Summary
Nous présentons ici un protocole pour co-immunoprécipitation et un dosage de l’activité enzymatique sur-perle d’étudier simultanément la contribution de domaines de protéines spécifiques des récepteurs de la membrane plasmique à la fois de recrutement d’enzyme et de l’activité enzymatique.
Abstract
Associés aux récepteurs enzymes sont les principaux médiateurs d’activation cellulaire. Ces enzymes sont réglementés, au moins en partie, par des interactions physiques avec des queues cytoplasmique des récepteurs. Souvent, les interactions sont dus à des domaines spécifiques de la protéine et aboutir à l’activation des enzymes. Il existe plusieurs méthodes pour étudier les interactions entre protéines. Tandis que co-immunoprécipitation est couramment utilisée pour étudier des domaines qui sont requises pour les interactions protéine-protéine, il ne sont a aucun tests que la contribution de domaines spécifiques à l’activité des enzymes recrutés en même temps le document. Par conséquent, la méthode décrite ici combine co-immunoprécipitation et un dosage de l’activité enzymatique sur la perle pour l’évaluation simultanée des interactions entre les protéines et l’activation enzymatique associée. Ce protocole vise à identifier les domaines qui sont essentiels pour les interactions physiques entre une protéine et enzymatiques et les domaines qui sont obligatoires pour l’activation complète de l’enzyme. On démontre l’importance de ce test, comme certains récepteurs domaines protéiques contribuent à la liaison de l’enzyme de la queue cytoplasmique du récepteur, tandis que d’autres domaines sont nécessaires pour réguler les fonctions de la même enzyme.
Introduction
Récepteurs catalytiques et récepteurs tyrosine kinases sont des protéines transmembranaires dont liaison d’un ligand extracellulaire provoque l’activité enzymatique du côté intracellulaire1. Certains récepteurs possèdent les récepteurs et les fonctions enzymatiques, tandis que d’autres recrutent des enzymes spécifiques tels que les kinases et phosphatases à leur queue cytoplasmique. Recrutement d’une enzyme à queue du récepteur et de l’action subséquente catalytique de l’enzyme sont deux processus distincts qui ne sont pas toujours régis par la même protéine domaines2. Malheureusement, il n’y a pas d’outils spécifiques pour évaluer l’interaction et l’activité enzymatique en même temps. L’essai de co-immunoprécipitation fonctionnelle décrite ici est une méthode utile pour disséquer le recrutement d’une enzyme de la queue d’un récepteur de son activation. Ce test utilise immunoprécipitation des récepteurs marqués par perles recouverts d’anticorps. Par la suite, une analyse d’activité enzymatique et analyse par western blot sur perles sont effectuées. L’objectif général de cette méthode consiste à découvrir quels domaines protéiques sont nécessaires pour les interactions entre les récepteurs et les enzymes (évaluées par analyse par western blot) et quels domaines sont obligatoires pour l’activation complète des enzymes (mesurée par sur-perle dosage de l’activité enzymatique). Il est important de développer des outils pour étudier les fonctions distinctes des enzymes associées aux récepteurs en raison de leur implication dans la pathogenèse des maladies humaines. Par ailleurs, mieux comprendre les mécanismes d’action de ces protéines peut aider à la conception de nouvelles interventions thérapeutiques.
1 mort programmée (PD-1) est un récepteur inhibiteur sur la surface des cellules T et est nécessaire pour limiter les lymphocytes T excessive. Ces dernières années, les anticorps anti-PD-1 ont été impliqués dans le traitement de multiples affections malignes1,2. PD-1 ligature retient de nombreuses fonctions des lymphocytes T, y compris la prolifération, adhérence et la sécrétion de plusieurs cytokines3,4,5. PD-1 est localisée à la synapse immunologique, l’interface entre les lymphocytes T et les présentatrices d’antigène des cellules6, où il approche avec les récepteurs des lymphocytes T (TCR)7. Par la suite, la tyrosine-phosphatase SHP2 [homologie Src 2 (SH2) domaine contenant tyrosine-phosphatase 2] est recruté à la queue cytoplasmique de PD-1, conduisant à la déphosphorylation des résidus tyrosine clé au sein du complex TCR et ses associés proximales signalisation des molécules3,4,5,8,9. La queue cytoplasmique de PD-1 contient deux motifs de tyrosine, un motif inhibiteur d’immunoreceptor tyrosine-basé (ITIM) et un immunoreceptor tyrosine motif basé-commutateur (ITSM)10. Les deux motifs sont phosphorylées après ligature de PD-19,10. Études de mutagenèse ont révélé un rôle primordial pour la GSTI SHP2 recrutement, par opposition à l’ITIM, dont le rôle dans la signalisation PD-1 et la fonction n’est pas clair4.
