Summary
Aquí, presentamos un protocolo de co-inmunoprecipitación y un ensayo de actividad enzimática en el grano al mismo tiempo estudiar la contribución de los dominios de la proteína específica de los receptores de la membrana plasmática para reclutamiento de la enzima y la actividad enzimática.
Abstract
Asociado a receptor de enzimas son los principales mediadores de la activación celular. Estas enzimas son reguladas, al menos en parte, por interacciones físicas con la cola citoplasmática de los receptores. Las interacciones a menudo se producen a través de dominios específicos de la proteína y resultan en la activación de las enzimas. Existen varios métodos para estudiar interacciones entre proteínas. Co-inmunoprecipitación se utiliza habitualmente para estudiar los dominios que se requieren para las interacciones proteína-proteína, hay no hay ensayos documento la contribución de los dominios específicos a la actividad de las enzimas reclutadas al mismo tiempo. Por consiguiente, el método descrito aquí combina co-inmunoprecipitación y un análisis de la actividad enzimática en el grano para la evaluación simultánea de las interacciones entre las proteínas y la activación enzimática asociada. El objetivo de este protocolo es identificar los dominios que son esenciales para las interacciones físicas entre una proteína y enzima y los dominios que son obligatorios para la completa activación de la enzima. Se demuestra la importancia de este ensayo, como cierto receptor dominios proteicos contribuyen a la Unión de la enzima a la cola citoplasmática del receptor, mientras que otros dominios son necesarias para regular la función de la misma enzima.
Introduction
Receptores catalíticos y cinasas de tirosina de receptores son proteínas transmembranales en la que la Unión de un ligando extracelular provoca actividad enzimática en el lado intracelular1. Algunos receptores poseen receptores y funciones enzimáticas, mientras que otros reclutan las enzimas específicas como las quinasas y fosfatasas que sus colas citoplásmicas. Contratación de una enzima a la cola del receptor y la acción catalítica de esta enzima son dos procesos separados que no siempre están regulados por la misma proteína dominios2. Por desgracia, hay no hay herramientas específicas para evaluar la interacción y la actividad enzimática al mismo tiempo. El ensayo funcional co-inmunoprecipitación se describe aquí es un método útil para disecar la contratación de una enzima a la cola de un receptor de su activación. Este ensayo utiliza inmunoprecipitación de receptores etiquetados granos recubiertos de anticuerpos. Posteriormente, un ensayo de actividad enzimática y la mancha blanca /negra occidental análisis en granos se llevan a cabo. El objetivo general de este método es descubrir qué dominios de proteína son necesarios para las interacciones entre los receptores y enzimas (determinadas por análisis de western blot) y qué dominios son obligatorios para la completa activación de las enzimas (medido por el cordón ensayo de actividad enzimática). Es importante desarrollar herramientas para el estudio de las funciones separadas de enzimas asociado a receptor debido a su participación en la patogenia de enfermedades humanas. Por otra parte, la mayor comprensión de los mecanismos de acción de estas proteínas puede ayudar el diseño de nuevas intervenciones terapéuticas.
Muerte programada-1 (PD-1) es un receptor inhibitorio en la superficie de las células de T y es necesaria para limitar el excesivo T cell responses. En los últimos años, se han implicado anticuerpos anti-PD-1 en el tratamiento de múltiples tumores malignos1,2. PD-1 ligadura refrena numerosas funciones de la célula de T, incluyendo la proliferación, adhesión y secreción de varias citoquinas3,4,5. PD-1 se localiza en la sinapsis inmunológica, la interfaz entre las células T y células presentadoras de antígeno6, donde colocalizes con el receptor de células T (TCR)7. Posteriormente, la tirosina fosfatasa SHP2 [homología Src 2 (SH2) dominio que contiene tirosina fosfatasa 2] es reclutado a la cola citoplasmática de PD-1, conduce a la desfosforilación de residuos claves de tirosina dentro el complejo TCR y su asociado proximal señalización de moléculas3,4,5,8,9. La cola citoplasmática de PD-1 contiene dos motivos de tirosina, un immunoreceptor basados en tirosina inhibidor adorno (ITIM) y un immunoreceptor tyrosine interruptor basado en motif (ITSM)10. Ambos motivos son fosforiladas en PD-1 ligadura9,10. Estudios de mutagénesis han revelado un papel primordial para el ITSM en el reclutamiento, a diferencia de ITIM, cuyo papel en la señalización de PD-1 y la función no está clara de SHP24.
