Summary
כאן נתאר פרוטוקול כדי להביע את החלבונים לתוך protoplasts באמצעות שיטת שינוי בתיווך פג. השיטה מספקת קל ביטוי של חלבונים עניין ולאחר חקירה יעילה של חלבון לוקליזציה, תהליך הייבוא בתנאי ניסוי שונים ויוו.
Abstract
כלורופלסט הוא אברון חיוני כי הוא אחראי על תהליכים שונים התאית בצמחים, כגון פוטוסינתזה וייצור של מטבוליטים משניים רבים ושומנים. מהכלורופלסט לדרוש מספר רב של חלבונים אלה תהליכים פיזיולוגיים שונים. מעל 95% של כלורופלסט חלבונים הם מקודד גרעין והן מיובאים לתוך מהכלורופלסט של ציטוזול לאחר התרגום ריבוזומים cytosolic. לפיכך, הייבוא נכונה או פילוח של חלבונים אלה כלורופלסט מקודד גרעין כדי מהכלורופלסט חיוני לתפקוד תקין של מהכלורופלסט, כמו גם על תא צמח. כלורופלסט גרעין מקודדת חלבונים מכילים רצפי אותות פילוח מסוים כדי מהכלורופלסט. מכונות מולקולריות מקומי כלורופלסט או ציטוזול מזהה אותות אלה ולבצע את תהליך הייבוא. כדי לחקור את המנגנונים של חלבון ייבוא או המיקוד מהכלורופלסט ויוו, פיתחנו מהיר, יעיל מבוססי פרוטופלאסט שיטה לנתח חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט של תודרנית. בשיטה זו, אנו משתמשים protoplasts מבודד מן העלים רקמות של תודרנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור שימוש protoplasts כדי לחקור את המנגנון שבאמצעותו חלבונים מיובאות לתוך מהכלורופלסט.
Introduction
כלורופלסט הוא אחד organelles החשובים ביותר צמחים. אחת מהפונקציות העיקריות של מהכלורופלסט היא לבצע פוטוסינתזה1. מהכלורופלסט לבצע גם רבים תגובות ביוכימיות אחרות לייצור של חומצות שומן, חומצות אמינו, נוקלאוטידים ו מטבוליטים משניים רבים1,2. עבור כל תגובות אלו, מהכלורופלסט דורשים מספר רב של סוגים שונים של חלבונים. עם זאת, הגנום כלורופלסט מכיל רק כ-100 גנים3,4. לכן, מהכלורופלסט עליך לייבא את רוב החלבונים שלהם ציטוזול. למעשה, רוב החלבונים כלורופלסט הראו להם אפשרות לייבא את ציטוזול לאחר תרגום-4,-5,-6. תאי צמחים דורשים למנגנונים הספציפיים כדי לייבא חלבונים מן ציטוזול מהכלורופלסט. עם זאת, למרות מנגנונים ייבוא חלבונים אלה נחקרו מספר עשורים, אנחנו עדיין לא מבינים לחלוטין אותם ברמה המולקולרית. כאן, אנו מספקים שיטה מפורטת עבור הכנת protoplasts ולבטא exogenously גנים protoplasts. שיטה זו יכולה להיות יקר עבור שחקרתי את המנגנונים המולקולריים שבבסיס חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט בפירוט.
חלבון הייבוא ניתן יהיה ללמוד שימוש בגישות שונות רבות. אחת משיטות אלה כרוכה בשימוש במבחנה חלבון ייבוא מערכת7,8. שימוש בגישה זו במבחנה-חלבון מתורגם מבשרי מודגרת עם מהכלורופלסט מטוהרים במבחנה, ומנותח חלבון הייבוא על-ידי מרחביות-דף ואחריו תספיג ניתוח. היתרון של גישה זו הוא כי כל שלב של חלבון ייבוא לתוך מהכלורופלסט ניתן יהיה ללמוד בפירוט. לכן, בשיטה זו כבר בשימוש נרחב כדי להגדיר את הרכיבים של המנגנון המולקולרי של ייבוא חלבון וכדי לנתח מידע רצף עבור המעבר פפטידים. לאחרונה, גישה אחרת הכרוכות של protoplasts רקמות עלים פותחה, יש להיות בשימוש נרחב ללמוד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט9,10. היתרון של גישה זו הוא כי protoplasts מספקים סביבה הסלולר זה קרוב לזה של תאים שלמים מאשר מערכת במבחנה . לפיכך, המערכת פרוטופלאסט מאפשרת לנו להתייחס היבטים נוספים של תהליך זה, כגון האירועים הקשורים cytosolic, איך נקבע ייחודה של פילוח אותות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט על השימוש protoplasts ללמוד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול של צמחים תודרנית
- להכין 1 L Gamborg B5 בינונית (B5) על-ידי הוספת 3.2 g של B5 בינוני כולל ויטמינים, 20 גר' סוכרוז, 0.5 גר' 2-(N-morpholino) אתאן sulfonic חומצה (MES) כדי כ- 800 מ ל מים יונים, והתאימו את ה-pH ל 5.7 עם אשלגן הידרוקסידי (KOH). הוסף יותר יונים מים להביא את הנפח הכולל 8 הוסף ל 1g של phytoagar ו אוטוקלב למשך 15 דקות-121 מעלות צלזיוס.