Shp2 adopte soit une fermée (plié), inhibe la conformation ou un ouvert (étendu), conformation active11. La contribution de chaque domaine de queue de PD-1 à SHP2 liaison ou l’activation n’a pas encore été élucidée. Pour répondre à cette question, nous avons développé un test qui permet l’essai parallèle du recrutement de SHP2 à la queue de PD-1 et son activité12. Nous avons utilisé co-immunoprécipitation et un dosage de l’activité de sur-bead phosphatase pour tester l’interaction et l’activité enzymatique en parallèle. À l’aide de ce test, nous montrons que l’ITSM de PD-1 est suffisant pour recruter SHP2 à la queue de PD-1, tandis que l’ITIM de PD-1 est nécessaire pour pleinement s’étendent et activer l’enzyme.
Il n’y a de nombreux récepteurs disposant de plusieurs domaines adjacents dans leurs queues cytoplasmique. Le test fonctionnel co-immunoprécipitation peut découvrir le rôle des domaines spécifiques qui sont nécessaires pour le recrutement de protéines ou activation enzymatique.
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Protocol
1. la transfection de cellules
- Les semences des cellules HEK 293 t en douze plaques de 10 cm (5 x 106 cellules / plaque) la veille de la transfection (Figure 1). Effectuer le comptage des cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Pour chaque plaque, utiliser 10 mL de DMEM additionné de 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine. Incuber les cellules à 37 ° C à 5 % de CO2.
- Une fois que les cellules sont 80 à 90 % anastomosé, transfecter 5 plaques HEK 293 t en utilisant un réactif à base de lipides transfection avec un des plasmides suivants : un vecteur exprimant le SHP2, un vecteur de PD-1-GFP-exprimer [une version de type sauvage (WT) de PD-1], une version ITIM muté (Y223F ) d’un vecteur exprimant PD-1-GFP et une version d’ITSM muté (Y248F) d’un vecteur exprimant PD-1-GFP (Figure 1).
Remarque : Deux plaques vont être transfectées avec le vecteur WT PD-1-GFP-exprimer. Une plaque supplémentaire servira à un contrôle de cellules non transfectées (Figure 1). - Effectuer la transfection conformément au protocole du fabricant pour les cellules adhérentes en plaques de 10 cm.
Remarque : Dans les versions mutantes de PD-1, la tyrosine (Y) dans chaque motif a été remplacée par la phénylalanine (F) qui ne peuvent pas être phosphorylée. - Transfecter une deuxième série identique de cinq plaques et une plaque supplémentaire, agissant comme un contrôle non transfectées pour la mesure de la quantité de la protéine exprimée [entrée ; également connu sous le nom lysats de cellules entières (CMT)] avant l’immunoprécipitation (Figure 1).
- Incuber les cellules transfectées de 48 h à 37 ° C, 5 % de CO2 dans un incubateur de culture de tissus.
Remarque : Pour vous assurer que la transfection a eu lieu avec succès, examiner les cellules pour l’expression de la GFP à l’aide d’un microscope à fluorescence.
2. promouvoir la Phosphorylation dans les cellules transfectées
- Après incubation, préparer pervanadate frais en mélangeant 50 µL d’orthovanadate de sodium (à partir de stock de 100 mM) avec 50 µL de 30 % H2O2.
Remarque : Le mélange devrait se transformer en une couleur jaunâtre. Pervanadate est un inhibiteur de la phosphatase perméable à la cellule qui favorise la phosphorylation de tyrosine résidus13. Dans ce test, il est utilisé pour robustement induit la phosphorylation de la queue de PD-1. - Pour phosphoryler les versions étiquetées de PD-1, enlevez le média les cellules transfectées de PD-1-GFP et ajouter 10 mL de plaine DMEM (sans sérum ou antibiotiques) ainsi que de 10 µL de pervanadate (étape 2.1) sur chaque plaque de 10 cm (soit huit plaques exprimant différentes versions de PD-1) (Figure 1). Placer les plaques dans l’obscurité pendant 15 min à température ambiante.
Remarque : Les cellules de SHP2 transfectées (deux planches ; La figure 1) et les deux plaques de contrôle non transfectées ne sont pas traités avec pervanadate, puisque ces plaques serviront comme source pour l’enzyme active de SHP2. - Laver les cellules avec 5 mL de PBS glacée 1 x. Répéter cette étape deux fois.
3. immunoprécipitation
Remarque : La procédure suivante doit être effectuée sur la glace ou à 4 ° C.
