Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la co-immunoprecipitazione e un saggio di attività enzimatica sul tallone per studiare simultaneamente il contributo di domini proteici specifici dei recettori di membrana plasmatica sia reclutamento degli enzimi e l'attività dell'enzima.
Abstract
Associata al recettore gli enzimi sono i principali mediatori di attivazione cellulare. Questi enzimi sono regolati, almeno in parte, da interazioni fisiche con le code citoplasmatiche dei recettori. Le interazioni si verificano attraverso domini proteici specifici spesso e provocare l'attivazione degli enzimi. Ci sono diversi metodi per studiare le interazioni tra proteine. Mentre co-immunoprecipitazione è comunemente utilizzato per lo studio di domini che sono necessari per le interazioni proteina-proteina, non ci sono nessun test che documentano il contributo di domini specifici all'attività degli enzimi reclutati allo stesso tempo. Di conseguenza, il metodo qui descritto combina co-immunoprecipitazione e un saggio di attività enzimatica sul tallone per valutazione simultanea delle interazioni tra proteine e attivazione enzimatica. L'obiettivo del presente protocollo è quello di identificare i domini che sono critici per interazioni fisiche tra una proteina ed enzima e i domini che sono obbligatori per completare l'attivazione dell'enzima. L'importanza di questo test è dimostrata, come determinato ricevitore domini proteici contribuiscono all'associazione dell'enzima per la coda citoplasmatica del recettore, mentre altri domini sono necessari per regolare la funzione dell'enzima stesso.
Introduction
Recettori catalitici e recettori tirosin chinasici sono proteine transmembrana, in cui il legame di un ligando extracellulare causa attività enzimatica sul lato intracellulare1. Alcuni recettori possiedono recettori sia funzioni enzimatiche, mentre gli altri recluta enzimi specifici come chinasi e fosfatasi a loro code citoplasmatiche. Assunzione di un enzima alla coda del recettore e la conseguente azione catalitica di questo enzima sono due processi separati che non sono sempre disciplinati dalla stessa proteina domini2. Purtroppo, non ci sono nessun strumenti specifici per valutare l'interazione e l'attività enzimatica simultaneamente. L'analisi di co-immunoprecipitazione funzionale descritto qui è un metodo utile per sezionare il reclutamento di un enzima per la coda di un recettore dalla sua attivazione. Questo test utilizza immunoprecipitazione dei recettori contrassegnati da perline rivestite con anticorpo. Successivamente, vengono eseguite un'analisi di attività enzimatica e l'analisi western blot su perline. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di scoprire quali domini di proteine sono necessari per le interazioni tra recettori e gli enzimi (valutati mediante analisi western blot) e quali domini sono obbligatori per completare l'attivazione degli enzimi (misurato con il tallone analisi di attività enzimatica). È significativo a sviluppare strumenti per studiare le funzioni separate di enzimi associata al recettore a causa del loro coinvolgimento nella patogenesi delle malattie umane. Inoltre, l'ulteriore comprensione dei meccanismi di azione di queste proteine può aiutare la progettazione di nuovi interventi terapeutici.
Morte programmata-1 (PD-1) è un recettore inibitorio sulla superficie delle cellule T ed è necessaria per limitare le risposte delle cellule T eccessivo. Negli ultimi anni, gli anticorpi anti-PD-1 sono stati implicati nel trattamento di tumori maligni multipli1,2. PD-1 legatura trattiene numerose funzioni a cellula T, tra cui la proliferazione, l'adesione e la secrezione di più citochine3,4,5. PD-1 è localizzato alla sinapsi immunologica, l'interfaccia tra le cellule T e cellule presentanti l'antigene6, dove esso colocalizza con il recettore delle cellule T (TCR)7. Successivamente, la tirosina fosfatasi SHP2 [Src homology 2 (SH2) dominio contenente tirosina fosfatasi 2] viene reclutato per la coda citoplasmatica di PD-1, che conduce alla defosforilazione di residui di tirosina chiave all'interno del complesso TCR e suoi associati prossimale segnalazione molecole3,4,5,8,9. La coda citoplasmatica di PD-1 contiene due motivi di tirosina, un immunorecettore basati su tirosina inibitori motivo (ITIM) e un immunorecettore tirosina motivo basato-interruttore (ITSM)10. Entrambi motivi vengono fosforilate su PD-1 legatura9,10. Studi di mutagenesi hanno rivelato un ruolo primario per l'ITSM SHP2 reclutamento, in contrasto con il ITIM, il cui ruolo nella segnalazione di PD-1 e la funzione non è chiaro4.
