Summary
Detaylı bir iletişim kuralı için bir altı-marker multiplex ayirt panel en iyi duruma getirilmiş ve gerçekleştirilen, daha tutarlı sonuçlar ve daha kısa işlem süresi için bir otomatik stainer kullanarak. Bu yaklaşım doğrudan IMMUNO-Onkoloji araştırmalar amaçlı herhangi bir laboratuvar tarafından adapte edilebilir.
Abstract
IMMUNO-Onkoloji devam eden gelişmeler kanser İmmünoloji mekanizmaları artan bir anlayış gerektirir. Doku örnekleri formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) biyopsi immunoprofiling analizini roman akıllı biyolojik kanserli hastalarda için keşfetmek ve tümör İmmünoloji karmaşıklığını anlamak için önemli bir araç haline gelmiştir. Immunoprofiling analiz dokuların inflamatuar hücre altgrupları ve bağışıklık denetim noktaları, tümör microenvironment dahil olmak üzere birleştirilmiş işaretleyicilerin görünümünü değerlendirme gerektirir. Standart monoplex immünhistokimya (IHC) daha roman multiplex immunohistokimyasal yöntemleri gelişiyle tek doku bölümler daha verimli multiparametric analiz için izin verir. Yöntemi tyramide-sinyal güçlendirme üzerinde temel ve spektral mikroskobik analizi ile birlikte (), bir piyasada bulunan çok katmanlı ayirt doku çeşitli işaretlerinin daha iyi bir sinyal ayrılması için sağlar. Bu metodoloji FFPE doku örnekleri üzerinde standart IHC için optimize edilmiş çekimsiz birincil antikor kullanımı ile uyumludur. Burada biz ayrıntılı olarak multiplex sağlayan otomatik bir protokol Karsinomu doku örnekleri PD-L1, oluşan bir altı-marker multiplex antikor panel ile etiketleme tarif PD-1, CD68, CD8, Ki-67 ve AE1/AE3 cytokeratins ile 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole Nükleer hücre counterstain. Çok katmanlı masası iletişim kuralı bir otomatik IHC stainer bundan el ile iletişim kuralı daha kısadır ve doğrudan uygulanan ve herhangi bir laboratuvar araştırmacı IMMUNO-Onkoloji araştırmalar insan FFPE doku örneklerini tarafından uyarlanmış bir boyama süre için optimize edilmiştir. Ayrıca açıklanan çeşitli denetimler ve en iyi duruma getirme ve doğrulama tekniği için yararlı olan yeni bir multiplex Eğer panel iyi kalite kontrolü için bir damla-denetim yöntemi de dahil olmak üzere araçları vardır.
Introduction
Immunoprofiling analiz FFPE tümör doku örnekleri IMMUNO-Onkoloji çalışmaları, keşif ve Roman akıllı biyolojik kanserli hastalarda klinik1 bağlamında için doğrulama için özellikle önemli bir bileşeni haline gelmiştir ,2. Diaminobenzidine gibi kimyasal chromogens kullanarak chromogenic IHC standart tekniği biyopsi doku3immunolabeling için tanılama patoloji kalır. Standart IHC Nefelometri tümör ilişkili lenfosit altgrupları ve değerlendirme (PD-L1)4 programlı hücre ölümü ligand 1 gibi bağışıklık denetim noktaları ifade düzeylerinin de dahil olmak üzere kanser dokusu immunoprofiling için de kullanılabilir. ,5. Standart IHC ancak, içinde tek bir antijen doku bölüm başına etiketli sınırlıdır. İmmunoprofiling çalışmalar genellikle birkaç işaretleri kombine ifade analizini gerektirdiği için standart IHC kullanımı birden fazla doku bölümlerini boyama gerektirir, her tek bir marker ile lekeli ve bu nedenle, olur önemli ölçüde küçük doku örnekleri gibi çekirdek iğne biyopsileri analizi için sınırlı. Standart IHC yöntemleri de farklı hücre popülasyonlarının, PD-L1, tümör ilişkili makrofajlar ve kanser hücreleri tarafından ifade edildiği gibi bağışıklık denetim noktası işaretçileri olan ortak olduğu gibi tarafından coexpressed işaretleri değerlendirilmesi için sınırlıdır. Bu sınırlama standart monoplex IHC kullanımı, örneğin, farklı hücre türleri6tarafından ifade edilen bir IHC işaretleyici Nicel analiz patologlar tarafından bildirilmiştir. Her ne kadar onlar kalır aynı doku bölümü temsil üzerinde çeşitli renkli chromogens standart IHC monoplex yöntemi,7 üzerinde bir gelişme istihdam multiplex chromogenic IHC yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde, sadece bir kaç immunolabeling tarafından sınırlı işaretleri ve ayrıca aynı hücre popülasyonlarının aynı hücre altı bölmeleri içinde ifade işaretleri doğru değerlendirme için önemli bir teknik sorun mevcut.
Doku kullanılabilirlik klinik örnekleri yanı sıra multiplex chromogenic IHC teknikleri, sınırlamaları ile ilgili olarak yukarıda belirtilen uyarılar artış dayalı IMMUNO-Onkoloji çalışmaları için gelişmiş çok katmanlı yöntemler geliştirmek gerek verilen hiç Floresan etiketleme etkin bir şekilde birden fazla fluorophores sinyalleri aynı slayttan ayırabilirsiniz sistemleri Imaging ile birlikte. Böyle bir tekniği spektral mikroskobu görüntüleme için verimli renk ayrımı8ile birlikte tyramide sinyal güçlendirme (TSA) temel alır. Piyasada bulunan bir TSA tabanlı kiti spektral görüntüleme8 için en iyi duruma getirilmiş fluorophores istihdam ( Tablo malzemelerigörmek). Bu sistem bir kritik zaten doğrulanmış ve standart chromogenic IHC9,10,11için en iyi duruma getirilmiş aynı etiketlenmemiş birincil antikorlar ile uyumluluk avantajdır. Bu yeni hedefler birleştiren en iyi duruma getirme ve panel değişiklikleri sadece daha hızlı optimizasyonu aynı zamanda esneklik sağlar. Ayrıca, multiplex ayirt (mIF) TSA yöntemi bırakmak monoplex basit bir transfer için piyasada bulunan otomatik IHC stainer sistemler için optimize edilebilir chromogenic IHC Finans Yüksek Lisans için.
