Summary
Denna metod av trypanosome separation från blod beror på deras ytladdning vara mindre negativa än blod däggdjursceller. Infekterat blod placeras och behandlas på en anjonbytaren kolumn. Metoden, den mest passande diagnostik för afrikansk trypanosomiasis, ger renad parasiter för immunologiska, biologiska, biokemiska, läkemedels- och molekylärbiologiska undersökningar.
Abstract
Denna metod kan separation av innebörder, parasiter ansvarar för djurs och människors afrikansk trypanosomiasis (HAT), från infekterat blod. Detta är den bästa metoden för diagnostik av första etappen HAT och dessutom denna parasit reningsmetod tillåter serologiska och forskning utredningar.
HATT är orsakade av tsetseflugan överförs Trypanosoma brucei gambiense och T. b. rhodesiense. Relaterade innebörder är smittämnen djur trypanosomiasis. Trypanosome identifiering är avgörande för HAT diagnos, behandling och uppföljning. Den teknik som beskrivs här är de mest känsliga parasit upptäckt teknik, anpassade till fältförhållanden för diagnos av T. b. gambiense HAT och kan slutföras inom en timme. Blod är skiktad på en anjonbytaren kolumnen (DEAE-cellulosa) tidigare justerat till pH 8 och eluering buffert tillsätts. Mycket negativt laddade blodkroppar är adsorberas på kolumnen medan de mindre negativt laddade innebörder passera. Insamlade innebörder är pelleterat genom centrifugering och observeras av mikroskopi. Parasiter är dessutom beredda utan cellulära skador samtidigt sin smittsamhet.
Renat innebörder krävs för immunologiska tester; de används i trypanolysis-analysen, guldmyntfoten i hatt serologi. Färgade parasiter utnyttjas i det kort agglutinationsprovet (CATT) för fältet serologi. Antigener från renat innebörder, såsom variant yta glykoprotein, exoantigens, används också i olika immunanalyser. Proceduren som beskrivs här är avsedd för afrikanska innebörder; kromatografi villkor måste därför anpassas till varje trypanosome stam, och mer allmänt, till blod av varje art värd däggdjur.
Dessa fascinerande patogener är enkelt renat och tillgänglig för användning i biokemiska, molekylär och cell biologi studier inklusive samtidig kultur med värdceller att undersöka värd-parasit relationer på nivån av membranreceptorer, signalering och gene uttryck; Drug test in vitro; utredning av genen borttagning, mutation eller överuttryck på metaboliska processer, cytoskeletal biogenes och parasit överlevnad.
Introduction
Metoden presenteras beskrivs här tillåter separation av innebörder, parasiter ansvarar för djurs och människors afrikansk trypanosomiasis (HAT), från blodet. Detta är den bästa metoden för diagnostik av första etappen HAT och dessutom denna parasit reningsmetod tillstånd robust serologiska och forskning undersökning.
HATT är orsakade av tsetseflugan överförs Trypanosoma brucei gambiense och T. b. rhodesiense1. Dessa protozo parasiter multiplicera extracellularly i blodet, lymfan och interstitiell vätska under det första skedet av sjukdomen (hemolymphatic skede). Den andra etappen (meningoencephalitic skede) börjar när parasiter passera blod-hjärnbarriären; neurologiska symtom, inklusive en sömnstörning, som gett sitt namn ”sömnsjuka” till denna sjukdom, är typiska för denna andra etappen2. Relaterade innebörder (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei) är smittämnen djur afrikanska trypanosomosis (AAT)3.
World Health organisation (WHO) syftar till att eliminera HAT som ett folkhälsoproblem 2020 och stoppa sändningen av 20304. Den nyligen införandet snabbdiagnos tester har förbättrad serologisk diagnos1,4,5. Flera molekylära diagnostiska tester har utvecklats men deras roll i fältet diagnostik har ännu inte etablerade5. De används för att identifiera underarter av brucei gruppen och atypiska trypanosomiasis orsakas av parasiter som är ansvarig för djurens trypanosomosis6.
