Summary
Здесь мы описываем протокол выразить белков в протопласта, используя метод PEG-опосредованной преобразования. Этот метод обеспечивает простой выражение протеинов интереса, и эффективное расследование локализация протеина и процесс импорта для различных экспериментальных условий в vivo.
Abstract
Хлоропластов является важным органелл, который отвечает за различные клеточные процессы в растениях, таких как фотосинтез и производство многих вторичных метаболитов и липиды. Хлоропласты требуют большое количество белков для этих различных физиологических процессов. Более 95% белков хлоропласта ядро кодировке и импортированы в хлоропластах от цитозоль после перевода на цитозольной рибосом. Таким образом правильного импорта или ориентации этих белков ядро кодировке хлоропластов в хлоропластах имеет важное значение для надлежащего функционирования хлоропластов, а также растительной клетки. Ядро кодировке хлоропласта протеины содержат сигнальные последовательности для конкретной ориентации в хлоропластах. Молекулярные машины, локализованные в хлоропласте или цитозоль признать эти сигналы и выполнения процесса импорта. Для изучения механизмов импорта белка или ориентации хлоропластов в естественных условиях, мы разработали быстрого, эффективного метода, основанного на протопластов, для анализа белка импорта в хлоропластах арабидопсиса. В этом методе мы используем протопласта, изолированных от листовой ткани Arabidopsis. Здесь мы предоставляем подробный протокол для использования протопласта исследовать механизм, по которому белки импортируются в хлоропластах.
Introduction
Хлоропластов является одним из наиболее важных органеллы в растениях. Одна из основных функций хлоропласты — осуществлять фотосинтез1. Хлоропласты осуществляют также многих других биохимических реакций для производства жирных кислот, аминокислот, нуклеотидов и многочисленные вторичные метаболиты1,2. Для всех этих реакций хлоропласты требуют большое количество различных типов белков. Однако хлоропласта геном содержит только около 100 генов3,4. Таким образом хлоропласты необходимо импортировать большинство их белков из цитозоль. В самом деле большинство белков хлоропласта были продемонстрированы быть импортированы из цитозоль после перевода4,5,6. Клетки растений требуют конкретных механизмов для импорта белки из цитозоль в хлоропластах. Однако хотя эти механизмы импорта белка были изучены в течение последних нескольких десятилетий, мы до сих пор не полностью понимаем их на молекулярном уровне. Здесь мы предоставляем подробный метод для подготовки протопласта и экзогенно выражая генов в протопласта. Этот метод может быть ценным для выяснения молекулярные механизмы лежащие в основе белка импорта в хлоропластах в деталях.
Белка импорта могут быть изучены с использованием многих различных подходов. Один из этих методов включает в себя использование в vitro белка импорта7,системы8. Используя этот подход, в пробирке-перевод белка прекурсоров инкубируют с очищенной хлоропластов в пробирке, и белка импорта анализируемой SDS-PAGE, а затем Западный анализ помаркой. Преимуществом этого подхода является, что может подробно каждый шаг белка импорта в хлоропластах. Таким образом этот метод широко используется для определения компонентов молекулярного механизма импорта белка и анализировать сведения о последовательности для транзита пептидов. Совсем недавно был разработан еще один подход с использованием протопласта из листьев тканей, и он стал широко используется для изучения белков импорта в хлоропластах9,10. Преимуществом этого подхода является, что протопласта обеспечивают клеточной среды, которая ближе к нетронутым клеток, чем система, в пробирке . Таким образом система протопластов позволяет нам решать многие дополнительные аспекты этого процесса, например связанные события цитозольной и как определяется специфика ориентации сигналов. Здесь мы представляем подробный протокол для использования протопласта для изучения белков импорта в хлоропластах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. рост растения арабидопсис
- Подготовка 1 Л Gamborg B5 (B5) среднего, добавив 3.2 g B5 среды включая витамины, 20 г сахарозы, 0,5 г этана 2-(N-morpholino) сульфоновой кислоты (MES) до приблизительно 800 мл деионизированной воды и скорректировать рН до 5,7 с гидроксидом калия (KOH). Добавить больше деионизированной воды довести общий объем до 1 л добавить 8 g phytoagar и автоклав для 15 мин при температуре 121 ° C.
- Разрешить средне-и охладить до 55 ° C и налить в чашку Петри (9 см в диаметре, 1,5 см в высоту) на лавочке чистой 20-25 мл среды, B5. Сухой плиты 2-3 дней, упаковать их чистой пленкой и держать их в холодильник до использования.