SHP2 adopta sea un cerrado (doblado), inhibió la conformación o abierto (extendido), conformación activa11. La contribución de cada dominio de la cola de PD-1 SHP2 vinculante o activación aún no se ha aclarado. Para responder a esta pregunta, hemos desarrollado un análisis que permite la prueba paralela del reclutamiento de SHP2 a la cola de PD-1 y su actividad12. Emplean co-inmunoprecipitación y un análisis de la actividad de fosfatasa en grano para probar la interacción y la actividad enzimática en paralelo. Usando este análisis, nos muestran que el ITSM de PD-1 es suficiente para reclutar SHP2 a la cola de PD-1, mientras que el ITIM de PD-1 se necesita ampliar y activar la enzima.
Existen muchos receptores que tienen varios dominios adyacentes en su cola citoplasmática. El análisis funcional co-inmunoprecipitación puede descubrir el papel de los dominios específicos que son necesarios para el reclutamiento de la proteína o la activación enzimática.
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Protocol
1. transfección de células
- La semilla células HEK 293T en doce placas de 10 cm (5 x 106 células por placa) el día antes de transfección (figura 1). Realizar el conteo de células usando un hemocitómetro. Para cada placa, use 10 mL de DMEM suplementado con 10% de SBF y el 1% de penicilina/estreptomicina. Incube las células a 37 ° C en 5% CO2.
- Una vez que las células son 80-90% confluente, transfectar 5 placas HEK 293T utilizando un reactivo de transfección basada en lípidos con uno de la plásmidos siguiente: un vector de expresión de SHP2, un vector de expresión de GFP 1 PD [una versión de tipo salvaje (WT) de PD-1], una versión mutada de ITIM (Y223F ) de un vector de PD-1-GFP-expresando y una versión mutada de ITSM (Y248F) de un vector de expresión de GFP 1 PD (figura 1).
Nota: Dos placas se ser transfectadas con el vector peso PD-1-GFP-expresando su. Una placa adicional servirá como un control no transfected las células (figura 1). - Realizar la transfección según protocolo del fabricante para células adherentes en placas de 10 cm.
Nota: En las versiones mutadas de PD-1, la tirosina (Y) en cada adorno fue substituido por fenilalanina (F) que no puede ser phosphorylated. - Transfectar un segundo idéntico conjunto de cinco platos y una placa adicional que sirve como un control no transfectadas para la medición de la cantidad de proteína expresada [entrada; también conocido como lisado de células enteras (CMT)] antes de la inmunoprecipitación (figura 1).
- Incube las células transfected para 48 h en 37 ° C, 5% CO2 en una incubadora de cultivo de tejidos.
Nota: Para asegurar que la transfección ha producido con éxito, examinar las células de expresión de GFP utilizando un microscopio de fluorescencia.
2. promover la fosforilación en las células Transfected
- Después de incubación, preparar pervanadate fresco mezclando 50 μl de ortovanadato de sodio (de la acción de 100 mM) con 50 μl de 30% H2O2.
Nota: La mezcla debe cambiar a un color amarillento. Pervanadate es un inhibidor de la fosfatasa permeable a la célula que promueve la fosforilación de tirosina residuos13. En este ensayo, se utiliza para robusta inducir la fosforilación de las colas de PD-1. - Para fosforilan las versiones etiquetadas de PD-1, eliminar los medios de comunicación de las células transfectadas de GFP 1 PD y añadir 10 mL de DMEM simple (sin suero ni antibióticos) junto con 10 μl de pervanadate (paso 2.1) para cada placa de 10 cm (dando por resultado ocho placas expresando diferentes versiones de PD-1) (figura 1). Colocar las placas a temperatura ambiente en oscuridad durante 15 minutos.
Nota: El SHP2-transfected las células (dos placas; Figura 1) y las dos placas de control no transfectadas no son tratadas con pervanadate, ya que estas placas servirá como fuente para la enzima activa de SHP2. - Lavar las células con 5 mL de helado de 1 x PBS. Repita este paso dos veces.
3. inmunoprecipitación
Nota: Los pasos siguientes deben realizarse en hielo o a 4 ° C.