- Supplément du tampon de lyse (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 250 mM NaCl, 0,1 % NP-40, 2 mM EDTA, 10 % de glycérol) avec les inhibiteurs de la protéase (dissoudre 1 comprimé dans 10 mL de tampon de lyse) et orthovanadate de sodium 1 mM. Ajouter 500 µL de tampon de lyse glacée aux cellules et retirer et récupérer les cellules des plaques immédiatement à l’aide d’un grattoir de cellules.
Remarque : Il est important d’ajouter l’orthovanadate de sodium uniquement pour le tampon de lyse qui sera utilisé pour les plaques PD-1-GFP-transfectées, puisque les plaques SHP2 transfectées et non transfectées contrôle doit conserver l’activité phosphatase. - Les lysats de transfert dans des tubes à froid 1,5 mL et tournez-les à 0,005 x g, 4 ° C pendant 30 min.
- Pour collecter les noyaux post surnageantes (PNS) les lysats, tournez en bas les lysats pendant 10 min à 10 000 x g à 4 ° C et transvaser le surnageant dans tubes neufs. Jeter le culot. Stocker les surnageants de la deuxième série de six planches (Figure 1) sur la glace pour une analyse ultérieure de CMT.
-
Préparation des billes anti-GFP pour l’immunoprécipitation de PD-1-GFP des PD-1-GFP-lysats de la première valeur (quatre plaques) (Figure 1).
- Pour empêcher la sédimentation des perles, agiter doucement le flacon avec les perles avant ouverture. Retirez 40 µL de perles anti-GFP de la boue par chaque État.
- Essorage à 500 x g pendant 3 min à 4 ° C et retirer le surnageant pour laver les perles.
Remarque : Il est important de réduire au minimum le contact entre les embouts en plastique et perles d’agarose pour empêcher la perte. Il est recommandé de couper le bord d’une pointe µL 200 avant de transférer les perles dans un autre tube. - Remettre en suspension les perles dans 80 µL de tampon de lyse (par exemple).
- Ajouter les perles lavés directement dans le lysat cellulaire (PNS) des cellules de la première série (quatre plaques) PD-1-GFP-exprimer (étape 3.3). Tourner à 0,005 x g pendant 30 min à 4 ° C aux protéines de l’immunoprécipitation de la GFP-étiquetée.
- Laver les billes avec 1 mL de tampon de lyse froid (sans orthovanadate) 3 fois. Centrifuger le tube à 2 500 g pendant 10 s.
Remarque : Lorsque vous ajoutez le tampon de lyse aux talons, ajoutez-le directement sur les perles sans les toucher avec les pointes. Il n’y a aucun besoin de pipette de haut en bas pendant les lavages. - Tout aussi diviser le lysat de la SHP2 active de la première série (une plaque ; étape 3.3) et ajoutez-le à trois tubes de lavé perles PD-1-GFP-contenant (le WT PD-1-GFP et les deux phosphdeficient différentes mutations, Y223F et Y248F). Ajouter un tiers du volume depuis le lysat des cellules non transfectées dans le deuxième tube de perles WT PD-1-GFP. Jeter les deux tiers restants.
- Incuber les perles pendant 4 h à 4 ° C, avec une légère rotation (0,005 x g).
- Laver les perles deux fois avec 1 mL de tampon de lyse froid (sans pervanadate ni orthovanadate), comme indiqué à l’étape 3.6.
- Ajouter 80 µL de tampon de lyse (sans pervanadate ni orthovanadate) par exemple veiller à ce que le volume total dans chaque tube est de 100 µL (20 µL de perles) et 80 µL de tampon de lyse. Mélanger doucement et transférer 50 µL de chaque éprouvette dans deux tubes de frais 1,5 mL.
NOTE : Après cette étape, il y aura deux tubes remplis d’un mélange qui contient des perles et tampon de lyse : un tube sera utilisé pour tester la SHP2 co-immunoprécipitée western blot, et le second sera utilisé pour le dosage de l’activité phosphatase.
4. analyse d’activité de la phosphatase
- Laver les billes une fois avec le tampon de lavage phosphatase (Hepes de 30 mM à pH 7.4 et 120 mM NaCl). Retirez complètement le surnageant.
- Ajouter 100 µL de tampon (Hepes de 30 mM à pH 7,4, 120 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 mM p-nitrophénylphosphate) aux talons et incuber à 30 ° C pendant 30 min sous agitation modérée. NOTE : Temps d’Incubation peuvent varient, mais attendez que le tampon se colore en jaune sur la déphosphorylation.
- Pour terminer la réaction, ajouter 50 µL de 1 NaOH M lorsque la mémoire tampon se colore en jaune.