Burada temel IMMUNO-Onkoloji çalışmalar için bir MIF panel MIF TSA boyama otomatik ve görüntüleme için spektral bir tarayıcı kullanan bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı uyarlanmış ve açıklanan araçları ve Kimyasalları erişimi olan herhangi bir laboratuvar Kullanıcı tarafından değiştirilebilir. Protokol karsinomlar immunoprofiling için altı birincil antikorların bir panel içerir: PD-L1, PD-1, CD68 (olarak bir pan-makrofaj marker), CD8 (sitotoksik T hücreleri), Ki-67 ve AE1/AE3 (pan-cytokeratin epitel bir işaretleyici tanımlanması için kullanılan, Karsinomu Hücre). Yeni yapılan bir çalışmada12boyama multiplex doğrulamak için standart bir başvuru olarak chromogenic IHC kullanarak el ile bir TSA MIF protokol optimizasyon açıklar. Güncellenme Zamanı yöntemi burada sunulan büyük ölçüde kısaltılması da boyama tutarlılığını geliştirirken boyama zaman 3-5 gün 14 h, otomatik bir yapıcısı içinde en iyi duruma getirilmiş bir piyasada, yedi renkli TSA kiti kullanılarak geliştirilmiştir. Burada sunulan ayrıntılı ana protokolüne ek olarak bir Ek malzeme kısım "damla-control" yöntemi, yeni bir MIF panel yanı sıra optimizasyonu için teknik notlar değerlendirmek için bir ek kalite kontrol süreci içerir, sorun giderme ve laboratuvar Kullanıcı ayarlamak ve MIF TSA Yöntem özelleştirilmiş MIF panelleri için en iyi duruma getirmek için yardımcı olmak için yeni çok katmanlı paneller geliştirilmesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Burada sunulan protokolü için altı antikorlar TSA kullanarak immunoprofiling bir MIF panelinin gerçekleştirmek açıklar (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 ve AE1/AE3) bir otomatik stainer üzerinde ( Tablo malzemelerigörmek). Protokol ayrıca yeni bir MIF panel bir kalite kontrolü için açılan denetimleri gerçekleştirmek açıklar ( Tamamlayıcı Malzemelerigörmek). Bu protokol için boyama sekiz günahı FFPE slaytlardan insan bademcik (pozitif kontrol) ve insan akciğer adenokarsinom üzerinden sekiz günahı slaytlar ile gerçekleştirilir. İlk slayttan tam multiplex tüm altı işaretleri, ikinci slayt içinde hiçbir birincil antikorlar kullanılmaktadır izotip kontrol için ve geri kalan altı slayt ( Tamamlayıcı Malzemelerigörmek) açılan denetimler için boyama için kullanılır. Doku autofluorescence için ek bir denetim önerilir ve her zaman bir multiplex dahil edilmelidir ( Tamamlayıcı Malzemelerigörmek) çalışma. Ancak, araştırmacılar diğer tümör türleri ve proje hedeflerine göre denetimleri kullanabilirsiniz. MIF TSA yöntemi ve spektral tarayıcı teknikleri ile önceki deneyimi olmayan kullanıcılar Laboratuvar Multiplex IHC geliştirme Rehberi okumalısınız (elde edilebilir online olarak http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Olsa da bu kılavuz, el ile bir protokol açıklar, ayrıca yöntemi boyama MIF için iyi bir tanıtım sağlar. Bu protokol için istihdam tüm doku bölümleri anonim ve Helsinki Deklarasyonu göre onaylanmış.
1. doku örnekleri
- Olumlu bir denetimi ve PD-L1 olarak bilinen bir FFPE insan akciğer adenokarsinom örnek kullanılmak üzere lenfoid hiperplazi içeren bir FFPE insan bademcik örnek seçin olumlu. Hematoksilen ve eozin (H & E) slaytlar bir tümör varlığını doğrulamak için seçili akciğer kanseri blokların gözden geçirin. Bu belirsiz arka plan boyama artabilir tümör nekroz bol alanlar ile önlemek önemlidir.
Not: Bu iyileştirme için 10 yıl veya daha fazla saklı parafin blok kullanmaktan kaçının ve doku parafin blok (Histoloji teknisyeni ile konsültasyon) kurutulmuş bir görünüme sahip. - Bir microtome kullanarak, her blok 10 ardışık seri bölümleri, 4 µm kalınlığında kesilmiş. Bölümleri IHC, slayt başına bir bölümü için kullanılan bir pozitif yüklü cam kaymak bağlama.
Not: Kırışıklıkları boyama eserler üretmek gibi bölümler mükemmel düz kırışıklık, monte gerekir. 10 1 seri bölümler slaytlara numara. - İlk bölümünde yeni bir H & E slayt hazırlamak. Blok içinde kalan Bademcik dokusu veya akciğer tümörü varlığını doğrulamak için bir patolog yardımı ile H & E slayt gözden geçirin.
Not: Bu H & E slayt, daha sonra spektral analiz ve fenotipleme ilgi bölgelerinde yelpazesi ile yardımcı olabilir. - Günahı bölümler 4 ° C'de bir plastik slayt kutusunda üç aya kadar saklayın.
2. yeni MIF Staining Program otomatik Stainer Tarih yaratılış: reaktifleri kaydı
Not: Önce onlar kullanılmak üzere protokol are reaktifler otomatik stainer yazılımında reaktif listesine eklenmesi gerekir. Bilgi için Malzemeler tablo otomatik stainer modeli ve yazılım sürümü görmek.
- Otomatik stainer yazılımından reaktifler sekmesine tıklayın. Yeni bir reaktif belirtmek için Ekle ' yi tıklatın. Adı (örneğin, "520 TSA reaktif") ve kısaltılmış adı (örneğin, "520 TSA"), en fazla sekiz karakter kayda girin. Yardımcı aþaðý açýlan menüsünden seçin ve üreticiye ayarla. Tek/Çift Kişilik leke Tek/ardıl DSdeğiştirmeyin. Protokolü Protokolf boyama varsayılan ayarla. Varsayılan HIER Protokolü ER1 20' ye ayarla.
- Yeni reaktif ve Tablo 1' de listelenen adımı yineleyin 2.1 tüm reaktifler için kaydedin.
3. otomatik Stainer: Kayıt kapları
- Her kapsayıcı tarafında kullanılacak reaktif adını yazın. Yan barkod tarama. Açılan pencerede doğru reaktif seçin. Bir süre sonu seçin ve kaydedin.
- 3.1. adımda tüm reaktifler Tablo 1' de listelenen yordamı yineleyin.
- Açık araştırma Kit kayıt. Her iki barkodlar kiti tarafında inceden inceye gözden geçirmek ve takip ekrandaki. Belgili tanımlık teçhizat "Multiplex araştırma seti 1." isim 1 x tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) kayıt-serum bu setleri (Tablo 1) bir parçası olarak arabelleğe alınmış.
4. otomatik Stainer: Bir MIF Protokolü Program oluşturulması
- Temel çoklu iletişim kuralı yeni otomatik stainers (bkz. Tablo reçetesimodeli ve yazılım sürümünde) üzerinde Opal 7 Multiplex adda önceden yüklenmiştir. Protokol için "tüm" "tercih yerine" Protokolü ekranda süzerek bulun. Temel protokol yoksa, otomatik stainer yazılım üreticisinden yardım ile güncelleştirin.
- Tüm değişiklikleri özgün iletişim kuralını kopyalarını üzerinde yapılmalıdır. Değişiklik yapmadan önce özgün kaydedin ve protokoller sekmesini tıklatarak, sonra Opal 7 Çoklu iletişim kuralı sağ tıklatıp Kopyalaseçerek bir kopya oluşturun.