SHP2 adotta sia un chiuso (piegato), ha inibito la conformazione o un open (esteso), conformazione attiva11. Il contributo di ciascun dominio di coda di PD-1 SHP2 associazione o l'attivazione non è stata ancora chiarito. Per rispondere a questa domanda, abbiamo sviluppato un test che consente il test parallelo del reclutamento di SHP2 alla coda del PD-1 e sua attività12. Abbiamo impiegato co-immunoprecipitazione e un'analisi di attività della fosfatasi sul tallone per testare l'interazione e l'attività enzimatica in parallelo. Usando questa analisi, indichiamo che l'ITSM di PD-1 è sufficiente per reclutare SHP2 alla coda del PD-1, mentre il ITIM di PD-1 è necessario per estendere completamente e attivare l'enzima.
Ci sono molti recettori che hanno diversi domini adiacenti in loro code citoplasmatiche. Il test funzionale di co-immunoprecipitazione può scoprire il ruolo di specifici domini che sono necessari per l'attivazione enzimatica o di assunzione di proteine.
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Protocol
1. transfezione delle celle
- Le cellule HEK 293T del seme in dodici piatti da 10 cm (5 x 106 cellule per piastra) il giorno prima di transfezione (Figura 1). Eseguire il conteggio delle cellule usando un emocitometro. Per ogni piastra, utilizzare 10 mL di DMEM completati con 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO2.
- Una volta che le cellule sono 80-90% confluenti, transfect 5 piastre HEK 293T utilizzando un reagente di transfezione basata sui lipidi con uno dei seguenti plasmidi: un vettore che esprime SHP2, un vettore di PD-1-GFP-esprimendo [una versione di wild type (WT) di PD-1], una versione ITIM-mutato (Y223F ) di un vettore PD-1-GFP-espressione e una versione di ITSM-mutato (Y248F) di un vettore PD-1--espressione della GFP (Figura 1).
Nota: Due piastre saranno trasfettate con il vettore WT PD-1--espressione della GFP. Una piastra supplementare servirà come un controllo di cellule non trasfettate (Figura 1). - Eseguire la transfezione secondo il protocollo del produttore per le celle aderenti nelle piastre di 10 cm.
Nota: Nelle versioni mutate di PD-1, la tirosina (Y) in ogni motivo è stata sostituita da fenilalanina (F) che non può essere fosforilata. - Transfect una seconda serie identica di cinque piastre e una piastra supplementare che serve come controllo non trasfettate per la misurazione della quantità di proteina espressa [ingresso; anche conosciuto come lisato cellulare intero (WCL)] prima di immunoprecipitazione (Figura 1).
- Incubare le cellule trasfettate per 48 h a 37 ° C, 5% CO2 in un incubatore di coltura del tessuto.
Nota: Per garantire che la transfezione con successo si è verificato, esaminare le cellule per espressione di GFP utilizzando un microscopio a fluorescenza.
2. promuovere la fosforilazione in cellule trasfettate
- A seguito di incubazione, preparare fresco pervanadate mescolando 50 µ l di sodio-orthovanadate (da stock di 100 mM) con 50 µ l di 30% H2O2.
Nota: La miscela dovrebbe cambiare in un colore giallastro. Pervanadate è un inibitore della fosfatasi cellula-permeabile che promuove la fosforilazione della tirosina residui13. In questa analisi, serve per robustamente indurre fosforilazione delle code di PD-1. - Per fosforilare le versioni con tag di PD-1, rimuovere il supporto dalle cellule trasfettate PD-1-GFP e aggiungere 10 mL di pianura DMEM (senza siero o antibiotici) insieme a 10 µ l di pervanadate (punto 2.1) per ogni piatto di 10 cm (con conseguente otto piastre esprimendo diverse versioni di PD-1) (Figura 1). Posizionare le piastre a temperatura ambiente al buio per 15 min.
Nota: Cellule trasfettate con SHP2 (due piastre; Figura 1) e le due piastre di controllo non-transfettate non sono trattate con pervanadate, poiché queste piastre servirà come fonte per l'enzima SHP2 attivo. - Lavare le cellule con 5 mL di PBS 1X ghiacciata. Ripetere questo passaggio due volte.
3. immunoprecipitazione
Nota: La procedura seguente deve essere eseguita su ghiaccio o a 4 ° C.