- לאפשר המדיום מגניב עד 55 ° צלזיוס, שופכים 20 – 25 מ של המדיום B5 לתוך צלחת פטרי (9 ס מ קוטר, 1.5 ס מ גובה) על ספסל נקי. מתייבשים צלחות במשך 2-3 ימים, לארוז אותם עם גלישת נקי, לשמור אותם במקרר עד לשימוש.
- לחטא תודרנית לבנה זרעים עם 1 מ"ל אתנול 70% (v/v) בשפופרת צנטרפוגה (ה-tube) ע י ניעור באופן רציף במשך 2-3 דקות להסיר את תגובת שיקוע, להוסיף 1 מ"ל של 1% (v/v) נתרן תת-כלורי פתרון אותם ללחוץ ברציפות במשך 2-3 דקות להכין 100 – זרעים 150 לכל צלחת פטרי.
- להסיר את supernatants ולשטוף את הזרעים עם 1 מ ל מים מזוקקים. חזור על שלב זה, 4 x. מקם את הזרעים מעוקר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים לסנכרן את נביטת הזרעים.
- לזרוע זרעים 100 – 150 על גבי צלחות B5 באמצעות micropipette ויסגור את הצלחת עם הדבקה.
- לגדל צמחים בחדר צמיחה עם מחזור/כהה 16 h/8 h-100 µmol·m-2·s-1 עוצמת האור, 70% לחות וטמפרטורה 20 ° C למשך שבועיים.
2. הכנת פלסמיד
הערה: טוהר גבוהה פלסמידים שישמש לשם שינוי; השימוש של ערכת טיהור פלסמיד מסחרי מומלץ.
- לטהר את פלסמיד (RbcS-nt:GFP) באמצעות ערכת בידוד ה-DNA. להתרכז דנ א, לבצע אתנול משקעים צינור 1.5 mL, להמיס בגדר DNA ב 100 µL של מים מזוקקים. לקבוע את ריכוז פלסמיד באמצעות ספקטרופוטומטרים-260 ננומטר. לדלל את פלסמיד כדי ריכוז סופי של ~ 2 µg / µL. לשמור את פלסמיד ב-20 ° C עד השימוש.
3. בידוד של Protoplasts
- הכינו את הפתרונות הבאים.
- להכין את הפתרון אנזים להכיל 0.25% (w/v) macerozyme, cellulase 1.0% (w/v), מ מ 400 D-מניטול, 8 מ"מ סידן כלורי (2CaCl), 0.1% (w/v) אלבומין שור (BSA), ו- 5 מ מ MES. להתאים את ה-pH ל 5.6 עם קו.
- לסנן את הפתרון אנזים באמצעות יחידת מסנן אצטט תאית עם גודל הנקבוביות 0.45 μm. Aliquot 25 מ של הפתרון אנזים לתוך צינורות חרוט 50 מ ל, לשמור ב-20 ° C. להפשיר את הפתרון אנזים בטמפרטורת החדר (RT) ומערבבים היטב לפני השימוש.
- להכין פתרון סוכרוז 21% (w/v) על ידי המסת 21 גר' סוכרוז ב- 100 מ של מים יונים, החיטוי הפתרון.
- להכין פתרון W5 מכיל 154 מ מ נתרן כלורי (NaCl), 125 מ מ CaCl2, 5 מ מ אשלגן כלורי (אשלגן), גלוקוז 5 מ מ ו- 1.5 מ מ MES. להתאים את ה-pH ל 5.6 ועם קו אוטוקלב הפתרון.
- להכין פתרון MaMg מכילים 400 מ D-מניטול, 15 מ מ מגנזיום כלוריד (MgCl2), ו- 5 מ מ MES. להתאים את ה-pH ל 5.6 ועם קו אוטוקלב הפתרון.
- להכין 1 מ' D-מניטול 1 M סידן חנקתי מניות ופתרונות כדי להפוך את הפתרון פג. אוטוקלב פתרונות אלו.