- Adı değiştirmek için 7 Multiplex protokolü 1 yeni pencerede ve doğru aygıtı (zemin modeli veya benchtop) ile ilişkili sekmesini seçin. Ek tablo S1protokolünde aynı. Bir 10 min peroksidaz inhibisyon adım (Standart protokol parçası olmayan) eklemek ve peroksidaz inhibitörü reaktif seçmek için Reaktif Ekle'yi tıklatın.
- Engelleme adımları bir PKI engelleme tampon kullanmak onaylayın. Her birincil antikor anlamına uygun reaktif için ikincil antikor adımları bir HRP polimer kullanmak, ve spektral Otomasyon kit ile sağlanan bu spektral ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanılan emin olun. Tüm seçenekleri damla-aşağı yemek listesi ilgili her adımda Protokolü ekrandaki için belirlenmiş reaktif denetleyerek doğrulayın.
5. otomatik Stainer: Ayrıca açılan denetimleri ve izotip kontrol Protokolü
- Adı 7 Multiplex protokolü 1 kopyalayın ve 1 CD68 damla 7 Çoklu iletişim kuralıdeğiştirin. Fare IgG CD68 antikor reaktif değiştirmek ve protokol kaydedin.
- Altı daha yeni iletişim kuralları, her damla denetim için diğeri için (tüm antikorlar için uygun isotypes değiştirme) tam izotip kontrol aynı şekilde oluşturun.
6. otomatik Stainer: Slayt hazırlama Protokolü
- Prestaining iletişim kuralı kopyalamak * fırında ve Dewax ve spektral fırında ve Dewax 2 hbu iletişim kuralı yeniden adlandırın.
- Tablo 2' de gösterilen reaktifler eşleştirmek için protokol ayarlayın. 60 ° C'de 2 h slaytlarını fırında 30'dewax 72 ° C'de s
7. otomatik Stainer: Reaktifleri hazırlanması
- Bir araştırma algılama çantası hazırla. Dolgu 30 mL açık şişe 1 x Tris arabelleğe alınmış serum (TBS) 1 x TBS ile işaretlenmiş ve bu pozisyonda 1 (en uzak kolu) belirlenmiş araştırma algılama kit ile Multiplex araştırma kiti bulmak bir reaktif kalıcı olarak bu kiti ile ilişkilendirilmiş olması gerekir 1. Bu reaktif kalıcı olarak bu araştırma kiti ile ilişkili olacak ve ileride kullanmak için pozisyon değiştirmemelisiniz.
- İki 30 mL açık kapsayıcı Spektral blok ve Spektral ikinciletiketleyin. Spektral blok konteyner engelleme arabellek/antikor spektral boyama seti için seyreltici 30 mL ile doldurun. Spektral ikincil konteyner spektral boyama seti anti-mouse/anti-rabbit ikincil antikor Polimer 30 mL ile doldurun.
- On 7 mL açık konteynerler hazırlayın. 600 microliters içinde gerekli birimdir + (150 x [slayt sayısını]). Her antikor (altı bademcik ve altı akciğer) Bu durumda 12 slayt için uygulanır. Etiketleme ve birimleri tüm kapsayıcıları için Tablo 3' te belirtilir.
- Her antikor tüp için önce antikor ekleyin seyreltici, cilt olarak konsantre birincil antikor ardından Tablo 3' te belirtilen. Nazik pipetting tarafından karıştırın.
- 7 mL açık şişe DAPI, DAPI konsantresi çift distile su mililitre başına dört damla kullanarak hazırlamak; Toplam 16 DAPI ile lekeli (600 + [150 x 16] = 3000 µL). Çift distile su 3 mL artı 12 damla spektral DAPI konteyner içine ekleyin. Taze DAPI her çalışma için hazırlamak.
- 7 mL açık şişe peroksidaz inhibitörü için hazırlayın. Tüm 16 slaytları peroksidaz inhibitörü ile tedavi edilebilir (600 + [150 x 16] = 3000 µL). Peroksidaz blok 3 mL kap içine ekleyin.
- Fluors çalışma konsantrasyonları hazırlamadan önce bütün lyophilized fluors dimetil sülfoksit 75 µL üreticisi tarafından sağlanan her fluor tüp ekleyerek resuspend. Pipetting tarafından mix. Bu TSA fluor hisse senedi var. 4 ° C'de mağaza
- Altı titrasyon kaplar, her fluor için hazırlayın. 350 microliters içinde gerekli birimdir + (150 x [slayt sayısını]). Her fluor buna göre (sekiz bademcik ve sekiz akciğer) 16 slaytlara uygulanır. Etiketleme ve birimleri tüm kapsayıcıları için Tablo 4' te belirtilir.
- Tüm reaktifler kayıtlı ve hazırlanan, bir raf üzerinde herhangi bir yere her kapsayıcı yerleştirin ve tüm reaktifler otomatik stainer üzerine yük. Sonda her reaktif hacmi onaylayacaktır.
8. otomatik Stainer: Örnek kurulum ve spektral boyama
-
Otomatik stainer yazılım, ekranın üstündeki slayt yapısı'nı tıklatın. Ekle çalışma'yı tıklatın. Çalışma kimliği, çalışma adı ve Yorumlar ile açılır pencere doldurmak.
- Aþaðý açýlan listeden boyama çalışma yürütülmesi araştırmacı adını seçin. Besleme birimi 150 µLbırakın. Seçin spektral Dewax hazırlık Protokolüiçin. Slayt Ekle'yive Tamam ' ı tıklatın. Yorumaltında "1 akciğer 123ABC Multiplex." yazın Gösterildiği gibi aşağıdaki alanları doldurun: Doku tipi Test doku; = Besleme birimi 150 µL; = Staining modu tek =, rutin; Marker negatif; = Boyama = yazın "7 protokolü 1 Multiplex"; Hazırlık spektral fırında, = 2 h; Dewax HIER HIER ER1 ile 20 dk =.
- Ekle slaydı tıklatın ve Yorumlar ve açılan denetim slaytlar ve izotip kontrol slayt eklemek için iletişim kuralı değiştirin. Tüm slaytları çalışma odasına eklendiğinde, Ekle slayt penceresini kapatın ve etiketleri yazdırmak. Her slaytta uygun etiket alan etiketleri uygulamak.
- Slaytlar raflar yüklemek kapak fayans doğru yönde uygulamak, rafları otomatik stainer yerleştirin ve tepsileri alt. Belgili tanımlık aygıt-ecek inceden inceye slayt etiket.
- Ne zaman tüm slaytlar ve Kimyasalları taranan ölçülen ve. (►) çalıştırma düğmesi etkin hale gelir. Autostainer yetersiz reaktif hacmi gibi herhangi bir hata algılarsa, bir sarı uyarı simgesi tarafından etkilenen tepsi görünecektir. Bir hata oluşursa, uyarı simgesini sağ tıklayın ve hatasını düzeltmek.