Påvisande av parasiten är viktigt för diagnos, behandling och uppföljning, som serologi kan ge falska positiva och tyvärr falska negativa resultat1. Mikroskopiska direkt observation av dessa hemoflagellate protister är svårt i hatt fall som orsakas av T. b. gambiense, (mer än 95% av fallen) som låg parasitemias är regeln, för hatt orsakas av T. b. rhodesiense, en stor antal parasiter är ofta närvarande i blodet. Olika koncentration tekniker har använts, såsom tjock droppe och kapillärrör centrifugering (CTC), men separation av parasiter från blodet genom en kolonn av anjonbytaren (DEAE-cellulosa) följt av centrifugering och mikroskopisk observation av den pellets, är den känsligaste metoden (cirka 50 parasiter/mL blod kan upptäckas)1,7. Följaktligen, rening av innebörder av anjon-värmeväxlare (DEAE-cellulosa) metoden är bäst och hittills, referensmetod för visualisering och isolera parasiter från blod för HAT diagnos. I fältet villkor, en mini kolumn av DEAE-cellulosa har använts framgångsrikt och flera förbättringar har underlättat mikroskopiska observation7,8.
Metoden av trypanosome separation från blod, beskrivs nedan, är beroende av parasiten ytladdning, vilket är mindre negativa än blod däggdjursceller9. Intressant, denna metod utvecklades för 50 år sedan 1968 av Dr Sheila Lanham, och är fortfarande den gyllene standarden för upptäckt och beredning av blodomloppet innebörder. Det är snabbt och reproducerbara för salivarian innebörder från ett brett utbud av däggdjur, tillåter diagnos av både djur och människor trypanosomiasis10.
För att få levande, renat parasiter, läggs infekterat blod på en anjonbytaren kolumnen. Kromatografi förhållanden (främst pH, jonstyrka av buffertar/media) måste anpassas till varje trypanosome art och, mer allmänt, till varje blandning av blod däggdjursceller och innebörder10. Eluering buffert är exakt justerad till pH 8 för de flesta afrikanska innebörder10. Denna metod gynnar koncentrationen av parasiter i blodet hos patienter, eftersom parasitemias kan vara för låga för att upptäckas av mikroskopisk observation ensam, och det gör också laboratorieundersökningar. Arbeta med nymalen isolerade innebörder och på blod från infekterade djur, använder denna teknik, är mer relevant för olika utredningar än studier med parasiter som har varit odlade i axenic förhållanden i laboratoriet på obestämd tid.
Värd-parasit relationer studeras bäst med en parasiten infekterar sin naturliga värd, därför T. musculi, en naturlig murina parasit, som är representativt av extracellulära innebörder, har många fördelar som murina infektion innebär i en litet laboratorium djur och kräver inte biohazard säkerhet nivå (BSL) villkor. T. musculi dödar inte immunkompetenta möss, till skillnad från många andra arter, Trypanosoma , inklusive mänskliga patogener. T. musculi elimineras inte i T-cell-berövade möss och parasitemias kan ökas i infekterade möss genom att ändra mat och näring intag11. Denna parasit modulerar immunsvaret i samtidiga infektioner med andra patogener12. T. musculi från infekterade möss uppvisar skillnader från odlade T. musculi, till exempel uttrycket av membran Fc receptorer är förlorat i T. musculi axenic kulturer, jämfört med parasiter som renats från infekterade möss13 , 14. Excreted-utsöndras faktorer (ESF) är också kvalitativt och kvantitativt mindre uttryckt i axenic trypanosome kulturer och skiljer sig mellan stammar isolerade i endemiska områden15. ESF är de första antigenerna ska visas på värd immunsystemet och så spelar en viktig roll i den första värddatorn immunsvar16.
I experimentellt infekterade djur för laboratorieundersökningar underlättar detta protokoll experimenterande på ett större antal parasiter, minimering av antalet möss krävs särskilt när du använder immunsupprimerade djur. De variant yta glykoproteiner (VSGs) som används i det kortet agglutinationsprovet för Trypanosomiasis (CATT) massa screening fortfarande renas från innebörder som sprids i råttor. De två snabba diagnostiska tester (individuellt förpackade kassetter) som nu finns tillgängliga för användning i fältet fortfarande använder en infektiös modell källa av infödda VSGs och inte i vitro odlade innebörder1,4, 5. befordran i studien av trypanosome immunologi och biologi har underlättats eftersom parasiterna DEAE-cellulosa renat lätt kan erhållas i stora mängder från naturligt eller experimentellt infekterade värdar, och i synnerhet gnagare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Utredningar överensstämde till riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur (NIH publikation nr 85±23, reviderad 1996). Protokoll godkändes av våra lokala etiska kommittén.
