помочь предотвратить перенасыщения и спектральные кровоточить. Спектральная расслоение проводится в разделе 12. Это зависит от подготовки спектральной библиотеки (описанный в мультиплекс IHC Assay развития руководстве, доступные онлайн). В этом шаге Информ программное обеспечение является «обучить» конкретно признать цветов для каждого TSA красителя. Спектральной библиотеки создан с помощью секции от управления ткани, такие как человека миндалин, окрашенных с равномерно выраженной маркера, например CD20, в сочетании с каждой индивидуальной TSA красителя на отдельные слайды. Кроме того аутофлюоресценция слайды (также описан в мультиплекс руководство развития Assay IHC) необходимы для обучения программного обеспечения Информ признать и вычесть аутофлюоресценция ткани. Аутофлюоресценция управления слайды должны подготовлен с использованием образцов из же тканей, изучается (например, рака легких и др.), таким же, как слайды mIF и инкубировали с первичных и вторичных антител, но без красителя TSA. Может быть выбран только один аутофлюоресценция спектральных профиль, поэтому необходимо позаботиться о том, чтобы выбрать представление наблюдаемых аутофлюоресценция, которая может исходить от коллаген, фиброз, красные кровяные клетки, эндогенного пигментов и других источников. Создание новой спектральной библиотеки в начале каждого нового проекта и с помощью аутофлюоресценция спектра, который является представителем исследование образцов тканей, а так работает же блоков ткани в качестве позитивного элемента управления для каждого пакета в том же проекте, ценным методологических шаги, которые помогут улучшить согласованность спектрального расслоение через различных образцов в рамках того же проекта.
Мультиплекс метод, описанный в настоящем Протоколе предлагает несколько средств устранения неполадок, включая оценщика сигнал шум (графов инструмент), падение управления (Дополнительные материалы) и представление патологии для контроля качества окрашивания. Графов инструмент помогает оценить интенсивность окрашивания и уровень фона. При высокой интенсивности и/или фоновые уровни первый подход является сокращению разбавления Краска АСП. Если проблема сохраняется, Хромогенный IHC слайды, используются для оптимизации этого конкретного маркера должны рассматриваться с патологоанатом, глядя на наличие фона. По мнению патологии генерируется Информ программного обеспечения, используя представление Диаминобензидин как псевдоцветном флуоресценции от Флуор АСП связаны, а также искусственного гематоксилином представительство из всех флуоресцентные сигналов, включая DAPI . Изображения с патологией зрения помочь с визуальная оценка окрашивания моделей патологоанатом для улучшения пятнать. Эти инструменты всегда должны быть использованы в процессе оптимизации новой панели и контроля качества шаги во время процесса окрашивания.
MIF метод требует использования первичных антител, которые были должным образом проверены и оптимизирован для стандартных хромогенных IHC на формалин Исправлена ткани. Например одним из основных преимуществ метода mIF TSA является ее совместимость с использованием первичных антител, которые были проверены и оптимизированы в анатомической патологии лаборатории для клинического использования12. Это преимущество означает, что мультиплекс панелей могут быть настроены пользователем Лаборатория ответить вопросы иммунологии конкретных рак без необходимости preconjugated антител, обеспечивая панели быстрого и динамичного развития. В этой связи процесс фактической для оптимизации новой группы начинается с проверки и оптимизации антител с стандартным хромогенных IHC, ищет лучших разрежения и пятнать условий, которые обеспечат чистой и последовательной пятнать. Следующий шаг, используя же разведений, оптимизированный для IHC, заключается в передаче окрашивание с помощью TSA fluors вместо Диаминобензидин и сравнить результаты monoplex immunofluorescent АСП с хромогенных IHC как ссылка. Наконец антитела могут быть объединены в mIF окрашивание, всегда используя хромогенных IHC пятнать шаблон как ссылку на элемент управления для регулировки mIF TSA окрашивание параметров, главным образом разведениях Краска АСП и окрашивание последовательности. В ходе этого процесса совместно с патологоанатом инструментальная оценить качество окрашивания.
Ограничения этой техники включают в себя время и усилия, необходимые для оптимизации и проверки новых панелей и анализ Иммунофенотипирование mIF панелей. Основной проблемой, однако, является надлежащей проверки методов mIF. Отсутствие надлежащей проверки этих методов несет риск возникновения неправильные результаты, которые могут добавить заблуждение данные литературы, тем самым препятствуя попытки добиться лучшего понимания биологии рака иммунологии16. Это, таким образом, incumbent на детектива, чтобы сделать все возможное, чтобы правильно проверить мультиплекс методы, включая обеспечение тесного участия и патологи с профессиональной подготовкой и опытом в проверку и оценку ткани Гистопатология и методы, основанные на ИГХ17,18,19,20. Здесь представлены протокол включает некоторые из инструментов, которые могут помочь с проверкой новой мультиплекс группы, включая оценку патологии H & E слайдов до окрашивания и анализ, использование хромогенных IHC как ссылку для оптимизации mIF TSA Окрашивание, метод управления drop для контроля качества новой группы и использование isotype, Аутофлюоресценция, мультиплекс и элементов управления. Несмотря на технические сложности mIF методов технологий, таких как многоспектральных изображений с спектральные расслоение, а также другие Роман мультиплекс платформ, открывает новую эру для анализа образцов ткани от пациентов и создания новых форм данных, которые невозможно с стандартным IHC одиночку. Таким образом разработка и применение методов mIF будет продолжать расти, став мощные инструменты для рака immunoprofiling биопсии для клинических испытаний и помогает определить новые многопараметрических интеллектуального биомаркеров для иммунотерапии, Благодаря, прежде всего, больной раком.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эта работа была поддержана визуальной, глобальной biologics R & D подразделением компании АстраЗенека. К.р. К.В и C.C.H. являются сотрудниками Perkin Elmer, который производит реагентов (TSA комплект) и многоспектральные сканеры, которые были использованы в этой работе. М.с., к.д., A.H., W.Z., C. Бэгналл, C. Браун, J.C., а.л., к.с., м.р. и J.R.C. являются сотрудниками визуальной с владения акциями и/или запасов интересы или опции в компании АстраЗенека.
Acknowledgments
Редакционная поддержка была оказана Дебора Шуман визуальной.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