- Стерилизовать Arabidopsis thaliana семена с 1 мл 70% (v/v) этанола в пластиковых пробирок (e труба), постоянно встряхивая на 2 – 3 мин удалить супернатант, добавить 1 мл раствора гипохлорита натрия 1% (v/v) и поколебать непрерывно в течение 2-3 мин подготовить 100 – 150 семян на Петри блюдо.
- Снять supernatants и смыть семена с 1 мл дистиллированной воды. Повторите этот шаг 4 x. Место стерилизации семян на 4 ° C для 3 дней, чтобы синхронизировать прорастания семян.
- Сеять семена 100 – 150 на B5 пластин с помощью микропипеткой и прокладкой тарелку с хирургическая лента.
- Растут растения в комнате роста с циклом 16/8 ч свет/темно на 100 µmol·m-2·s-1 интенсивности света, 70% относительной влажности и температуре 20 ° C в течение 2 недель.
2. Подготовка плазмида
Примечание: Высокой чистоты плазмид должно использоваться для преобразования; рекомендуется использовать набор для очистки коммерческих плазмиды.
- Очистить плазмида (БС-nt:GFP) с использованием комплекта изоляции ДНК. Для концентрации ДНК, выполняют этанола осадков в 1,5 мл трубку и растворяют гранулы ДНК в 100 мкл дистиллированной воды. Определить концентрацию плазмида с помощью спектрофотометром в 260 Нм. Разбавить плазмида до конечной концентрации ~ 2 мкг / мкл. Держите плазмида при-20 ° C до использования.
3. изоляции протопласта
- Подготовьте следующие решения.
- Приготовляют раствор фермент содержит macerozyme 0,25% (w/v), 1,0% (w/v) целлюлаза, 400 мм D-маннит, хлорид кальция 8 мм (2CaCl), 0,1% (w/v), бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 5 мм МЧС. Отрегулируйте пэ-аш до 5.6 с Кох.
- Фильтр фермента решения с помощью ацетат целлюлозы фильтр с размером пор 0,45 мкм. Аликвота 25 мл раствора фермента в 50 мл конические трубы и держать при температуре-20 ° C. Оттепель фермента решение при комнатной температуре (RT) и перемешать хорошо непосредственно перед использованием.
- Приготовляют раствор сахарозы 21% (w/v), растворяя 21 г сахарозы в 100 мл деионизированной воды и автоклав решение.
- Готовят раствор W5 содержат 154 мм хлорид натрия (NaCl), 125 мм CaCl2, 5 мм хлористый калий (KCl), 5 мм глюкозы и 1,5 мм МЧС. Отрегулируйте пэ-аш до 5.6 с Кох и автоклав решение.
- Приготовляют раствор MaMg содержит 400 мм D-маннит, хлорид магния 15 мм (MgCl2) и 5 мм МЧС. Отрегулируйте пэ-аш до 5.6 с Кох и автоклав решение.
- Подготовка 1 M D-маннит и 1 M нитрат кальция акций решения, чтобы сделать PEG решение. Автоклав эти решения.
- Приготовляют раствор фермент содержит macerozyme 0,25% (w/v), 1,0% (w/v) целлюлаза, 400 мм D-маннит, хлорид кальция 8 мм (2CaCl), 0,1% (w/v), бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 5 мм МЧС. Отрегулируйте пэ-аш до 5.6 с Кох.
- Урожай нетронутыми листьев тканей от 2 недель старый растений от ~ 1 – 2 B5 пластины с помощью хирургического ножа и место собранные листья в 50 мл конические пробки содержащих 25 мл раствора фермента. Место Конические трубки, содержащие фермент решения и листьев ткани горизонтально на роторный шейкер с нежным агитации в темноте. Он занимает 8-12 h для полного переваривания тканей листа.
- В 8-12 ч после инкубации Залейте раствор фермента (содержащие протопласта освобожден из тканей листа) в свежих Петри через сетку с размером пор 140 мкм. Тщательно слой протопластов содержащих фермент решение на вершине 15 мл раствора сахарозы 21% (w/v) и центрифуги на 98 g x 10 мин с самых низких настройках ускорения и замедления в ротор размахивая ведро.
- С помощью пипетки Пастера, тщательно передать протопласта от самый верхний слой (фермент раствор) и на уровне интерфейса между фермента раствора и раствора сахарозы конические Тюбик 50 мл, содержащие 30 мл раствора W5. Центрифуга для этой трубки на 51 x g за 6 мин. На данном этапе протопласта будет в Пелле в нижней части Конические трубки.
- Выбросите супернатанта, тщательно с использованием пипетки не нарушая протопласта Пелле. Добавить 25 мл раствора W5 и нежно ресуспензируйте протопласта. Инкубируйте протопластов раствор в холодильнике 4 ° C для по крайней мере 1 час для стабилизации.