- Suplemento el tampón de lisis (50 mM Tris-HCl a pH 7.2, 250 mM de NaCl, 0,1% NP-40, 2 mM EDTA, 10% glicerol) con inhibidores de la proteasa (disolver 1 comprimido en 10 mL de tampón de lisis) y con 1 mM ortovanadato de sodio. Añadir 500 μl de tampón de lisis helada a las células y retirar y recoger las células de las placas inmediatamente con un raspador celular.
Nota: Es importante agregar el ortovanadato de sodio solamente para el tampón de lisis que se utilizarán para las placas de PD-1-GFP-transfected, puesto que las placas de SHP2-transfectadas y placas de control no transfectadas deben conservar la actividad de la fosfatasa. - Transferencia de los lisados en frío tubos de 1.5 mL y gire a 0.005 x g, 4 ° C por 30 minutos.
- Para recolectar los núcleos post sobrenadante (PNS) de los lisados, desactivación de los lisados por 10 min a 10.000 x g a 4 ° C y transferir el sobrenadante a tubos de nuevo. Deseche los pellets. Almacenar los sobrenadantes del segundo conjunto de seis platos (figura 1) en el hielo para su posterior análisis de CMT.
-
Preparación de los granos anti-GFP por inmunoprecipitación de PD-1-GFP de los lisados de PD-1-GFP-transfectadas del primer conjunto (cuatro placas) (figura 1).
- Para evitar la sedimentación de los granos, agitar suavemente la botella con los granos antes de abrir. Retire la mezcla por cada condición a 40 μl de los granos anti-GFP.
- Centrifugado a 500 x g durante 3 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante para lavar los granos.
Nota: Es importante minimizar el contacto entre las pipetas de plástico y perlas de agarosa para evitar la pérdida. Se recomienda cortar el borde de una punta de 200 μL antes de transferir las cuentas a otro tubo. - Resuspender los granos en 80 μl de tampón de lisis (por muestra).
- Añadir los granos lavados directamente a la celda lisado (PNS) de las células de PD-1-GFP-expresando el conjunto primero (cuatro placas) (paso 3.3). Gire a 0.005 x g durante 30 min a 4 ° C a las proteínas de la GFP-con la etiqueta immunoprecipitate.
- Lavar los granos con 1 mL de tampón de lisis frío (sin ortovanadato) 3 veces. Centrifugar el tubo a 2.500 x g durante 10 s.
Nota: Al añadir el tampón de lisis a los granos, agregarlo directamente sobre los granos sin tocar con las puntas. No hay necesidad para pipeta hacia arriba y hacia abajo durante el lavado. - Igualmente dividir el lisado de los SHP2 activo del primer conjunto (una placa; paso 3.3) y añadir en tres tubos de los granos lavados de PD-1-GFP-que contiene (la WT PD-1-GFP y las dos mutaciones de diferentes phosphdeficient, Y223F y Y248F). Añadir un tercio del volumen de lisado de las células transfectadas no al segundo tubo de los granos de peso PD-1-GFP. Deseche los restantes dos tercios.
- Incubar los granos durante 4 h a 4 ° C con rotación suave (0.005 x g).
- Lavar los granos dos veces con 1 mL de tampón de lisis frío (sin pervanadate ni ortovanadato), como se informó en el paso 3.6.
- Agregar 80 μl de tampón de lisis (sin pervanadate ni ortovanadato) por ejemplo asegurándose de que el volumen total en cada tubo es 100 μl (20 μl de granos) y 80 μl de tampón de lisis. Mezclar suavemente y transferir 50 μl de cada tubo en dos tubos de 1.5 mL fresco.
Nota: Después de este paso, habrá dos tubos llenados con una mezcla que contiene granos y tampón de lisis: se utilizará un tubo para probar el SHP2 co-immunoprecipitated por borrar occidental, y la segunda se utilizará para el ensayo de actividad de la fosfatasa.
4. ensayo de actividad de fosfatasa
- Lavar los granos una vez con tampón de lavado fosfatasa (30 mM Hepes, pH 7.4 y 120 mm NaCl). Quite completamente el sobrenadante.
- Añadir 100 μl de tampón de ensayo (30 mM Hepes, pH 7.4, 120 mM NaCl, 5 mM TDT, 10 mM p-nitrophenylphosphate) a los granos e incubar a 30 ° C por 30 min en agitación suave. Nota: Tiempo de incubación puede variar, pero espere hasta que el búfer se vuelve amarillo al desfosforilación.