- להכין את הפתרון אנזים להכיל 0.25% (w/v) macerozyme, cellulase 1.0% (w/v), מ מ 400 D-מניטול, 8 מ"מ סידן כלורי (2CaCl), 0.1% (w/v) אלבומין שור (BSA), ו- 5 מ מ MES. להתאים את ה-pH ל 5.6 עם קו.
- הקציר רקמות עלים שלמים מצמחים 2 שבועות בת ~ 1 – 2 צלחות B5 באמצעות סכין כירורגית וראש במקום העלים שנקטפו לתוך חרוט 50 מ ל צינור המכיל 25 מ ל אנזים פתרון. למקם את צינור חרוטי המכיל אנזים פתרון ועלה הרקמות בצורה אופקית על מטרף סיבוביים עם עצבנות עדינה בחושך. זה לוקח 8 – 12 h לעיכול מלא של רקמות עלים.
- ב 8-12 שעות לאחר דגירה, שופכים את הפתרון אנזים (מכיל protoplasts שוחררו רקמות עלים) לתוך צלחת פטרי טריים דרך רשת עם 140 גודל הנקבוביות מיקרומטר. בזהירות שכבה הפתרון אנזים פרוטופלאסט המכיל מעל 15 מ"ל של 21% (w/v) סוכרוז פתרון, centrifuge זה ב 98 g x 10 דקות עם ההגדרות האצה והאטה הנמוך ברוטור מתנדנד-דלי.
- באמצעות פיפטה של פסטר, בזהירות להעביר את protoplasts מהשכבה העליונה ביותר (אנזים פתרון), בנקודת המפגש בין אנזים פתרון פתרון סוכרוז צינור חרוטי 50 מ ל המכיל 30 מ של W5 פתרון. Centrifuge את הצינור הזה ב g x 51 במשך 6 דקות. בשלב זה, protoplasts יהיה בגדר בתחתית הצינורית חרוט.
- למחוק את תגובת שיקוע בזהירות בעזרת פיפטה מבלי להפריע בגדר protoplasts. להוסיף 25 מ של W5 פתרון, resuspend בעדינות את protoplasts. דגירה הפתרון פרוטופלאסט במקרר 4 ° C במשך לפחות שעה לייצוב.
4. פרוטופלאסט טרנספורמציה שימוש בפוליאתילן גליקול
- הכן של 40% יתד פתרון על-ידי הוספת 4 g של 8000 פג, 4 מ של 1 מ' מניטול פתרון, 1 מ"ל של 1 מ' Ca (3)2ו- 1.8 מ ל מים מזוקקים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ומערבבים היטב. להמיס פג על ידי חימום בתנור מיקרוגל למקום ס' 20 – 30 על 40% פתרון פג ב RT להירגעות.
הערה: 40% פג פתרון צריך להיות מוכן טרי בכל פעם. אם הם protoplasts לא מגורען לחלוטין במהלך 4 ° C במקרר, centrifuge את החומר ב 46 x g למשך 2 דקות. - להסיר את תגובת שיקוע בזהירות אך לחלוטין ולהוסיף MaMg פתרון בגדר פרוטופלאסט להניב את הריכוז של 5 x 106/mL.
הערה: מספר פרוטופלאסט יכול להיקבע על ידי hemocytometer מתחת למיקרוסקופ. - מקום 10 µg של פלסמיד DNA מ"ל 13 ריקה כל סיבוב למטה צינור ולהוסיף 300 µL של פתרון פרוטופלאסט באמצעות פיפטה.
הערה: הסוף של קצה פיפטה צריך ייחתך. בכל פעם protoplasts הם שנדגמו, הפתרון המכילות פרוטופלאסט צריך להיות resuspended לפני pipetting כך מספר זהה של protoplasts מתווסף כל שפופרת. - מערבבים את פלסמיד DNA עם protoplasts על ידי בעדינות סיבוב הצינורות ומוסיפים מיד 300 µL של 40% פג הפתרון באמצעות פיפטה של. לערבב בעדינות אבל לחלוטין על-ידי סיבוב צינורות, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר; להטות את הצינור כמעט אופקית, לסובב אותו מספר פעמים.
- מוסיפים 1 מ"ל של W5 פתרון ומערבבים בעדינות אבל לחלוטין על-ידי סיבוב הצינור ביד בצורה דומה. דגירה המדגם 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלב זה פעמיים יותר באמצעות 1.5 mL ו- 2 מ"ל של W5 פתרון, בהתאמה. תקופת דגירה של 30 דקות לאחר התוספת האחרונה של W5 פתרון.