- Il buffer di lisi (50 mM Tris-HCl a pH 7,2, 250 mM NaCl, 0,1% NP-40, 2mm EDTA, 10% glicerolo) con inibitori delle proteasi (sciogliere 1 compressa in 10 mL di tampone di lisi) e con 1 mM sodio ortovanadato di supplemento. Aggiungere 500 µ l di tampone di lisi ghiacciata alle cellule e rimuovere e raccogliere le cellule dalle piastre immediatamente utilizzando un raschietto di cella.
Nota: È importante aggiungere il sodio ortovanadato solo per il buffer di lisi che verrà utilizzato per le piastre PD-1-GFP-transfected, poiché il SHP2-transfettate piastre e placche di comando non trasfettate devono conservare l'attività della fosfatasi. - Trasferire i lisati in provette da 1,5 mL freddo e ruotarle a 0,005 x g, 4 ° C per 30 min.
- Per raccogliere i nuclei post surnatante (PNS) dai lisati, rotazione verso il basso i lisati per 10 min a 10.000 x g a 4 ° C e trasferire i surnatanti in nuovi tubi. Scartare il pellet. Memorizzare i surnatanti del secondo set di sei piatti (Figura 1) sul ghiaccio per un'analisi successiva di WCL.
-
Preparazione delle perle anti-GFP per immunoprecipitazione di PD-1-GFP dai lisati PD-1-GFP-transfected del primo set (quattro piatti) (Figura 1).
- Per evitare la sedimentazione dei branelli, agitare delicatamente la bottiglia con i branelli prima dell'apertura. Rimuovere 40 µ l di perline anti-GFP dai liquami per ogni condizione.
- Spin a 500 x g per 3 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante per lavare le perle.
Nota: È importante per ridurre al minimo il contatto tra i puntali in plastica e perle di agarosio per prevenire la perdita. Si consiglia di tagliare il bordo di una punta di 200 µ l prima di trasferire le perle in un'altra provetta. - Risospendere le sfere in 80 µ l di tampone di lisi (per esempio).
- Aggiungere le perline lavate direttamente alla cella lysata (PNS) dalle cellule PD-1-GFP-espressione del primo set (quattro piastre) (punto 3.3). Ruotare a 0,005 x g per 30 min a 4 ° C a immunoprecipitate GFP-etichettato proteine.
- Lavare le perline con 1 mL di tampone di lisi fredda (senza orthovanadate) 3 volte. Centrifugare la provetta a 2.500 x g per 10 s.
Nota: Quando si aggiunge il tampone di lisi per le perline, aggiungerlo direttamente le perline senza toccarli con le punte. Non c'è nessun bisogno di dispensare su e giù durante i lavaggi. - Ugualmente dividere il lisato del SHP2 attivo dal primo set (una piastra; passo 3.3) e aggiungerlo a tre tubi di perline PD-1-GFP-contenente lavate (WT PD-1-GFP e le due mutazioni differenti phosphdeficient, Y223F e Y248F). Aggiungere un terzo del volume dal lysate delle cellule non trasfettate per il secondo tubo di perline WT PD-1-GFP. Scartare i rimanenti due terzi.
- Incubare le perline per 4 h a 4 ° C con una delicata rotazione (0,005 x g).
- Lavare le perle due volte con 1 mL di tampone di lisi fredda (senza pervanadate o orthovanadate), come riportati al punto 3.6.
- Aggiungere 80 µ l di tampone di lisi (senza pervanadate o orthovanadate) per esempio garantendo che il volume totale in ciascun tubo è µ l 100 (20 µ l di perline) e 80 µ l di tampone di lisi. Mescolare delicatamente e trasferire 50 µ l da ciascuna provetta in due tubi di fresco 1,5 mL.
Nota: A seguito di questo passaggio, ci saranno due tubi riempiti con una miscela contenente perline e tampone di lisi: un tubo verrà utilizzato per il test la co-immunoprecipitate SHP2 mediante western blotting, e il secondo verrà utilizzato per l'analisi di attività della fosfatasi.
4. analisi di attività di fosfatasi
- Lavare le perle una volta con tampone di lavaggio della fosfatasi (30 mM Hepes pH 7.4 e 120 mM NaCl). Rimuovere completamente il surnatante.
- Aggiungere 100 µ l di tampone di dosaggio (30 mM Hepes pH 7.4, 120 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 mM p-nitrophenylphosphate) ai talloni e incubare a 30 ° C per 30 minuti sotto agitazione delicata. Nota: Tempo di incubazione può variare, ma di attendere fino a quando il buffer diventa giallo su defosforilazione.