- Para terminar la reacción, añada 50 μl de 1 M NaOH cuando el buffer se vuelve amarillo.
- Desactivación a 2.500 x g durante 10 s y transferir 50 μl del sobrenadante a dos pozos (duplicados con 50 μL por pocillo) de área de medio en una placa de 96 pocillos. Leer la absorbancia a 405 nm.
- Los resultados se expresarán como relativa densidad óptica (OD) sobre la versión del control de tipo salvaje de PD-1-GFP.
5. SHP2 Análisis de Western Blot
- Desactivación de los granos y eliminar el sobrenadante.
- Añadir 20 μl de tampón de x Laemmli 2 (véase Tabla de materiales) a los granos y ebullición a 95 ° C durante 5 minutos.
- Medir la concentración de proteína de la entrada de control (segundo sistema) usando un BCA kit (véase Tabla de materiales). Transferencia 30 μl de la muestra más diluida a un tubo nuevo. Diluir el resto de los controles de entrada con buffer de lisis a la misma concentración que la muestra más diluida y transferir 30 μl de cada uno de ellos a un tubo nuevo.
Nota: Después de este paso, habrá 4 tubos con 30 μL cada una, en concentraciones similares en proteína, que representa la entrada controla lisados. - Añadir volúmenes iguales de buffer x Laemmli 2 los lisados y ebullición a 95 ° C por 5 min la vuelta abajo de los granos y cargan el sobrenadante de 4 – 20% gel de SDS-PAGE Tris (véase Tabla de materiales) para western blot análisis. Además, coloque 50 μl de cada muestra del segundo sistema.
- Continuar el análisis western blot según el protocolo describen previamente12.
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Representative Results
Mientras se establece la contribución de la ITSM de PD-1 enlace de SHP2, el papel de ITIM de PD-1 es menos claro. Porque SHP2 tiene dos dominios SH2 que se pueden unir a dos phosphotyrosines secuenciales de PD-1 (a una tirosina en el ITSM) y otra en el ITIM, presumimos que el ITSM de PD-1 anclas SHP2 PD-1, mientras que el ITIM de PD-1 facilita la actividad de SHP2 estabilizando su Abra estado conformacional11,14. Para probar esto, desarrollamos un combinado co-inmunoprecipitación y el ensayo de actividad enzimática para la evaluación paralela de las interacciones receptor-enzima y activación. Tipo salvaje de GFP-PD-1, GFP-PD-1 Y223F (mutante ITIM), o GFP-PD-1 Y248F (mutante ITSM) fueron expresadas en células HEK 293T que posteriormente fueron tratadas con pervanadate (figura 1), hacia colas de PD-1 fosforiladas. PD-1 proteínas se recopilaron utilizando granos recubierto de anti-GFP. Estos granos fueron utilizados para SHP2 co-inmunoprecipitación de lisados de células overexpressing SHP2. Se registraron los niveles de SHP2 a cada versión de PD-1 y su actividad enzimática.
Como era de esperar, no se unen a PD-1 cuando fue transformado el ITSM SHP2 (Y248F; Figura 2A). Notablemente, la versión mutante de ITIM (Y223F) inhibe SHP2 vinculante sólo en medida limitada (figura 2B). Sin embargo, el ensayo de actividad de fosfatasa SHP2 reveló que el ITIM y ITSM eran igualmente indispensables para la actividad enzimática (figura 2). Ya que PD-1 immunoprecipitates puede contener otras fosfatasas, además de SHP2, utilizamos una condición de control (figura 2B y 2C, azul) en la que no se sobreexpresa SHP2.
Por lo tanto, un modelo de activación de dos etapas se revela en que SHP2 se pliega en una conformación inhibida por el auto en condiciones (Figura 2D, izquierda) de reposo. En la activación de PD-1, SHP2 es reclutado para el ITSM fosforilada (Figura 2D, centro). Sin embargo, el ITIM también debe ser fosforilada para desplegar SHP2 en su conformación activa (Figura 2D, derecha).