1. djur
- Hålla Swiss (OF-1) honmöss i åldern åtta till tio veckor gammal, 20-25 g, i ett djur bostäder anläggning femton dagar före varje experiment. Hus i ventilerade lådor som hålls i en skyddad, rumstemperatur (22 ° C) och luftfuktighet (50%) kontrolleras med 12 timmar på/av ljus cykel.
- Ger djur fri tillgång till mat och vatten. Minimera smärta, lidande och ångest och ge anrikning av miljön.
- För bostäder, använda clear-walled burar, berikning med träpinnar och kartong tunnlar. Försiktigt dra ett djur i en tunnel överföra det från buren till handflatan.
- Utföra daglig övervakning för att bedöma tecken på utmattning, social isolering, kroppen skada, uppburrad hår eller brist på grooming.
- Väga varje djur en gång per vecka. Utför regelbundna inspektioner av en veterinär.
- För naturliga parasiter, samla blod på toppen av parasitemia och parasiter som orsakar djur döden, samla blod dagen innan förmodade död.
Obs: Alla experiment med smittämnen utförs i särskilda rum, enligt universitet godkända riktlinjer.
2. buffertar, media preparat
- Väg ut varje ämne och Tillsätt destillerat vatten för följande buffertar:
- Förbereda koncentrerad fosfatbuffrad koksaltlösning (2 x):
Na2HPO4 (vattenfri) (MW 141.96 g) 10.14 g
NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0,62 g
NaCl (MW 58.44 g) 2,55 g
Destillerat H2O 1 l - Förbereda fosfatbuffrad saltlösning-glukos:
Na2HPO4 (vattenfri) (MW 141.96 g) 5,39 g
NaH2PO4∙2H2O (MW 156.01 g) 0,31 g
NaCl (MW 58.44 g) 1,70 g
Glukos (MW 180 g) 10 g
Destillerat H2O 1 l - Laga 1 M KH2PO4.
- Förbereda eluering buffert: Komplettera fosfatbuffrad saltlösning-glukos med
Penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 µg/mL), och fenolrött (5 µg/mL).
- Förbereda koncentrerad fosfatbuffrad koksaltlösning (2 x):
3. beredning av DEAE-cellulosa
- Planera ca 5 timmar för DEAE-cellulosa beredning.
- Tvätta med destillerat vatten i en mätkolv med en smal hals 100 g av DEAE-cellulosa och tillåta att bosätta sig och sedan kasta fina partiklar. Upprepa tvättar tills supernatanten är klart.
- Lägga till 3 L koncentrerad 2 x Phosphate-Buffered saltlösning och rör om.
- Justera pH till 8.0 med 1 M KH2PO4 och Kassera supernatanten.
- Tvätta två gånger med destillerat vatten och låt sedimentera.
- Tvätta och låt lösningen sedimentera två gånger med 3 liter Phosphate-Buffered Saline-glukos och kassera supernatanterna.
- Mäta volymen av cellulosa och tillsätt en motsvarande volym av Phosphate-Buffered Saline-glukos, fördela i plastflaskor och förvaras vid-20 ° C.
4. parasiter
- Samla trypanosome stammar i områden för människors och djurs trypanosomiasis. Hålla parasiter fryst i flytande kväve.
Observera: Trypanosoma musculi är icke-patogen för människor och en extracellulär trypanosome används för att säkert ersätta patogena innebörder i olika laborationer. - När det gäller laboratorieundersökningar som kräver mänskliga patogener, hantera experiment med omsorg i dedikerad lämpliga biohazard nivå (BSL) säkerhetsvillkor och försiktighetsåtgärder; BSL2 för T. b. gambiense och BSL3 för T. b. rhodesiense. Fältförhållanden, mikrobiologisk praxis är etablerad: säker provtagning, mekaniska pipettering, täta sanering av ytor och sterilisering av avfall.
5. mus infektion
- Snabbt Tina parasiter i vattenbad vid 37 ° C.
- Observera en droppe tinade infekterat blod med ett Mikroskop. Bedöma parasit livskraft genom att mäta andelen rörliga former17.
- Injicera parasiter intraperitonealt i möss (0,5 mL per mus). Varje dag, efter infektion, samla 20 µL av svans blod genom nålen punktering och observera under ett Mikroskop. Utvärdera parasitemia enligt Herbert och Lumsden18 genom att räkna parasiter i flera mikroskopfält eller genom att använda en haemocytometer.
- När parasitemia når ett tröskelvärde som definieras för varje stam, samla blod (1 mL/mus) i eluering bufferten (5 mL/mus) som innehåller heparin (10 U/mL).