- Hemen boyama başlatmak veya gecikmeli start zamanlayın. Süre içinde yaklaşık 14 h protokolüdür. Not: Protokol exess yıkama boyama sonuçları etkileyebilir gibi ne zaman slaytlar hemen kaldırılabilir bir anda tamamlayacak emin olun.
9. Coverslipping spektral slaytların
- Slaytları otomatik stainer kaldırmak ve onları 1'batık bir raf depolamak TBS. x
- No 1.5 coverslips ve 15 µL ( Tablo malzemelerigörmek) montaj medya örnekleriyle bağlayın. Herhangi bir baloncuklar yavaşça coverslip pipet ucu ile basarak kaldırın.
- Gecede laboratuvar tezgah üzerinde oda sıcaklığında tedavi slayt izin. İyileşmemiş slaytlar ile dikkatli işleme hemen taranabilir.
10. spektral inceden inceye gözden geçirmek
- Güç spektral inceden inceye gözden geçirmek ve onun bilgisayar üzerinde ( Malzemeler tablo modeli ve yazılım bilgi için bakın). Mikroskop kontrol yazılımını başlatın. Cihazın ön yüzünde dokunmatik düğmesine basarak spektral inceden inceye gözden geçirmek kapıyı açacağım. Tarayıcı yaylı her taşıyıcıya dört slaytlar içerir. Tüm slaytları taşıyıcıları yük ve taşıyıcıları cihaza yüklemeden önce sipariş kayıt.
- Düzenleme protokol seçin ve yeni...'ıtıklatın; ardından, iletişim kuralı adı Multiplex paneli 1 ve damla denetimlerioluşturun. Multiplex paneli geliştirmeçalışma oluşturun, Oluşturma iletişim kuralı' nı ve Genel tarama filtresi DAPIyazın; ardından, Tüm slayt tarama ve Pixel kararlılık 0,50 µm (20 X)seçin. Tüm filtreleri ve Grup temsil edilmeli. Eğer değilse, filtreleri Düzenle ve gruplar'ıtıklatın, tüm beş filtreleri (DAPI, FITC, CY3, Texas kırmızı ve CY5) seçin ve Etkilenmeler Düzenle'yitıklatın.
- Taşıyıcı taşıyıcı ile akciğer adenokarsinom tam multiplex seçerek yükleyin. Doğru slaydı grafik kullanıcı arabirimini kullanarak seçin. Doku el ile veya otomatik odaklama kullanarak odak. Kabul edilebilir DAPI boyama ile gezinin ve pozlama milisaniye cinsinden ayarlamak için Auto-maruz tıklatın (0-2000 ms).
- Tüm beş filtre kümesi tüm inceden inceye gözden geçirmek ve MSI bölge sütunlar için aynı işlemi tekrarlayın. Kabul edilebilir boyama ile bir alana gidin ve pozlama her filtre ve büyütme düzeyi için ayarlamadan önce mikroskop yönlendirmesi emin olun. Auto-maruz 20 x genel tarama ve 20 x spektral görüntüleme (MSI) spektral bölgelerin tüm beş filtreleri için. 0.50 µm (20 x) piksel çözünürlüğü seçin. Kullanılacak protokol kaydetmek ve Vectra yazılım ana ekrana dönmek için geri düğmesini tıklatın; sonra Tarama slaytlar' ı tıklatın.
- Her slayt için arabirimi açık ve görev inceden inceye gözden geçirmekiçin. Çalışma Multiplex paneli geliştirmeiçin Multiplex paneli 1 ve damla denetimleriiçin protokol ayarlanmasý ve Slayt numarası Multiplex akciğer ABC123, Multiplex CD68 damla akciğer ABC123, vb koymak . Tüm slaytları etiketli ve görevleri ayarlamak zaman Tara' yı tıklatın. Otomatik spektral inceden inceye gözden geçirmek tüm beş filtreleri kullanarak tüm slaytların tam slayt tarama gerçekleştirir.
11. spektral tarayıcı: Spektral görüntüleme
- Tarama tamamlandıktan sonra QPTIFF yazılım ("Phenochart") açmak ve sol üst Yük slayt ' ı tıklatın. Bu-ecek açık bir QPTIFF, beş-filtre bütün-slayt tarama olduğu. Her katmanı bilgileri birden fazla fluor, belgili tanımlık yarar sınırlıdır, ama geniş ifade desenleri ve doku yapısı belirgin olduğu ve bölgeler için MSI seçmek için kullanılan içerir.
- Gidin ve sol tarafta açılan ağacını kullanarak çalışma odasında doğru slayt açın. (Üst sağ) Kullanıcı adının baş harfleri ile oturum.
- Beş bölge için MSI ekranın üst kısmında Damga aracını kullanarak seçin. Varsa bir patolog başvurun. İçin seçinaltında satın almaseçin; boyut alanlarıaltında 1 x 1seçin; ve alan kısıtlamaaltında 0.5 µm (20 x)seçin. (Esas Cy5) boyama cytokeratin (CK) bağlı olarak, birden fazla bölge tümör (CK +) ve stroma (CK genel tarama yansıması için-) seçin. Bu yordamı her bir slayt için yineleyin.
- Tüm MSI'lerini seçildikten sonra kapatmak Phenochart bilgisayar yazılımı ve Vectra yazılımı iade. Görev inceden inceye gözden geçirmek MSI için her bir slayt için değiştirin ve sonra tekrar MSI toplama gerçekleştirmek için tarama ' yı tıklatın.
12. spektral Unmixing
Not: Spektral unmixing adım Kanal ayırma ve görüntü analizi slaytların için gereklidir. Spektral unmixing INFORM yazılımında yapılmadan önce spektral Kütüphane akciğer adenokarsinom slaytlar ile her fluor DAPI ile yalnız ve yalnız lekeli kullanarak yerleşik gerekir. Bu yordamı ayrıca anılan Multiplex IHC tahlil geliştirme Kılavuzu'nda açıklanmıştır.
- MSI satın alma işleminiz bittiğinde, MSI klasördeki dosyaları açmak için spektral unmixing ("INFORM") yazılımını kullanın. Bu dosyaları .im3 dosya türü uzantısı ile sona.
- Resim biçimialtında Multispectralseçin; örnek biçimialtında floresansseçin; ve spektral kitaplık kaynağıaltında INFORMseçin.
- Fluors seçmek için seçin ve tüm altı fluors ve DAPI akciğer adenokarsinom Kütüphane slaytlar ile inşa kütüphane yüklemek. Hazırlamak tüm (sol alt)'i tıklatın. Spektral unmixing yazılım spektral sağlanan spektral profilleri kullanarak, tüm açık görüntülerde unmixing gerçekleştirir.
- Bir patolog ile aynı doku sıralı slaytları aynı hedef chromogenic tek lekeleri karşı boyama desen değerlendirmek.