- Tournez en bas à 2 500 g pendant 10 s et le transfert de 50 µL de surnageant dans deux puits (doublons avec 50 µL / puits) de demi-zone dans une plaque à 96 puits. Lire l’absorbance à 405 nm.
- Exprimer les résultats sous forme de relative densité optique (do) sur la version sauvage de contrôle de PD-1-GFP.
5. SHP2 Analyse par Western Blot
- Tournez en bas les perles et éliminer le surnageant.
- Ajouter 20 µL de tampon de x Laemmli 2 (voir la Table des matières) pour les perles et les faire bouillir à 95 ° C pendant 5 min.
- Mesurer la concentration de la protéine de la saisie des REGLAGES (deuxième) à l’aide d’une ACA nécessaire (voir la Table des matières). Transférer 30 µL de l’échantillon plus dilué dans un nouveau tube. Diluer le reste des contrôles d’entrée avec tampon de lyse à la même concentration que l’échantillon plus dilué et transférer 30 µL de chacune d’elles dans un nouveau tube.
NOTE : Après cette étape, il y aura 4 tubes avec 30 µL de chacune, à des concentrations de protéines similaires, ce qui représente l’entrée contrôle lysats. - Ajouter des volumes égaux de 2 x Laemmli tampon aux lysats et faire bouillir à 95 ° C pendant 5 min. Spin bas les perles et le surnageant sur 4 – 20 % gel SDS-PAGE Tris-base de charge (voir la Table des matières) pour western blot analyse. En outre, charger 50 µL de chaque échantillon de la deuxième série.
- Continuer l’analyse par western blot selon le protocole décrit précédemment12.
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Representative Results
Alors que la contribution de l’ITSM de PD-1 à SHP2 liaison est établie, le rôle de l’ITIM de PD-1 est moins clair. Parce que SHP2 a deux domaines SH2 qui peuvent se lier à deux phosphotyrosines séquentiels sur PD-1 (une tyrosine dans l’ITSM) et l’autre à l’ITIM, nous avons émis l’hypothèse que l’ITSM de PD-1 ancre SHP2 PD-1, tandis que l’ITIM de PD-1 facilite l’activité SHP2 en stabilisant sa Ouvrez l’état conformationnel11,14. Pour le vérifier, nous avons développé un combiné co-immunoprécipitation et analyse de l’activité enzymatique pour l’évaluation parallèle des interactions de récepteur-enzyme et d’activation. Wild type GFP-PD-1, GFP-PD-1 Y223F (mutant ITIM) ou GFP-PD-1 Y248F (mutant ITSM) ont été exprimés dans les cellules HEK 293 t ont été traités par la suite avec pervanadate (Figure 1), menant à la queue de PD-1 phosphorylée. PD-1 protéines ont été recueillies à l’aide de perles anti-GFP enduit. Ces perles ont été utilisés pour SHP2 co-immunoprécipitation des lysats de cellules surexprimant la protéine SHP2. Les niveaux de SHP2 lié à chaque version de PD-1 et son activité enzymatique ont été enregistrés.
Sans surprise, SHP2 n’a pas pu lier à PD-1 lorsque l’ITSM a été muté (Y248F ; Figure 2 a). Remarquablement, la version mutante de l’ITIM (Y223F) inhibe la liaison SHP2 que dans une mesure limitée (Figure 2 b). Néanmoins, l’analyse d’activité de la phosphatase SHP2 révèle que l’ITIM et ITSM sont tout aussi indispensables à l’activité enzymatique (Figure 2). Puisque immunoprécipités PD-1 peuvent contenir d’autres phosphatases, en plus de SHP2, nous avons utilisé une condition de contrôle (Figure 2 b et 2C, bleu) dans lequel SHP2 n’était pas surexprimés.
Par conséquent, un modèle d’activation en deux étapes est révélé dans lequel SHP2 est pliée en une conformation auto inhibées sous conditions (Figure 2D, gauche) de repos. Lors de l’activation de PD-1, SHP2 est recruté à l’ITSM phosphorylée (Figure 2D, milieu). Toutefois, l’ITIM doit également être phosphorylée dépliage SHP2 dans sa conformation active (Figure 2D, droit).