Obs: Original och romanen arbete Lanham och Godfrey rapporterade den optimala jonstyrka av fosfat buffrad koksaltlösning glukos för flera host/parasitarter från pH 8,0 stamlösning.
6. parasit separation
Obs: Alla experiment från denna punkt och framåt måste göras i en vävnadskultur huva med handskar. Rumstemperaturen och luftfuktigheten i de laboratorier som används var 22 ° C respektive 45%. I fältet villkor, har parasit separation framgångsrikt utförts vid 34 ° C.
- Placera en 10 mL spruta i ett vertikalt stöd och tillsätt ett tidigare snitt cirkulär, filter papper, glasull eller cellulosa svamp.
- Häll den DEAE-cellulosan i sprutan tills 8 mL nivån är nådd, och tvätta sedan med 25 mL eluering buffert.
- Tillsätt försiktigt 2 mL utspädd blod överst i kolumnen och sedan lägga eluering medium. Regelbundet lägga eluering buffert enligt transitering av innebörder.
- Samla spillvatten droppar från kolumnerna i ett centrifugrör och kontrollera regelbundet för förekomst av parasiter med ett Mikroskop.
- När parasiter upptäcks inte längre i kolumnen utflödet, Centrifugera röret (1.800 x g, 10 minuter, vid 4 ° C i laboratoriet och vid omgivningstemperatur i fältet villkor).
- Avlägsna supernatanten och suspendera parasiter i 1 mL av den relevanta medium som krävs för nästa undersökande steg.
- Räkna parasiter med en hemocytometer och späda ut dem i lämpligt medium om det behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Renat innebörder har använts i farmaceutiska tester. Parasiter överförs till kultur brunnar innehållande seriespädningar av specifika läkemedel, antingen ensamt eller blandat19. Mikroskopiska iakttagelser, utvärdera motilitet är en markör för lönsamhet, kan utföras när bara några dugs testas, medan AlamarBlue cell livskraft-analysen är en utmärkt metod för stora motilitet analyser under drug screening20. Effekten av Pentamidin, en referens-läkemedel som används i hatt terapi, visas i figur 1.
Makrofager är mycket användbara i kulturer som mataren celler. De tillåter, in vitro initiering och utveckling av trypanosome kulturer21. Vi har rapporterat att antalet alternativt aktiverade makrofager är ökat i trypanosome-infekterade däggdjur där de gynnar Parasiten tillväxt22. Denna alternativa makrofag aktivering levererar L-ornitin, vilket är viktigt för parasit tillväxt. In vitro makrofag-parasit samtidig kulturer har visat att innebörder inducerar makrofag alternativa aktiveringen via utsöndrade faktorer. Extracellulära innebörder utsöndrar en kinesin som binder makrofag mannos bindande receptorer inducerande arginas uttryck ge L-ornithine produktion gynnar Parasiten differentiering och multiplikation23,det24 ( Figur 2). Mannos hämmar kinesin bindande och arginas induktion och mannos receptor-brist möss belysa mål för kinesin på makrofager (figur 3).
Eftersom många trypanosome genomen har nu blivit sekvenserade och kommenterad, har vi kunnat dra nytta av dessa stora datamängder. Därefter har vi kunnat utföra framåt och bakåt genetik på dessa parasiter. Med hjälp av dessa data, renas blodet form innebörder har använts för att karakterisera och analysera viktiga strukturer såsom flagellar fickan (FP) och dess associerade cytoskelettet. FP är den enda platsen för endo- och exocytos i innebörder och är också där de variabel yta glykoproteiner smugglas från endomembrane system25. Flagellar pocket kragen (FPC) är en ringformig formad struktur som är kopplad till Flagellen vid punkten där den lämnar FP, men tills nyligen lite var känt om protein beståndsdelarna i FPC. Vi har identifierat ett stort protein med FPC, TbBILBO1, och har visat att det är nödvändigt för parasit överlevnad både i formuläret odlade insekt tsetseflugan och i blodomloppet form26. Nedslagning av TbBILBO1 av RNAi förhindrar FP bildandet och hämmar biogenes av många andra viktiga cytoskeletal strukturer, att FPC och FP viktigt mål för intervention i alla patogena innebörder. Sondera renat eller odlade parasit celler med antikroppar mot TbBILBO1 anger att i blodomloppet och procykliskt (insekt) form, det skapar en ringformad struktur som kringgår Flagellen. Sådan märkning, i blodomloppet formulär, visas i figur 4.