13. floresan yoğunluğu ve sinyal zayıflama değerlendirilmesi
Not: Bir ok ile küçük kahverengi bir kutu olarak görünür, sayıları aracı multiplex optimizasyonu için en önemli bir araçtır ve sık sık kullanılması gerektiğini ( Tamamlayıcı Malzemelerigörmek). Spektral unmixing yazılımında sayar aracıyla, en az 10:1 ( Tamamlayıcı Malzemeleri bkz: sorun giderme ve damla denetimleriyle boyama multiplex değerlendirilmesi için) aşmalıdır sinyal-gürültü oranı değerlendirmek.
- 13.1. ile bir görüntü spektral unmixing yazılımında açık, sayıları aracı meşgul ve fotoğrafları her kanal floresan yoğunluğu değerlendirmek için anket. Akciğer dokusunda hedef yoğunluk arasında 10 ve 20 normalleştirilmiş sayıları var. Normalleştirilmiş sayar aracı Şekil 1' de gösterilen.
- Autofluorescence ve hedef kapalı boyama otantik sinyal ile rekabet değil böylece maksimum sinyal sayıları daha az 10 veya normal sinyal alan sayıları az beş için herhangi bir marker ile slaytlar hariç.
- Dışlama slaytlar ile en fazla 30 spektral kanama veya verimsiz spektral unmixing önlemek herhangi bir kanal için daha büyük sayar.
- Yüksek veya düşük normalleştirilmiş sayar TSA konsantrasyon ayarlayarak adresi.
14. spektral görüntü analizi
- Bir veya daha fazla MSI spektral unmixing yazılım açın ve yalnızca fluors bu unmixing için en az bir açık görüntü gösterilir. Tüm şu anda açık renkli görüntüler hayalice karışmamış görüntüler vermeye ayıramayacağız için Hazırlamak tüm ' i tıklatın.
- Sayıları her görüntü faiz area(s) getirerek ankete sayar aracını seçin.
- Görünüm Düzenleyicisi'ni açmak için göz simgesini seçin. Seçin ve her bağımsız kanal görüntü yoğunluğunu ayarlayın.
- Doku segmentasyon, hücre segmentasyon, fenotipleme ve skor modülleri açmak için Yapılandır ' ı seçin. Bu araçları karşı chromogenic tek lekeleri boyama multiplex objektif doğrulama için gereklidir ve nicel phenoptic verileri (Şekil S1) oluşturmak için kullanılabilir.
- Gri tonlama, floresan kaydetmek için Dışa Aktar sekmesini, pathview tarzı sıkıştırılmamış TIFF ve phenoptic analiz modüllerden veri dosyaları daha fazla analiz, arşivleme ve sunumlar (Şekil S1) için kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan protokol bu Şekil 2' de gösterildiği gibi sonuçlar sağlar. Yüzey skuamöz hücreli epitel ile başlayan bademcik denetimdeki boyama bir değerlendirme ile başlayın. Bademcik örnek Histoloji H & E slayt bir referans olarak kullanarak bir patolog ile incelenebilir. Chromogenic IHC bölümler aynı doku blokta aynı imleçli gerçekleştirilmesi durumunda, daha sonra bunlar yoğunluğu ve her işaretçisi MIF slayt üzerindeki dağılımı onaylamak için kullanılabilir. Şekil 2içindeAgösterildiği gibi Bademcik dokusu açıkça tanımlanmış AE1/AE3 cytokeratin bademcik yüzey skuamöz epitel içinde boyama sağlamalıdır (Şekil 2A; kırmızı yalancı etiketli), arka planda lenfoid olmadan doku. Boyama sitoplazmik membran vurgulama ile zaman zaman olmalı ve çekirdekleri negatif bir sayı olmalıdır. Kriptalarının retiküle epitel cytokeratins (kırmızı) ve PD-L1 (Şekil 2A; yeşil yalancı) için pozitif olmalıdır. O zaman, bademcik foliküler germinal merkezleri tanımlanması gereken. Germinal merkezleri kolayca tanınabilir olmalıdır ve Ki-67-pozitif lenfositler (Şekil 2A; sarı yalancı) zengin olmalıdır. Ki-67 boyama her zaman nükleer olmalıdır. Germinal merkezleri mevcut makrofajlar da bazen daha büyük hücreleri ("tingible organları" olarak da adlandırılır) kolayca tanınabilir olmalıdır. Onlar için CD68 taneli sitoplazmik leke (Şekil 2A; portakal yalancı) boyama olumlu gösterir. Germinal merkezleri dışındaki CD68 hücreleri değişken bir kısmı da beklenen bir şey. Makrofajlar PD-L1 için boyama membran gösterebilir. Bu retiküle epitel PD-L1 için boyama daha şiddeti genellikle soluk var. Orada-meli var olmak hayır nükleer CD68 boyama. CD8 lenfosit T-hücre dağılımı ile leke (daha az germinal merkezleri ve büyük oranda interfollicular alanlarda; bkz. Şekil 2A, Camgöbeği yalancı). Sitoplazma karşı membran lenfositler olarak ayırt etmek neredeyse imkansız bu yüzden CD8 + lenfositlerinin yetersiz sitoplazma ile genellikle küçük hücreler vardır. PD-1 güçlü genellikle germinal merkezleri (Şekil 2A; kırmızı yalancı) çevre kümelenmiş germinal merkez alanda küçük lenfositler leke, hem de genellikle lenfosit interfollicular bölgede dağınık daha düşük bir boyama yoğunluğu daha fazla germinal merkez alan olan gösterilen. CD8 gibi ile membran ve sitoplazmik küçük lenfositler PD-1 ile lekeli boyama açıkça ayırt etmek mümkün değildir. CD8 hücreleri değişken bir kısmı coexpress PD-1, kalite kontrol boyama desen ve dağıtımı aynı dokularda lekeli her işaretçisi olarak önerilen chromogenic IHC başvuru slaytlar ile karşılaştırılmak amaçlar için bu önerilir daha önce yayımlanmış protokolleri12'.
Beklenen boyama desen Bademcik dokusu denetiminde onaylandıktan sonra akciğer kanseri örnek (Şekil 2B) boyama değerlendirmek için devam edin. Tümör Doku işaretleri değişken ve türdeş olmayan bir ifade göster bekleniyor, MIF yöntemi ve onun ifade gözlenen her bireysel işaretçi için boyama desen karşılaştırmak için yeni bir MIF panel en iyileştirme sırasında çok önemlidir çünkü Standart chromogenic IHC slayt, miktar ve pozitif hücrelerinin dağılımı yukarıda açıklanan12olarak değerlendiren görülmektedir. Yine de, temel boyama desen korunmalıdır; Örneğin, cytokeratins epitel hücre sitoplazma ve hiç bir çekirdek dikkat edilmelidir; CD68 olarak taneli sitoplazmik makrofajlar, boyama görünmelidir vb. Önemlisi, bazı işaretler, kanser dokusu ile bademcik denetiminden boyama yoğunluğu değişebilir; Örneğin, PD-1 ve PD-L1 daha düşük yoğunluktaki bademcik denetiminde gözlenen çok yüksek ifade ile karşılaştırıldığında tümör dokusunda boyama gösterebilirsiniz. Bu, bu nedenle, değerlendirme ve sayıları aracıyla optimizasyonu kullanarak tonsil denetimleri ziyade tümör doku örneklerini INFORM yazılımında gerçekleştirmek önemlidir.