- צנטריפוגה-g x 46 עבור 4 דק להשליך תגובת שיקוע והוסף 2 מ"ל של W5 פתרון. מערבבים בעדינות אבל לחלוטין. דגירה ב 22 מעלות צלזיוס בחדר חשוך.
5. ניתוח של הייבוא החלבון לתוך מהכלורופלסט
הערה: לאחר בתיווך פג טרנספורמציה של protoplasts, זמן הדגירה נע בין 8 ל 24 שעות.
-
מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
- מקום 10 µL של הפתרון פרוטופלאסט על כוס שקופיות באמצעות פיפטה עם טיפ החתוך ובזהירות לכסות עם coverslip כדי למנוע נזק של protoplasts.
- המקום השקופית על הבמה של מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד עירור/פליטה מסנן מגדיר של התבוננות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כלורופיל אוטומטי-זריחה.
- לכידת תמונות עם המצלמה מקורר תשלום מצמידים מכשיר (CCD) ותמונות תהליך באמצעות תוכנה לעריכת תמונות כדי להפיק תמונות צבע מדומה.
-
חלבון הכולל חילוץ ו- Immunoblotting
- להכין מאגר דנטורציה המכילה 2.5% (w/v) נתרן dodecylsulfate (מרחביות), ו-2% (v/v) מרקפטואתנול.
הערה: חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט ניתן לכמת על ידי מדידת מידת המעבר פפטיד עיבוד באמצעות ניתוח immunoblot באמצעות נוגדן anti-GFP. - העברת protoplasts לתוך צנטריפוגה צינור צנטריפוגה ב 46 x g במשך 4 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע והוסף µL 80 דנטורציה המאגר. נמרצות מערבולת עבור 5 s ולהוסיף 5 x מאגר מדגם מרחביות (250 מ מ (pH 6.8) Cl-טריס, 0.5 M DTT, 10% (w/v) מרחביות, 0.05% (w/v) Bromophenol כחול, ו 50% (v/v) גליצרול). מערבבים היטב, להרתיח 10 דקות.
- נושא את הדוגמית הזו. חלבון סטנדרטי מרחביות-דף, immunoblotting עם נוגדן anti-GFP.
- להכין מאגר דנטורציה המכילה 2.5% (w/v) נתרן dodecylsulfate (מרחביות), ו-2% (v/v) מרקפטואתנול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הייבוא של חלבונים לתוך מהכלורופלסט יכולים להיבדק באמצעות שתי גישות: מיקרוסקופ פלורסצנטיות וניתוח immunoblot לאחר ההפרדה מרחביות-דף-מתווכת. כאן השתמשנו RbcS-nt:GFP, פיוז'ן לבנות קידוד N-מסוף 79 חומצת אמינו משקעי RbcS המכיל את פפטיד טרנזיט דבוקה GFP. כאשר חלבונים מיובאות לתוך מהכלורופלסט, זריחה ירוק האותות החלבון היעד RbcS-nt:GFP צריך להתמזג עם אותות פלואורסצנט אדום כלורופיל אוטומטי-זריחה, כפי שנבדקו על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (איור 1). החפיפה קרוב של שני אותות מציין חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט. לעיתים קרובות האותות GFP פזורות בכל רחבי בתורה מהכלורופלסט או מרוכזים במרכז מהכלורופלסט, עם חלש אותות מפוזר ברחבי בתורה מהכלורופלסט, בהתאם החלבון בודדים. הייבוא של חלבונים יכולים להיות מאושרות על ידי ניתוח immunoblot באמצעות נוגדן GFP. חלבונים הכולל המוכן protoplasts, מופרדים על-ידי מרחביות-דף ואחריו תספיג ניתוח (איור 2). ברוב המקרים, שתי להקות חלבון להתייחס ב immunoblot אם חלבון יובא כראוי לתוך מהכלורופלסט: הלהקה עליון מקביל באורך מלא למבשר והתזמורת התחתון אל הטופס מעובד לאחר ייבוא לתוך מהכלורופלסט. הסכום של הטופס מעובד של החלבון צריך להגדיל באופן תלוי-זמן. תוצאות כאלה ירמוז כי החלבון RbcS-nt:GFP מיובא מהכלורופלסט של תודרנית protoplasts. יתר על כן, היחס של הטופס מעובד על הסכום הכולל של ביטוי חלבונים (הטופס מעובד בתוספת קודמן) יכול לשמש כאמצעי של ייבוא יעילות. במידת הצורך, בתורה מהכלורופלסט יכול להיטהר מן protoplasts lysed בעדינות, חלבונים מן השבר כלורופלסט ניתן לנתח באמצעות סופג המערבי לאשר היבוא של חלבונים נוספים לתוך מהכלורופלסט.