Renade blodet form innebörder har tillåtet karakterisering av många ovanliga biokemiska och metabola egenheter, inklusive metabolismen av glukos, som äger rum i peroxisomal-liknande organeller kallas glycosomes (se figur 5). Det var allmänt accepterat att Pyruvat är stora slutprodukten utsöndras från glukosmetabolism via blodomloppet innebörder, med nästan ingen produktion av Succinat och acetat inuti mitokondrien. Däremot konvertera de procykliska innebörder treonin till acetat och glukos till Succinat och acetat27,28. Energiomsättning av trypanosomatids kan utvärderas genom anpassning till tillgängliga kolkällor. Att kombinera omvänd genetik och metabolomiska analyser bekräftas i mitokondrien producera blodomloppet innebörder av acetat från glukos-derived Pyruvat och treonin, samt produktion av Succinat från glukos19,20 (Figur 5). Exempelvis avslöjade 1H-NMR analys av slutprodukter som utsöndras via blodomloppet form innebörder inkuberas i PBS med 4 mM glukos, att glukos är främst omvandlas till Pyruvat (85,1% av utsöndrade slutprodukterna), med mindre produktion av alaninaminotransferas (9,2%), acetat (4,9%) och Succinat (0,8%)29. Dessa vägar, som är mindre i form av metabolisk flux jämfört med Pyruvat produktion från glukos, är avgörande för tillväxten av parasiten. Produktionskanal för Succinat kan således betraktas som ett bra potentiella mål för utveckling av nya trypanocidal droger.
Figur 1 : In vitro effekt av Pentamidin på T. b. brucei. Utspädningar av Pentamidin lades till 2 x 105 parasiter att avgöra koncentrationen att hämma parasit tillväxt med 50% (IC50). Dos-effektkurvor 24 timmar av kultur. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet från 5 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Trypanosome-medierad arginas induktion. En kinesin släpptes av innebörder binder till C-typen lektin-receptorer leder till arginas induktion. Detta resulterar i ökad produktion av L-ornitin och polyaminer, viktigt för parasit tillväxt och differentiering, och L-arginin utarmning, vilket resulterar i lägre produktion av cytotoxiska nr av makrofag NOS II. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Makrofag arginas aktivitet. Arginas aktivitet i makrofager från kontroll möss och mannos receptor knock-out (KO) möss odlade i vitro i medium för 48 timmar, med eller utan kinesin eller mannos. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet från 5 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : TB BILBO1 märkning av en blodomloppet form Trypanosoma brucei brucei cell (A) immunofluorescens märkning av ett blodomlopp, kultur form, 427 90-13 cell som har blivit utforskad med anti-BILBO1 monoklonal antikropp följt av en FITC-märkt antimus-antikropp och visualiseras med hjälp av ultraviolett ljus, (Tb BILBO1 är de gröna ringformig signalerna) och DNA bindande dye DAPI (blå signaler) (B) A sammanfogning av DAPI, anti-BILBO1 och fas kontrast bilder av A. skala bar motsvarar 10 µm. Anti-BILBO1 mus monoklonal var utspädd 1:10 i PBS och den sekundära antikroppar ( anti-mus IgM FITC) var utspädd 1: 100. Bilder togs på ett mikroskop som är utrustat med en digital kamera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Schematisk representation av glukos och treonin metabolism i blodomloppet form innebörder. Utsöndrade slutprodukter från glukos och treonin metabolism är förpackade. Tjock blå pilarna anger enzymatiska steg av glukosmetabolism leder till Pyruvat produktion, vilket är viktigaste slutprodukten utsöndras från Glykolys. Svarta pilarna representerar förbises mindre metaboliska vägar från glukos och treonin nedbrytning, som är väsentliga för tillväxt av parasiten. Bidraget från de angivna enzymerna har verifierats experimentellt: ACH, acetyl-CoA thioesterase (EG 3.1.2.1); ASCT, acetat: Succinat CoA-transferas (EG 2.8.3.18); AKCT, 2-amino-3-ketobutyrate coenzym A ligase (EG 2.3.1.29); PEPCK, phosphoenolpyruvate carboxykinase (EG 4.1.1.49); PDH, Pyruvat dehydrogenas komplexa (EG 1.2.4.1); TDH, treonin 3-dehydrogenas (EG 1.1.1.103). Förkortningar: AcCoA, acetyl-CoA; AOB, amino oxobutyrate; DHAP, dihydroxyacetone fosfat; G3P, glyceraldehyd 3-fosfat; MAL, malate; OA, oxalacetat; PEP, phosphoenolpyruvate; PYR, Pyruvat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Renat innebörder representerar ett kraftfullt medel för att studera immunologi, biokemi, cell- och molekylärbiologi. Stora vidder av data och resultat har erhållits från innebörder, som har sedan hjälpt till att få information från andra eukaryota celler30. Innebörder är också viktig och intressant forskning, eftersom de har utarbetat ett flertal mekanismer som tillåter dem att överleva och växa i två mycket olika miljöer: tsetseflugan vektorn och däggdjur värd23, 31. olika tekniker för att isolera innebörder har rapporterats, och en översyn på mikrofluidik-baserade metoder har nyligen publicerade32. Därför är ett reproducerbart och robust sätt att parasiten isolering viktigt.