Son olarak, izotip negatif ve açılan denetimi sadece arka plan ve autofluorescence tespiti için aynı zamanda şemsiye etkileri ve spektral taşma payı (Şekil 3 ve Şekil 4) değerlendirilmesi gerekir. İzotip denetimleri herhangi bir immunostaining arasında slayt göstermelidir değil; herhangi bir boyama gözlem yapılırsa, görüntüleme veya yordam boyama revisited gerekir. Açılan denetimleri, spektral taşma payı ya da şemsiye etkileri mIF yöntemi yeni bir multiplex panel en iyileştirme sırasında nedeniyle gibi boyama içinde potansiyel eserleri değerlendirmek önemlidir (bkz: 5 rakam, Tamamlayıcı Şekil S2, Takıma giren şekil S3ve ek malzeme). Floresan monoplex ve bırak denetimleri değerlendirildi ve tam multiplex panel ile karşılaştırıldığında. Her açılan denetimi belirli her denetimin kaldırılması gerektiğini tek birincil antikor dışında aynı boyama desen göstermelidir. Daha fazla bilgi Ek malzemeler bölümünde sağlanır.
Resim 1 : sayar aracı bilgilendirmek. Inform yazılım sayar aracın bej kutusu simgesini seçerek aktive edilir. Normalleştirilmiş sayar bit derinliği, pozlama süresi, kazanç ve binning için düzeltilir. Görüntüleri 20 X büyütme oranında alındı; ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Temsilcisi sonuçları. (A)bademcik ve (B) nonsmall hücreli akciğer karsinomu CD8 PD-L1 ile (520 TSA, yeşil), lekeli (540 TSA, Camgöbeği), Ki67 (570 TSA, sarı), CD68 (620 TSA, turuncu), cytokeratin (650 TSA, kırmızı) ve PD-1 (690 TSA, macenta). Tek tek kanalları ayrı ayrı küçük paneller aşağıda temsil edilir. İşaretçiyi her görüntünün sağ üst belirtilir. Görüntüleri 20 X büyütme oranında alındı; Ölçek çubuğu = 50 (veya 250 µm). Masası'nda A 1 belirtilir) lenfoid folikül, 2) germinal Merkez, 3) interfollicular alan ve 4) tabakalı skuamöz epitel. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : TSA engelleme/şemsiye etkisi. Bu bir PD-1 antikor-engelleme CD3 sinyal TSA mevcut miktarına bağımlı bir şekilde yatırılır 690 TSA örneğidir. En parlak 690 TSA sinyal en etkin şekilde 620 TSA sinyali engelliyor (nonsmall hücreli akciğer karsinomu lekeli ile 0.52 µg/mL veya 1: 100; daha sonra anti-CD3 F7.2.38 0.14 µg/mL, 30 dk, bir 10 min 690 TSA algılama ardından izotip 30 dk için anti-PD-1 D4W2J 1: 100, 10 min 620 TSA algılama ve ardından). Görüntüleri 20 X büyütme oranında alındı; ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Spektral taşma payı. Nonsmall hücreli akciğer karsinomu doku ile Ki-67 damla-Denetim Protokolü (tam multiplex protokolü ile Ki-67 antikor atlanmış) lekeli. 540 TSA kanal (CD8) ve 570 TSA kanal (Ki-67) gösterilir. Hiçbir nükleer boyama desen belirgindir, henüz CD8 desen boyama azalmış bir kopyasını 570 TSA kanalda görülmektedir. Bu en iyi tüm kanallarda karşılaştırılabilir boyama yoğunluklarda sağlayarak ele olduğunu. Bu durumda, sağlam Ki-67 sinyal (10 ile 20 arasında normalleştirilmiş sayıları) eklenmesi spektral taşma payı doğru olacaktır. Görüntüleri 20 X büyütme oranında alındı; ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Damla denetimleri. Bu şekilde tam bir bileşik görüntü içinde belirtilen birincil antikor ihmal damla denetimleriyle lekeli akciğer adenokarsinom sıralı slaytları aynı bölge ile karşılaştırıldığında çok katmanlı gösterilir. Görüntüleri 20 x büyütme oranında alındı; Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Adı | Petróva adı | Türü | Konteyner | Grup |
| PKI arabellek engelleme | OPALBLOK | Yardımcı | Açık 30 mL | Genel |
| Opal polimer HRP | OPAL 2AB | Yardımcı | Açık 30 mL | Genel |
| OPAL 1 x TBS | OPAL1TBS | Yardımcı | Açık 30 mL | Det. Kit |
| CD68 0.30 µg/mL PG-M1 Mus | OPALCD68 | Yardımcı | Açık 7 mL | Genel |
| Ki67 0,61 µg/mL MIB-1 Mus | OPALki67 | Yardımcı | Açık 7 mL | Genel |
| PD-L1 0,20 µg/mL SP263 Rab | OPALPDL1 | Yardımcı | Açık 7 mL | Genel |
| PD-1 0,52 µg/mL D4W2J Rab | OPAL PD1 | Yardımcı | Açık 7 mL | Genel |
| CD8 0.70 µg/mL SP239 Rab | OPAL CD8 | Yardımcı | Açık 7 mL | Genel |
| CK 0,24 µg/mL AE1/AE3 Mus | OPAL CK | Yardımcı | Açık 7 mL | Genel |
| Fare IgG | OPAL MUS | Yardımcı | Açık 7 mL | Genel |
| Tavşan IgG | OPAL RAB | Yardımcı | Açık 7 mL | Genel |
| OPAL peroksidaz blok | OPALPERX | Yardımcı | Açık 7 mL | Genel |
| Spektral DAPI | OPALDAPI | Yardımcı | Titrasyon 6 mL | Genel |
| Opal 520 reaktif | OPAL 520 | Yardımcı | Titrasyon 6 mL | Genel |
| Opal 540 reaktif | OPAL 540 | Yardımcı | Titrasyon 6 mL | Genel |
| Opal 570 reaktif | OPAL 570 | Yardımcı | Titrasyon 6 mL | Genel |
| Opal 620 reaktif | OPAL 620 | Yardımcı | Titrasyon 6 mL | Genel |
| Opal 650 reaktif | OPAL 650 | Yardımcı | Titrasyon 6 mL | Genel |
| Opal 690 reaktif | OPAL 690 | Yardımcı | Titrasyon 6 mL | Genel |
Tablo 1: Leica Bond RX protokolü, Opal reaktifler
| Reaktif | Saat (h) | Sıcaklık (santigrat derece) | |
| 1 | Hiçbir reaktif | 120:00 | 60 |
| 2 | Bond Dewax çözüm | 0:30 | 72 |
| 3 | Bond Dewax çözüm | 0:00 | 72 |
| 4 | Bond Dewax çözüm | 0:00 | Ortam (Oda sıcaklığı) |
Tablo 2: OPAL hazırlık Protokolü
| Hedef | µg/mL | Klon | Kaynak | Çok | Hisse senedi µg/mL | µL eritici | ΜL AB |
| CD68 | 0,3 | PG-M1 | Dako | 20043031 | 30 | 2376 | 24 |
| Ki67 | 0,61 | MIB-1 | Dako | 20049476 | 46 | 2368.17 | 31.83 |
| PD-L1 | 0,2 | SP263 | Havalandırma. | F09591 | 1,61 | 2101.86 | 298.14 |
| PD-1 | 0,52 | D4W2J | CST | 1 | 100 | 2387.52 | 12,48 |
| CD8 | 0,7 | SP239 | Ventana | 160318 | 70 | 2376 | 24 |
| CK | 0,24 | AE1/AE3 | Dako | 10129428 | 179.5 | 2396.79 | 3.21 |
| Muş IgG | 0,61 | ||||||
| Rab IgG | 0,7 |
Tablo 3: Birincil antikorlar hazırlık.