Figura 1: estrategia y condiciones experimentales. GFP-PD-1 peso (tipo salvaje), GFP-PD-1 Y223F (mutante ITIM), o GFP-PD-1 Y248F (mutante ITSM) fueron expresadas en células HEK 293T que posteriormente fueron tratadas con pervanadate. Fosforilada proteínas GFP-PD-1 recopiladas por inmunoprecipitación GFP se mezclaron con lisados de células overexpressing SHP2, y se registraron los niveles y actividad de SHP2 a cada versión de PD-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: el ITIM de PD-1 es necesario para la actividad de SHP2. Células HEK 293T fueron transfectadas con las versiones indicadas de GFP-PD-1, seguido por el tratamiento de la pervanadate y la inmunoprecipitación con mAb anti-GFP-agarosa (un). Niveles de SHP2 a precipitado GFP-PD-1 fueron cuantificados (b) y sometidos a un análisis de la actividad de la fosfatasa (c). Valores de SHP2 tiró-abajo fueron normalizados a nivel de expresión de GFP. Todos los valores son doble-cambio en comparación con la intensidad de SHP2 precipitado por la GFP de WT-PD-1 (tipo salvaje). Valores de actividad de la fosfatasa son doble-cambio en comparación con la actividad de SHP2 co-immunoprecipitated por la GFP de WT-PD-1. RU = unidades relativas. (d) el modelo de activación de dos etapas. En primer lugar, SHP2 es reclutado en el ITSM, y sólo entonces hace el segundo dominio SH2 atan a ITIM de PD-1, que se extiende el dominio catalítico de SHP2 a la conformación totalmente activa. Los datos se presentan como media ± SEM. asteriscos representan diferencias significativas entre el grupo denota y el PD de WT-1 (b y c): **p < 0.01, ***p < 0.001, prueba de t, n = 3. Permiso para usar datos de Peled et al. (2018) 12 se concedió. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Interacciones receptor-enzima están cruciales para la señalización intracelular. Muchas enzimas son reclutadas a los receptores a través de dominios SH2 a tirosinas fosforiladas que decoran las colas de los mismos receptores. Sin embargo, enzimas se doblan a menudo en conformaciones inactivos cerrados, y la activación requiere un cambio conformacional11 que puede estar mediado por otros dominios del receptor del mismo. El ensayo descrito aquí medidas de las interacciones entre receptores y enzimas, así como la actividad inducidas por estas interacciones.
Se utilizó un ensayo colorimétrico que utiliza p-nitrophenylphosphate (pNFF) como substrato para SHP2. pNFF es un no selectivo donante sustrato y fósforo que se libera por un amplio número de enzimas15. Péptidos recombinantes fosforiladas pueden servir como sustratos alternativos (por ej., aquellos similares a los utilizados en el ensayo de verde de Malaquita). Estos péptidos son más específicos en cuanto a la actividad de la fosfatasa; sin embargo, es más costoso, y debido a su sensibilidad, puede realizarse solamente en soluciones libres de fosfato. Otro enfoque para evitar la falta de especificidad hacia pNFF es incluir una línea de células de control en la cual la fosfatasa en cuestión es noqueada. En estas células, sobreexpresión de SHP2 será la única fuente para la enzima, y cualquier aumento en la actividad de la fosfatasa debe ser atribuida específicamente a la fosfatasa sobreexpresada. Un tercer enfoque es utilizar un etiquetado del epítopo purificado de la proteína SHP2 y purificada del epítopo tagged PD-1 en lugar de CMT complementado por fosfotoproteida como el substrato. Una alternativa al uso de un fosfopéptidos como el substrato es usar en su lugar una fosfoproteína, y luego la desfosforilación de la proteína puede detectarse anticuerpos fosfo-específicos o phos-tag SDS-PAGE.
Lo importante, el método descrito aquí puede arrojar luz sobre la biología de otras interacciones receptor-enzima. Por ejemplo, puede descubrir la función de los residuos de tirosina de receptores de la familia SLAM, que se han encontrado para ser insignificante para las interacciones con SHP216 pero realmente pueden ser necesario para la activación de la misma enzima. Este método puede aplicarse también a otras fosfatasas y quinasas de interacción con receptor.
Si bien este método es relativamente sencillo, es importante tener en cuenta cuando deben evitarse los inhibidores de la fosfatasa. Estos son necesarios en el paso inicial de inducción de la fosforilación de PD-1, pero después debe eliminarse para probar la actividad de la fosfatasa de SHP2.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por subvenciones de NIH 1R01AI125640-01 y la Fundación de investigación de reumatología.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
References
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