DEAE cellulosa förberedelse är ett nödvändigt steg i denna parasit förberedelse protokoll. Tvätt villkor måste utföras försiktigt för att eliminera de fina partiklarna och temperera kådan, och pH justeras exakt (pH 8,0 är apt för de flesta trypanosome arter). Alla åtgärder måste anpassas för att förbättra parasit rening och ge bibehållen parasit livskraft och cellulära egenskaper. Ännu viktigare, har parasit livskraft och smittsamhet bibehållits efter rening genom en DEAE-cellulosa kolumn. Men vissa stammar är skörare än andra och kan vara mindre smittsam efter rening33. Därmed effekterna av separationsbetingeiserna på pellicular membran komponenter, parasit metabolism, signalering, nukleinsyra funktioner och djur smittsamhet, bedömas och separationsbetingeiserna behöva anpassas.
Begränsningar av denna teknik är att proceduren måste anpassas till varje trypanosome art i en given värd och är också tidskrävande. Dessutom kostar nu DEAE-cellulosa. Preliminära analyser är nödvändiga för att optimera separationsbetingeiserna, särskilt media, som kan ha varierande Joniska styrkor och en exakt pH. Före kolumnen åtgärder, inklusive blodförtunnande val, tidigare centrifugering ta bort majoriteten av erytrocyter, lättcellsskikt användning och erytrocyt Lys, väljs enligt varje experiment. Exakta ändringar på en enda parameter (buffertar, temperatur i hela protokollet, centrifugering parametrar) skulle kraftigt öka antalet, graden av rening och lönsamhet av parasiter erhållits33. Utveckla nya separation parametrar enligt parasitarter och de däggdjur blodkropparna separeras, kan vara nödvändigt. Justeringar av inledande Lanham och Godfreys protokoll har tillåtit rening av biologiskt och antigena bevarade T. cruzi från blod34. Nya hartser kan också testas och används med lämpliga villkor för olika arter35.
Större roll utsöndras/utsöndras faktorer (ES) av trypanosomatids har nyligen varit betonad16. ES innehåller molekyler som är inblandade i patologi och immunmodulering, såsom kinesin, som är bevarad bland innebörder24. ES förberedelse från renat parasiter kräver särskild omsorg för att undvika kontaminering genom eluering mediekomponenter och lyserat parasiter.
Ett vaccin som är effektivt mot Leishmania, relaterade parasit, ES-baserade redan finns och är tillgänglig (CaniLeish Virbac)36. Sammanslutning av bevarade molekyler spelar viktiga roller i parasit överlevnad och tillväxt kan utgöra grunden för ett framtida vaccin mot innebörder, för både människor och djur, i en one health-strategi. Rening av afrikanska innebörder från blod av DEAE-cellulosa kolonner, med förbättringar, fortfarande den gyllene standarden för trypanosome upptäckt i naturliga värdar med låg parasitemias i endemiska områden och behovet av parasiter i stort antal för experimentella undersökningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar alla medlemmar i UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Denna forskning stöddes av intern finansiering från universitetet i Bordeaux och stöd från ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, och föreningen pour le développement de la recherche sv Parasitologien et médecine tropicale och den Service de coopération et d'action culturelle de l'Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
References
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G.
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R.
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).
- Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).
- Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis? Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).
- Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).
- Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).
- Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).
- Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).
- Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).
- Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).
- Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).
- Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).
- Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).
- Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).
- Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages? Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
- Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).
- Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host's parasitemia. Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).
- Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).
- Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).
- Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).
- Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).
- De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).
- Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).
- Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).
- Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).
- Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).
- Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).
- Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).
- Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).
- Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).
- Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6 (4), (2017).
- Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).
- Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).
- Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
- Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).