איור 1. In vivo לוקליזציה של GFP דבוקה פפטיד טרנזיט RbcS כדי מהכלורופלסט.
התמונות צולמו 18 h לאחר שינוי תחת מיקרוסקופ זריחה. ירוק (), אדום (b), ממוזג (c) ואת תוויות בהיר (d) מצביעים על תמונת ה-GFP, כלורופיל תמונה, התמונה הממוזגת של שני אותות וכן תמונת שדה בהיר, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. ניתוח תספיג RbcS-nt:GFP לחקור חלבונים לייבא לתוך מהכלורופלסט.
תמציות חלבונים סה כ היו המוכן protoplasts, מופרדים על-ידי 10% (w/v) מרחביות-דף, ואחריו ניתוח תספיג באמצעות נוגדן anti-GFP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סיפקנו פרוטוקול מפורט על השימוש protoplasts של תודרנית ללמוד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט. שיטה זו היא חזקה על חקירת תהליך הייבוא חלבון. טכניקה זו פשוטה, תכליתי שימושית לבחינת הפגיעה המכוונת החלבונים מטענים המיועד ל מהכלורופלסט. באמצעות שיטה זו, protoplasts מוכנות רקמות עלים של תודרנית11,12 אשר ניתן להשיג צמחים בשלבי גדילה שונים רבים החל מוקדם מאוד עלים בוגרים לגמרי. עם זאת, יש לנקוט בעת גידול הצמחים המשמשים פרוטופלאסט הכנה. יש להשתמש צמחים בריאים מאוד, כפי protoplasts שהוכנו מצמחים בריא יכול לעמוד הצעדים רבים הכרוכים בשינוי בתיווך פג. זהירות חשובה נוספת היא להשתמש בפתרונות טריים. שינויים קלים בריכוזים של הפתרונות לגרום נזק במידה רבה את protoplasts, מאז הם מאוד רגישים ללחץ אוסמוטי ושבירה.
אנחנו כבר משתמש protoplasts כדי ללמוד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט9,13,14. בהתבסס על מחקרים אלה, היינו יכולים לנתח את המוטיבים רצף של פפטידים מעבר שונים. בנוסף, השתמשנו protoplasts כדי לזהות את האותות מיקוד (האזור הטעון חיובית איגוף את קצה קרבוקסילי של התחום transmembrane) של חלבונים ממוקד קרום המעטפה החיצונית של כלורופלסט15. באופן דומה, השתמשנו protoplasts לחקור חלבונים לייבא לתוך המיטוכונדריה10. שוב, הצלחנו לזהות מוטיבים רבים רצף קריטי ב presequences של חלבונים מיטוכונדריאלי. בנוסף, החלבונים הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה מכילים גם אזור הטעון חיובית איגוף התחום transmembrane שלהם האות מיקוד15. אותות אלה מיקוד לשתף מידה רבה של דמיון בהרכב חומצות אמיניות. אכן, כלורופלסט חלבונים היו mistargeted את המיטוכונדריה במהלך במבחנה ייבוא ניסויים16. עם זאת, כלורופלסט, חלבונים מיטוכונדריאלי מיובאים במיוחד לתוך היעד שלהם, organelles vivo בתוך. לפיכך, protoplasts יכול לשמש כדי להבהיר את המנגנונים שבבסיס איך מיקוד ירידה לפרטים נקבעת בין מהכלורופלסט המיטוכונדריה.
Protoplasts לייצג מערכת אידיאלית לניתוח הייבוא של חלבונים לתוך מהכלורופלסט ויוו. עם זאת, קודם היא protoplasts עשויים להיות בתנאים הלחץ חזק כגון ופצע הלחץ. לפיכך, לא נוכל לשלול את האפשרות כי מתח כזה עלול להשפיע על תהליך הייבוא. לכן, במקרים מסוימים, התוצאות יש לפרש בזהירות כאשר protoplasts משמשים לניסויים ייבוא חלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו בוצע עם תומך של הקואופרטיב תוכנית מחקר מדעי החקלאות ופיתוח טכנולוגיה (פרויקט מס ' PJ010953012018), ניהול פיתוח כפרי, המענק קרן מחקר לאומי (קוריאה) ממומן על ידי משרד המדע ICT (מספר 2016R1E1A1A02922014), הרפובליקה של קוריאה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
- Li, H. M., Chiu, C. C.
- Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
- Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
- Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
- Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
- Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
- Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
- Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
- Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
- Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
- Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
- Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).