4. протопластов преобразование с помощью полиэтиленгликоля
- Подготовить 40% PEG решение путем добавления 4 g PEG 8000, 4 мл раствора маннитола 1 М, 1 мл 1 М Ca (№3)2и 1,8 мл дистиллированной воды в 50 мл Конические трубки и хорошо перемешать. Распустить PEG нагрев в микроволновой печи на 20 – 30 с. место 40% раствора ПЭГ на RT для охлаждения.
Примечание: 40%, PEG решение должны быть подготовлены свежезаваренным каждый раз. Если протопласта не являются полностью гранулированных во время инкубации 4 ° C в холодильнике, центрифуга материал на 46 x g на 2 мин. - Удалить супернатант тщательно, но полностью и MaMg решение добавить протопластов Пелле приносить концентрации 5 x 10-6/мл.
Примечание: Количество протопластов может определяться Горяева рассматривать под микроскопом. - Место 10 мкг плазмидной ДНК каждой пустой 13 мл раунд дно трубки и 300 мкл протопластов решения с помощью пипетки.
Примечание: В конце кончика пипетки должны быть отрезаны. Всякий раз, когда отбираются протопласта, протопластов содержащих раствор следует высокомобильна прямо перед закупорить так что такое же количество протопласта добавляется к каждой трубе. - Смешать плазмидной ДНК с протопласта, осторожно поворачивая трубы и сразу 300 мкл 40% PEG решение с помощью пипетки. Смешайте нежно, но полностью вращающейся трубы и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре; наклона трубки почти горизонтально и повернуть ее несколько раз.
- Добавить 1 мл раствора W5 и смешайте нежно но полностью, повернув трубу вручную аналогичным образом. Проинкубируйте образцы для 10 мин при комнатной температуре.
- Повторите этот шаг, в два раза больше с помощью 1,5 мл и 2 мл раствора W5, соответственно. Инкубируйте 30 мин после окончательного сложения W5 решения.
- Центрифуга на 46 x g 4 мин удалить супернатант и добавить 2 мл раствора W5. Смешайте нежно но полностью. Инкубируйте при 22 ° C в темной камере.
5. Анализ импорта белка в хлоропластах
Примечание: После ПЭГ опосредованной преобразования протопласта, время инкубации колеблется от 8 до 24 ч.
-
Микроскопии флуоресцирования
- Место 10 мкл протопластов решения на слайд стакан с помощью пипетки с наконечником, подстриженные и тщательно крышка с coverslip, чтобы избежать повреждения протопласта.
- Место слайда на сцене флуоресценции микроскопа с фильтром возбуждения/выбросов устанавливает для наблюдения за Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) и auto флуоресценции хлорофилла.
- Захват изображения с охлаждением зарядовой (связью ПЗС) камеры и процесс изображения, с помощью редактирования изображений программное обеспечение для создания псевдо-цветных изображений.
-
Общий белок добыча и Immunoblotting
- Подготовьте денатурации буфер, содержащий 2,5% (w/v) лаурилсульфат натрия (SDS) и 2% (v/v) 2-меркаптоэтанол.
Примечание: Белка импорта в хлоропластах могут быть количественно измеряя степень транзитных пептид обработки через immunoblot анализ с использованием антител анти GFP. - Перевести протопластов в пластиковых пробирок и центрифуги на 46 x g на 4 мин.
- Удалить супернатант и 80 мкл буфера денатурации. Энергично Вортекс для 5 s и добавить 5 x буфер образца SDS (250 мм трис-Cl (рН 6,8), 0,5 М DTT, 10% (w/v) SDS, 0,05% (w/v) бромфеноловый синий и 50% (v/v) глицерин). Хорошо перемешать и варить 10 мин.
- Тема этот образец протеина к стандартным SDS-PAGE и immunoblotting с антителами anti-GFP.