- Per terminare la reazione, aggiungere 50 µ l di NaOH M 1 quando il buffer diventa giallo.
- Rotazione verso il basso a 2.500 x g per 10 s e trasferimento 50 µ l del surnatante due pozzetti (duplicati con 50 µ l per pozzetto) di metà-zona in una piastra a 96 pozzetti. Leggere l'assorbanza a 405 nm.
- Esprimere i risultati come relativa densità ottica (OD) rispetto alla versione di selvaggio-tipo di controllo di PD-1-GFP.
5. SHP2 Analisi Western Blot
- Rotazione verso il basso le perline e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 20 µ l di tampone di x Laemmli 2 (Vedi Materiali tavolo) per le perline e bollire a 95 ° C per 5 min.
- Misurare la concentrazione di proteina dell'input controlli (in secondo luogo impostare) utilizzando un BCA kit (Vedi Materiali tavolo). Trasferire 30 µ l del campione più diluito ad un nuovo tubo. Diluire il resto dei controlli di input con tampone di lisi per la stessa concentrazione come il campione più diluito e trasferire 30 µ l di ciascuna di esse ad un nuovo tubo.
Nota: A seguito di questo passaggio, ci saranno 4 tubi con 30 µ l ciascuna, alle simili concentrazioni di proteina, che rappresenta l'input controlli lisati. - Aggiungere volumi uguali di 2 x Laemmli buffer per i lisati e fate bollire a 95 ° C per 5 min, Spin giù le perline e caricare il surnatante 4 – 20% gel di SDS-PAGE Tris (Vedi Materiali tavolo) per western blot analisi. Inoltre, è possibile caricare 50 µ l di ogni campione del secondo set.
- Continuare l'analisi western blot secondo il protocollo descritto in precedenza12.
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Representative Results
Mentre il contributo di ITSM di PD-1 a SHP2 associazione è stabilito, il ruolo della ITIM di PD-1 è meno chiaro. Perché SHP2 ha due domini SH2 che possono legarsi a due fosfotirosine sequenziale su PD-1 (una tirosina nell'ITSM) e un altro in ITIM, abbiamo supposto che l'ITSM di PD-1 ancore SHP2 e PD-1, mentre il ITIM di PD-1 facilita l'attività SHP2 stabilizzando la aprire stato conformazionale11,14. Per eseguire questo test, abbiamo sviluppato un combinato co-immunoprecipitazione e saggio di attività enzimatica per la valutazione parallela di interazioni recettore-enzima e attivazione. Wild type GFP-PD-1, GFP-PD-1 Y223F (mutante ITIM), o GFP-PD-1 Y248F (mutante ITSM) sono stati espressi in cellule HEK 293T che successivamente sono state curate con pervanadate (Figura 1), che conduce a fosforilato PD-1 tails. PD-1 proteine sono stati raccolti usando le perle di anti-GFP rivestito. Queste perle sono state usate per SHP2 co-immunoprecipitazione da lisati di cellule che overexpressing SHP2. I livelli di SHP2 associata a ogni versione di PD-1 e la sua attività enzimatica sono stati registrati.
Non sorprende, SHP2 Impossibile associare a PD-1, quando è stato mutato l'ITSM (Y248F; Figura 2A). Notevolmente, la versione mutante di ITIM (Y223F) ha inibito il grippaggio di SHP2 solo in misura limitata (Figura 2B). Tuttavia, l'analisi di attività della fosfatasi SHP2 ha rivelato che il ITIM e ITSM erano altrettanto indispensabile per l'attività enzimatica (Figura 2). Poiché immunoprecipitates PD-1 può contenere altri fosfatasi, oltre a SHP2, abbiamo usato una condizione di controllo (Figura 2B e 2C, blu) in cui SHP2 non overexpressed.
Quindi, un modello di attivazione in due fasi viene rivelato in cui SHP2 è piegato in una auto-inibito conformazione sotto circostanze (Figura 2D, sinistra) di riposo. Al momento dell'attivazione del PD-1, SHP2 è reclutato per l'ITSM fosforilato (Figura 2D, medio). Tuttavia, ITIM deve anche essere fosforilato per svolgersi SHP2 nella sua conformazione attiva (Figura 2D, destra).