Figure 1 : des conditions expérimentales et la stratégie. GFP-PD-1 WT (type sauvage), GFP-PD-1 Y223F (mutant ITIM) ou GFP-PD-1 Y248F (mutant ITSM) ont été exprimés dans les cellules HEK 293 t ont été traités par la suite avec pervanadate. Protéines phosphorylées de GFP-PD-1 recueillies par immunoprécipitation de la GFP ont été mélangés avec des lysats de cellules surexprimant la protéine SHP2, et les niveaux et l’activité de SHP2 lié à chaque version de PD-1 ont été enregistrées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : The ITIM de PD-1 est nécessaire pour l’activité de SHP2. Des cellules HEK 293 t ont été transfectées avec les versions indiquées de GFP-PD-1, suivi par un traitement pervanadate et immunoprécipitation utilisant anti-GFP mAb-agarose (un). Niveaux de Shp2 lié au précipité GFP-PD-1 ont été quantifiés (b) et soumis à une analyse d’activité de la phosphatase (c). Valeurs de SHP2 tiré vers le bas ont été normalisées à des niveaux d’expression de GFP. Toutes les valeurs sont pli-changement par rapport à l’intensité de SHP2 précipité par la GFP WT-PD-1 (type sauvage). Les valeurs de l’activité phosphatasique sont pli-variation par rapport à l’activité de co-immunoprécipitée SHP2 par la GFP WT-PD-1. RU = unités relatives. (d) le modèle d’activation en deux étapes. Tout d’abord, SHP2 est recruté à la GSTI, et alors seulement le deuxième domaine SH2 lie à l’ITIM de PD-1, qui s’étend le domaine catalytique de SHP2 à la conformation pleinement active. Les données sont présentées comme moyenne ± SEM. astérisques représentent des différences significatives entre le groupe noté et le PD-1 WT (b et c) : **p < 0,01, ***p < 0,001, t célibataires-essai, n = 3. Autorisation d’utiliser les données de Peled et al. (2018) 12 a obtenu. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Des interactions de récepteur-enzyme sont cruciales pour la signalisation intracellulaire. De nombreuses enzymes sont recrutés aux récepteurs à travers les domaines SH2 liant à des tyrosines phosphorylés qui décorent les queues des mêmes récepteurs. Cependant, enzymes sont souvent pliés en conformations inactives fermées, et l’activation requiert un changement conformationnel de11 qui peut être médiée par les autres domaines d’un même récepteur. Le test décrit ici mesures les interactions entre les enzymes et récepteurs ainsi que l’activité induites par ces interactions.
Nous avons utilisé un dosage colorimétrique qui utilise p-nitrophénylphosphate (pNPP) comme substrat pour SHP2. pNPP est un donneur de substrat et phosphore non sélectif qui est libéré par un grand nombre d’enzymes15. Les peptides recombinants phosphorylés peuvent servir de substrats alternatifs (e.g., semblables à celles utilisées dans l’essai de vert de malachite). Ces peptides sont plus spécifiques en ce qui concerne l’activité de la phosphatase ; Toutefois, il est plus coûteux, et en raison de sa sensibilité, il ne peut être effectuée dans des solutions sans phosphate. Une autre approche pour contourner l’absence de spécificité envers pNPP doit inclure une lignée de cellules de contrôle dans lequel la phosphatase en question est assommée. Dans ces cellules, la surexpression de la protéine SHP2 sera la seule source pour l’enzyme, et toute augmentation de l’activité phosphatasique devrait être attribuée spécifiquement à la phosphatase surexprimée. Une troisième approche consiste à utiliser une protéine purifiée du SHP2 d’épitope-tag et purifiée épitope-tag PD-1 au lieu de CMT complétée par phosphopeptides comme substrat. Plutôt que d’utiliser un phosphopeptide comme le substrat est d’utiliser une phosphoprotéine au lieu de cela, et puis la déphosphorylation de la protéine peut être détectée par un anticorps phospho-spécifiques ou phos-tag SDS-PAGE.
Ce qui est important, la méthode décrite ici peut faire la lumière sur la biologie des autres interactions de récepteur-enzyme. Par exemple, il peut découvrir la fonction des résidus de tyrosine dans les récepteurs familles SLAM, qui ont été jugés négligeables pour les interactions avec SHP216 , mais peuvent en fait être nécessaire pour l’activation de l’enzyme même. Cette méthode peut également être appliquée aux autres phosphatases, mais aussi les kinases interagissant avec les récepteurs.
Bien que cette méthode est relativement simple, il est important de noter quand il faut éviter les inhibiteurs de la phosphatase. Ceux-ci sont nécessaires à l’étape initiale de l’induction de la phosphorylation de PD-1, mais plus tard, ils doivent être enlevés afin de tester l’activité de la phosphatase de SHP2.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet a été financé par le NIH subventions 1R01AI125640-01 et la rhumatologie Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
References
- Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
- Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
- Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
- Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
- Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
- Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
- Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
- Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
- Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
- McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 18, Unit18 18 (2010).
- Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).