- Подготовьте денатурации буфер, содержащий 2,5% (w/v) лаурилсульфат натрия (SDS) и 2% (v/v) 2-меркаптоэтанол.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Импорт белков в хлоропластах может проверяться с помощью двух подходов: флуоресцентной микроскопии и immunoblot анализ после разъединения SDS-страницы опосредованной. Здесь, мы использовали БС-nt:GFP, слияние построить кодирования 79 N-терминальный аминокислотных остатков RbcS, содержащих транзита пептид, сливается с GFP. Когда белки импортируются в хлоропластах, зеленая Флуоресценция сигналы от целевого белка БС-nt:GFP должен слиться с красной флуоресцентной сигналы от auto флуоресценции хлорофилла, как рассмотренные микроскопии флуоресцирования (рис. 1). Тесное совпадение двух сигналов указывает ввоз белка в хлоропластах. Часто GFP сигналы разбросаны по всему хлоропластов или сосредоточены в центре хлоропластов, слабо диффузных сигналов во всем хлоропластов, в зависимости от индивидуальных белков. Импорт белков может быть подтверждено immunoblot анализ с использованием антител GFP. Всего белки из протопластов, разделенных SDS-PAGE, а затем Западный анализ помаркой (рис. 2). В большинстве случаев, две полосы белка должны соблюдаться в immunoblot Если белок был должным образом импортированы в хлоропластах: Верхняя полоса соответствует полнометражного прекурсоров и Нижняя полоса в обработанной форме после импорта в хлоропластах. Количество обработанных формы белка следует увеличить в зависимости от времени. Такие результаты будет означать, что белков эритроцитов-nt:GFP импортируется в хлоропластов в проростках Arabidopsis протопласта. Кроме того соотношение обработанных формы на общую сумму, выраженную белков (переработанном виде плюс прекурсоров) может использоваться как мера эффективности импорта. При необходимости, Хлоропласты могут быть очищены от нежно лизированных протопласта, и белки от фракция хлоропластов может быть проанализирован на Западный blotting для дальнейшего подтверждения импорта белков в хлоропластах.
Рисунок 1. В естественных условиях локализации GFP сливается с пептида транзита эритроцитов в хлоропластах.
Изображения были взяты 18 h после преобразования под флуоресцентным микроскопом. Грин (), красный (b), Объединенный (c) и светлые (d) метки указывают GFP изображения, изображение хлорофилл, объединенное изображение двух сигналов и светлые области изображения, соответственно. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Вестерн-блот анализ эритроцитов-nt:GFP расследовать белка импорта в хлоропластах.
Общий белок экстракты были подготовлены из протопластов и разделены на 10% (w/v) SDS-PAGE, а затем Вестерн-блот анализ с использованием антител анти GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы предоставили подробный протокол для использования протопласта Arabidopsis для изучения белков импорта в хлоропластах. Этот метод является мощным для изучения процесса импорта белка. Этот простой, универсальный метод полезен для изучения нападения на предполагаемых грузов белков в хлоропластах. С помощью этого метода, протопласта готовятся из листовой ткани Arabidopsis11,12 , которая может быть получена из растений на многих стадиях различных роста, начиная от очень рано полностью Зрелые листья. Однако необходимо позаботиться при выращивании растений, используемых для подготовки протопластов. Очень здоровых растений, следует использовать как протопласта, приготовленный из здоровых растений может выдержать много шагов, участвующих в PEG-опосредованной трансформации. Еще один важный предосторожность должна использовать свежие решения. Незначительные изменения в концентрациях растворов может значительно повредить протопласта, так как они являются хрупкими и очень чувствительны к осмотическое давление.
Мы были с использованием протопласта для изучения белков импорта в хлоропластах9,,1314. На основании этих исследований, мы смогли вскрыть последовательность мотивы в различных пептидов транзита. Кроме того, мы использовали протопласта для определения ориентации сигналов (положительно заряженных региона фланговые C-конечная трансмембранных доменов) белков, которые ориентированы на внешний конверт мембраны хлоропластов15. Аналогичным образом мы использовали протопласта расследовать белка импорта в митохондриях10. Опять же мы смогли выявить многие мотивы критического последовательности в presequences митохондриальных протеинов. Кроме того белки наружной мембраной митохондрий содержать положительно заряженный региона фланговые трансмембранных доменов как их нацеленности сигнал15. Эти ориентации сигналы имеют высокую степень сходства в аминокислотный состав. Действительно во время экспериментов в vitro импорта16в митохондрии были mistargeted хлоропластов белков. Однако хлоропластов и митохондриальных протеинов специально импортируются в их целевой органеллы в естественных условиях. Таким образом протопласта может использоваться для уточнения механизмов, лежащих в основе как ориентация специфика определяется между хлоропласты и митохондрии.
Протопласта представляют идеальную систему для анализа импорт белков в хлоропластах в естественных условиях. Однако одно предостережение, что протопласта может быть в условиях сильного стресса например ранив стресс. Таким образом мы не можем исключать возможность, что такое стресс может повлиять на процесс импорта. Таким образом в некоторых случаях, результаты следует интерпретировать с осторожностью когда протопласта используются для импорта экспериментов белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была проведена с поддерживает программы совместных исследований для сельского развития науки и технологий (проект № PJ010953012018), Управление по развитию сельских районов и Грант Национальный исследовательский фонд (Корея), финансируемого министерством науки и ИКТ (№ 2016R1E1A1A02922014), Республика Корея.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
- Li, H. M., Chiu, C. C.
- Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
- Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
- Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
- Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
- Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
- Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
- Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
- Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
- Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
- Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
- Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).