| Opal Fluor | Slaytlar | Seyreltme | µL eritici | µL opal Fluor |
| Opal 520 | 16 | 1: 200 | 2736.3 | 13,8 |
| Opal 540 | 16 | 1:700 | 2746.1 | 3.9 |
| Opal 570 | 16 | 1:150 | 2731.7 | 18,3 |
| Opal 620 | 16 | 1: 100 | 2722.5 | 27,5 |
| Opal 650 | 16 | 1:350 | 2742.1 | 7.9 |
| Opal 690 | 16 | 1:150 | 2731.7 | 18,3 |
Tablo 4: OPAL Fluor hazırlık.
Ek malzeme Word belgesi: Bu belgeyi karşıdan yüklemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 1: Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı resim 2: Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı şekil 3: Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Ek tablo 1: Leica Bond RX Opal Multiplex protokolü. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Ek tablo 2: Özet ve tam multiplex, açılan denetimleri ve tam izotip denetimleri. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Devam eden kanser immünoterapi devrim açılış roman ve umut verici olan kanser hastaları13için tedavi seçenekleri. IMMUNO-onkoloji alanında gelişmeler inflamatuar tümör microenvironment, sadece immünolojik mekanizmaların karsinojenezis içinde yer alan biyoloji anlamak için aynı zamanda akıllı biyolojik için yeni bulmak için artan bilgi gerektirir immünoterapi dayalı tedaviler1,2. Kanser İmmünoloji karmaşık biyoloji nedeniyle, tümör doku örnekleri sorgulama genellikle etkileşim ile her diğer ve sık sık farklı hücre popülasyonlarının doku1 tarafından coexpressed bağışıklık işaretleri, gittikçe artan sayıda geliştirmek için gereken ,2,5. Klinik çalışmalarda genellikle çekirdek iğne veya değerlendirmek ve hasta yanıt izlemek için terapi farklı noktalarda toplanır endoskopik biyopsi gibi küçük biyopsi istihdam. Böyle biyopsi sırayla kanser immunoprofiling için istihdam doku bölümleri sayısını sınırlar doku sınırlı miktarda sağlar. Standart monoplex IHC, gibi geleneksel teknikleri kullanıldığında bu özellikle külfetli bir kısıtlamadır. İşte, bu nedenle, açık bir kanser için yeni yöntemler için yapmak immunoprofiling kapasiteli multiplex teknikleri aynı anda farklı biyolojik coexpression değerlendirmek için ve değerli doku örneklerin daha etkin biçimde kullanmasına olanak kullanmak.
Multiplex boyama ve spektral görüntüleme yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanan, bir MIF panel IMMUNO-Onkoloji araştırmalar FFPE dokularda bir klinik üzerinden biyopsi gibi kullanılır. Bu yöntem olan daha önce açıklanan, doğrulanmış ve başarıyla uygulanan kanser immunoprofiling8,9,10,11,12,14' e, 15. daha önce yayımlanmış protokolleri benzer MIF yöntemleri gibi zaman alıcı ve bir özel laboratuvar bilim adamı12 ' yaklaşık 4 gün çalışma gerektirir yedi renkli kiti TSA tabanlı sistemler ile boyama tarif var ,15. Bu eksiklikleri yanıt olarak, bu iletişim kuralı bir piyasada bulunan otomatik stainer, önemli ölçüde zaman 14 h boyama ve el ile işleçleri tarafından tanıtılan değişkenlik ortadan kısaltılması kullanarak optimize edilmiştir. Görüntüleme spektral tarayıcı çok katmanlı slaytlar autofluorescence, verimli bir şekilde sinyal kalitesini düşürmeden kaldırılabilir dahil olmak üzere, yedi veya daha fazla floresan sinyallerini spectra ayıran yetenekli üzerinde yapılır. Bu iletişim kuralı yinelenmiş, değiştirilebilir ve aletler ve Malzemeler tabloayrıntılı kimyasalları erişimi olan herhangi bir laboratuvar Kullanıcı tarafından gerçekleştirilen.
Bu iletişim kuralı kritik adımlarda yerlerini 7, 10, 11, 12. Bölüm 7 reaktifler hazırlanması ile ilgilidir. Bir laboratuvar bilim adamı veya teknisyen operatöre bağlı değişimi önlemek için odaklanmış dikkat gerektiren reaktifleri multiplex boyama için dikkatli bir hazırlık esastır. Örneğin, multiplex yöntemi ile büyük sorunlardan biriyle reaktifler, özellikle TSA boyalar dilutions dikkatli hazırlanması tarafından azaltılabilir değişkenlik boyama. Bölüm 10 ve 11 resim alma için ilişkilidir. Dozun veya spektral taşma payı, başka bir kanal sinyalini görüntüsü kanal ile engelleyen bir obje neden olabilir görüntüleri, oversaturation önemli bir risktir ( Tamamlayıcı Malzemelerigörmek). Dikkatle pozlama süreleri düzenleyen oversaturation ve spektral bleed engellemeye yardımcı olabilir. Spektral unmixing 12. bölümde yapılır. Bu (Multiplex IHC tahlil geliştirme kılavuzunda, mevcut online açıklandığı) spektral Kütüphane hazırlanması dayanır. Bu adımda, INFORM yazılım "özellikle her TSA boya renkleri tanımak için eğitimli". Spektral Kütüphane insan bademcik gibi bir denetim doku bölümleri kullanılarak oluşturulan, CD20 gibi düzgün ifade bir marker ile lekeli, tek tek slaytları tek tek her TSA boya ile birleştiğinde. Buna ek olarak, autofluorescence slaytlar (Ayrıca Multiplex IHC tahlil geliştirme Kılavuzu'nda tanımlanan) tanımak ve doku autofluorescence çıkarma INFORM yazılım eğitmek için ihtiyaç vardır. Autofluorescence denetim slaytlar (akciğer kanseri, vbgibi) okudu aynı doku örnekleri kullanılarak hazırlanan, MIF Slaytlar olarak aynı şekilde tedavi ve birincil ve ikincil antikorları içeren ancak TSA boya inkübe gerekir. Kollajen, fibrozis, kırmızı kan hücreleri, endojen pigmentler ve diğer kaynaklardan gelebilir gözlemlenebilir autofluorescence gösterimi seçmek için bakım alınması gerekir bu yüzden sadece bir tek autofluorescence spektral profil seçilebilir. Her yeni projenin başında, yeni bir spektral kitaplığı oluşturmayı ve doku çalışma örneklerin temsilcisi olan bir autofluorescence spektrumu kullanılarak, aynı zamanda aynı doku bloklar aynı proje içindeki her toplu iş için pozitif kontrol olarak çalışan, Spektral tutarlılığını artırmak için yardımcı olur değerli metodolojik adımları aynı proje içinde farklı örnekleri arasında unmixing.