Figura 1: Condizioni sperimentali e strategia. GFP-PD-1 WT (wild type), GFP-PD-1 Y223F (mutante ITIM), o GFP-PD-1 Y248F (mutante ITSM) sono stati espressi in cellule HEK 293T che successivamente sono state trattate con pervanadate. Proteine fosforilate GFP-PD-1 raccolti mediante immunoprecipitazione GFP sono stati mescolati con lisati di cellule che overexpressing SHP2, e sono stati registrati i livelli e l'attività di SHP2 associata a ogni versione di PD-1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: il ITIM di PD-1 è necessario per l'attività di SHP2. Le cellule HEK 293T transfected con le versioni indicate di GFP-PD-1, seguito da un trattamento pervanadate e immunoprecipitazione utilizzando anti-GFP mAb-agarosio (un). Livelli di SHP2 associati a precipitato GFP-PD-1 sono stati quantificati (b) e sottoposti ad un'analisi di attività della fosfatasi (c). Valori di SHP2 spostate verso il basso sono stati normalizzati per i livelli di espressione di GFP. Tutti i valori sono piega-variazione rispetto l'intensità di SHP2 precipitato dal WT GFP-PD-1 (wild type). I valori di attività della fosfatasi sono piega-variazione rispetto l'attività di co-immunoprecipitate SHP2 da WT GFP-PD-1. RU = unità relative. (d) il modello di attivazione in due fasi. In primo luogo, SHP2 è reclutato per l'ITSM, e solo allora il secondo dominio SH2 si lega al ITIM di PD-1, che estende il dominio catalitico di SHP2 alla conformazione completamente attivo. I dati sono presentati come media ± SEM. asterischi rappresentano le differenze significative fra il gruppo indicato con e il WT PD-1 (b e c): * *p < 0.01, * * *p < 0,001, spaiati t-test, n = 3. Autorizzazione al trattamento dei dati da Peled et al. (2018) 12 è stato concesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Interazioni del ricevitore-enzima sono cruciali per segnalazione intracellulare. Molti enzimi sono reclutati ai ricevitori attraverso domini SH2 associazione a tirosine fosforilate che decorano le code degli stessi recettori. Tuttavia, gli enzimi sono spesso piegati in conformazioni inattive chiuse e attivazione richiede un cambiamento conformazionale11 che può essere mediato da altri domini del recettore stesso. Il test descritto qui misure le interazioni tra recettori e gli enzimi come pure l'attività indotta da queste interazioni.
Abbiamo usato un saggio colorimetrico che utilizza p-nitrophenylphosphate (pNPP) come substrato per SHP2. pNPP è un donatore non selettivo di substrato e fosforo che viene rilasciato da un vasto numero di enzimi15. Peptidi ricombinanti fosforilate possono servire come substrati alternativi (ad es., quelli simili a quelli utilizzati per il dosaggio di verde malachite). Questi peptidi sono più specifici in termini di attività della fosfatasi; Tuttavia, è più costoso e dovuto la relativa sensibilità, può essere eseguita solo nelle soluzioni di fosfati. Un altro approccio per aggirare la mancanza di specificità verso pNPP consiste nell'includere una linea cellulare di controllo in cui viene colpita la fosfatasi in questione. In queste cellule, sovraespressione di SHP2 sarà l'unica fonte per l'enzima, e qualsiasi aumento di attività della fosfatasi dovrebbe essere attribuito specificamente per la fosfatasi sovraespressi. Un terzo approccio consiste nell'utilizzare una proteina SHP2 epitopo-etichetta purificata e purificata epitopo-etichetta PD-1 invece di WCL completati da fosfopeptidi come il substrato. Un'alternativa all'utilizzo di un phosphopeptide come il substrato consiste nell'utilizzare una fosfoproteina invece, e quindi la defosforilazione della proteina può essere rilevata da un anticorpo fosfo-specifici o phos-tag SDS-PAGE.
D'importanza, il metodo descritto qui può gettare luce sulla biologia di altre interazioni recettore-enzima. Ad esempio, può scoprire la funzione dei residui della tirosina in SLAM famiglia dei recettori, che è stata trovata per essere trascurabile per le interazioni con SHP216 ma in realtà può essere necessari per l'attivazione dell'enzima stesso. Questo metodo può essere applicato anche per altri fosfatasi, nonché d'interazione del ricevitore chinasi.
Mentre questo metodo è relativamente semplice, è importante notare quando inibitori delle fosfatasi dovrebbe essere evitati. Queste sono necessarie nella fase iniziale di induzione di fosforilazione di PD-1, ma più tardi devono essere rimossi al fine di testare l'attività della fosfatasi SHP2.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato finanziato da sovvenzioni NIH 1R01AI125640-01 e la reumatologia Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
References
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