Bu protokol için açıklanan multiplex yöntemi bir sinyal gürültü değerlendirici (sayar aracı), açılan denetimleri (Ek malzemeler) ve kalite kontrol boyama bir patoloji görünümünü de dahil olmak üzere çeşitli sorun giderme araçları sunmaktadır. Sayıları araç boyama şiddeti ve arka plan düzeyini değerlendirmek için yardımcı olur. Yoğunluk ve/veya arka plan düzeyleri yüksekse, ilk yaklaşım TSA boya seyreltme azaltmaktır. Sorun devam ederse, o belirli işaret optimizasyonu için kullanılan chromogenic IHC slaytlar arka plan varlığı için arıyorum bir patolog ile gözden geçirilmelidir. Patoloji görünümü floresans TSA bağlantılı fluor üzerinden bir diaminobenzidine gibi yalancı temsil yanı sıra, DAPI dahil olmak üzere tüm floresan sinyallerini, oluşturulan bir faux hematoksilen temsil kullanarak INFORM yazılım tarafından oluşturulan . Patoloji görünümü görüntülerden bir patolog tarafından boyama desenleri görsel değerlendirilmesi ile geliştirilmiş boyama için yardım et. Bu araçlar her zaman boyama iş akışı sırasında en iyileştirme yeni bir panel ve kalite kontrol adımları sırasında istihdam edilmelidir.
Finans Yüksek Lisans yöntemi düzgün doğrulanmış ve iyimserlik için standart chromogenic IHC formalin sabit dokular üzerinde birincil antikorlar kullanımını gerektirir. Örneğin, Finans Yüksek Lisans TSA yöntemi büyük avantajlarından biri doğrulanmış ve anatomik patoloji laboratuvarı klinik kullanım12için optimize edilmiş birincil antikor kullanımı ile uyumluluk olduğunu. Bu avantajı çok katmanlı paneller preconjugated antikorlar, hızlı ve dinamik panel geliştirme için gerek kalmadan belirli kanser İmmünoloji soruları cevaplamak için laboratuvar Kullanıcı tarafından özelleştirilebilir anlamına gelir. Bu bağlamda, doğrulama ve en iyi duruma getirme için en iyi seyreltme seyir ve temiz ve tutarlı sağlayacak koşullar boyama standart chromogenic IHC ile antikorların ile yeni bir panel optimizasyonu için gerçek iş akışı başlar boyama. Sonraki adım IHC için en iyi duruma getirilmiş aynı dilutions kullanarak, TSA fluors yerine diaminobenzidine kullanarak boyama aktarmak için ise monoplex sonuçlarını karşılaştırmak için referans olarak chromogenic IHC ile immünfloresan TSA. Son olarak, antikorlar MIF boyama, her zaman bir denetim başvurusu desen boyama chromogenic IHC MIF TSA boyama parametreleri, esas olarak TSA boya dilutions ve boyama sıralaması ayarlamak için kullanarak kombine edilebilir. Bu işlem sırasında bir patolog ile işbirliği boyama kalitesini değerlendirmek için vesile olduğunu.
Bu teknik sınırlamalar zaman ve çaba en iyi duruma getirme ve doğrulama yeni paneller ve MIF panelleri immunophenotyping çözümlenmesi için gerekli içerir. Asıl sorun, ancak, MIF yöntemlerden uygun doğrulama olduğunu. Bu tekniklerin uygun doğrulama eksikliği kafa karıştırıcı veri böylece kanser İmmünoloji16biyoloji daha iyi anlamak için girişimleri engelleyen edebiyat ekleyebilirsiniz geçersiz sonuçlar oluşturma riski taşımaktadır. Bu nedenle, düzgün yakın katılım ve eğitim ve doğrulama deneyimi ile patologlar tarafından değerlendirilmesi ve değerlendirme doku sağlamak dahil olmak üzere çok katmanlı yöntemleri doğrulamak için her türlü çabayı için Dedektif görevdeki olduğunu histopatoloji ve IHC tabanlı teknikleri17,18,19,20. Burada sunulan protokolü ile H & E slaytlar patoloji değerlendirilmesi önce boyama ve analizi, chromogenic IHC MIF TSA optimize etmek için bir referans olarak kullanmak da dahil olmak üzere yeni bir multiplex panel validation yardımcı olabilecek araçları içerir boyama, yeni bir kalite kontrol için açılan denetim yöntemi multiplex paneli ve izotip, autofluorescence, kullanımı ve denetimleri bırakın. MIF yöntemleri teknik karmaşıklık rağmen spektral unmixing, diğer roman multiplex platformlar yanı sıra ile spektral görüntüleme gibi teknolojileri hastaların doku örneklerin analiz ve yeni formlar oluşturmak için yeni bir dönem açılıyor veri bu standart IHC yalnız mümkün değil. Bu nedenle, MIF tekniklerin geliştirilmesi ve büyümeye, klinik ve immünoterapi için yeni multiparametric akıllı biyolojik tanımlamak için yardım için biyopsi kanser immunoprofiling için güçlü araçlar haline devam edecek, , her şeyden önce kanser hastası yararlanan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu eser MedImmune, küresel destekte R & D kol AstraZeneca tarafından desteklenmiştir. CW, K.R. ve C.C.H. Perkin Elmer, reaktifler (TSA kiti) üretir ve bu çalışmada kullanılan spektral tarayıcılar, çalışanlardır. M.S., cdlerini, A.H., W.Z., C. Bagnall, C. Brown, J.C., al, K.S., Mr ve J.R.C. MedImmune çalışanları ile hisse senedi mülkiyet ve/veya hisse senedi çıkarları ya da AstraZeneca seçenekleri vardır.
Acknowledgments
Editöryel destek MedImmune, Deborah Shuman tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
References
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
