Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58448
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Cellular and Integrative Physiology, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Anesthesiology, University of Nebraska Medical Center

Summary

המטרה הכוללת של מאמר זה היא כדי לתקנן את הפרוטוקול עבור בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב (CSCs) מהלב העכבר למבוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות לבודד CSCs מאתר ושיטות הארוטיות תרבות CSC, התפשטות של בידול לתוך cardiomyocytes.

Abstract

אוטם שריר הלב (MI) הוא גורם התחלואה והתמותה ברחבי העולם. יעד מרכזי של רפואה רגנרטיבית היא לחדש את שריר הלב מת לאחר MI. למרות מספר אסטרטגיות שימשו להתחדש שריר הלב, טיפול בתאי גזע נשאר בגישה הגדולות כדי לחדש את שריר הלב מת הלב MI. לצבירת ראיות מצביע על הנוכחות של תאי גזע לב תושב (CSCs) בלב למבוגרים, ההשפעות שלהם אנדוקרינית ו/או paracrine על התחדשות לב. עם זאת, בידוד CSC, שלהם אפיון ובידול לכיוון תאי שריר הלב, במיוחד cardiomyocytes, נותר אתגר טכני. במחקר הנוכחי, סיפקנו שיטה פשוטה עבור בידוד, אפיון, הבידול של CSCs מהלב העכבר למבוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה הדרגתי של צפיפות בידודו של CSCs, היכן הלב הוא מתעכל על ידי פתרון II collagenase 0.2%. כדי לאפיין את CSCs מבודדים, הערכנו את הביטוי של סמנים CSCs/לב Sca-1, NKX2-5 ו- GATA4, סמנים pluripotency/stemness OCT4, SOX2 ו- Nanog. אנחנו גם לקבוע את הפוטנציאל התפשטות של CSCs מבודדים על ידי culturing אותם בצלחת פטרי והערכה הביטוי של דה מרקר התפשטות Ki-67. להערכת פוטנציאל התמיינות של CSCs, בחרנו CSCs שבע עד עשר דקות ימים תרבותי. נוכל להעביר אותם צלחת חדשה עם מדיום בידול cardiomyocyte. הם מודגרת ב חממה תרבות התא במשך 12 יום, ואילו המדיום בידול משתנה כל שלושה ימים. CSCs הבדיל אקספרס סמנים ייחודיים cardiomyocyte: actinin, טרופונין אני. לפיכך, CSCs מבודדים עם פרוטוקול זה יש stemness וסמנים לב, שיש להם פוטנציאל התפשטות ובידול לכיוון השושלת cardiomyocyte.

Introduction

מחלת לב איסכמית, כולל אוטם שריר הלב (MI), היא הגורם העיקרי למוות ברחבי העולם1. טיפול בתאי גזע, ולשם רגנרציה שריר הלב מת נשאר בגישה הגדולות כדי לשפר את תפקוד הלב MI הלב2,3,4,5. סוגים שונים של תאי גזע שימשו כדי לחדש את שריר הלב מת וכדי לשפר את תפקוד הלב הלב MI. הם יכולים להיות בהרחבה מחולקת6 תאי גזע עובריים ותאי גזע למבוגרים. בתאי גזע בוגרים, סוגים שונים של תאי גזע היו בשימוש, כמו7,תאי תאי מח עצם-derived8, גזע mesenchymal שמקורם במח העצם9,10, רקמת שומן 11,12, ואת הטבור13ו-14,CSCs15. תאי גזע יכולים לקדם התחדשות לב עד אנדוקרינית ו/או paracrine פעולות16,17,18,19,20. עם זאת, מגבלה עיקרית של טיפול בתאי גזע הוא קבלת מספר תאי גזע יכולים להתרבות ו/או להבדיל לכיוון ספציפי השושלת לב21,22. השתלת עצמיים, allogenic של תאי גזע הוא אתגר חשוב טיפול בתאי גזע9. CSCs יכול להיות שיטה טובה יותר עבור התחדשות לב כי הם נגזרים מתוך הלב, הם יכול להיות בקלות רבה יותר מובחן שושלות לב מאשר בתאי גזע ללא דום לב. לכן, זה מקטין את הסיכון של טרטומה. בנוסף, ההשפעות האנדוקריניות, paracrine של CSCs, כגון exosomes ו- miRNAs נגזר על CSCs, יכול להיות יעיל יותר מאשר סוגים אחרים של תאי גזע. לפיכך, CSCs נשאר אפשרות טובה יותר עבור התחדשות לב23,24.

למרות CSCs מועמד טוב יותר עבור התחדשות לב ליבה MI בשל מוצאם הלב, מגבלה עיקרית עם CSCs הוא פחות תשואה בגלל חוסר של שיטת בידוד יעיל. מגבלה נוספת יכולה להיות הבידול לקוי של CSCs כלפי cardiomyocytes שושלת היוחסין2,25,26,27. כדי לעקוף את המגבלות האלה, חשוב לפתח פרוטוקול יעיל בידוד CSC, אפיון של בידול לכיוון הלב השושלת. אין סמן מקובל יחיד עבור CSCs, ספציפי תא-פני המבוסס על סמן בידוד של CSCs מניב פחות CSCs. כאן, אנחנו לתקנן בגישה פשוטה צנטריפוגה מעבר צבע כדי לבודד CSCs מהלב העכבר זה היא חסכונית ותוצאות תשואה מוגברת של CSCs. CSCs מבודדים אלה ניתן לבחור עבור סמני משטח תאים ספציפיים על-ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית לקצר. בנוסף CSCs בידוד, סיפקנו פרוטוקול תרבות CSC, אפיון של בידול כלפי השושלת cardiomyocyte. לפיכך, אנו מציגים שיטה אלגנטית כדי לבודד, לאפיין, תרבות, להבדיל CSCs העכבר למבוגרים לבבות (איור 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דיור, הרדמה, ושל הקרבה של עכברים בוצעו בעקבות הפרוטוקול IACUC המאושרים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה.

1. חומרים

  1. שחור C57BL/6J לשימוש 10 - עד השבוע ה-12, עכברים זכרים, כל הזמן ללא צורך במיקור חוץ במתקן בעל חיים מוסדיים, עבור בידודו של CSCs. CSCs יכול גם להיות מבודד עכברים אישה שאינה בהריון.
  2. לעקר את כל הדרוש מכשירי הניתוח, לרבות מספריים כירורגיים, מספריים כירורגיים בסדר, shank מעוקל מלקחיים להב כירורגי, על ידי autoclaving לפני המתת החסד של העכבר.
  3. להכין CSC מאגרי בידוד במצב סטיריליים ואחסן אותם ב 4 ° C על קרח. מאגרים אלה כוללים polysucrose, סודיום diatrizoate פתרון מותאם צפיפות של 1.077 g/mL, של Dulbecco לא שלם שונה בינוני של הנשר, 1 x של מאוזנת תמיסת מלח (HBSS), ונקניק תא תרבות כיתה 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). להכין 1% collagenase II מניות פתרון (מסונן, עיקור) הפתרון עובד 0.2% ב- HBSS.
  4. שומרים שהחומרים תרביות רקמה במצב מעוקר ב אבטחה הקבינט, כולל צלחת פטרי 10 מ מ, צלחת 6-ובכן, צלחת 24-ובכן, T-25, T-75 תרבות מבחנות, צינורות חרוט 15-mL ו- 50-mL פיפטות סרולוגית חד פעמיות עם 40-מיקרומטר ו- 100 -strainers תא מיקרומטר עם מסננים 0.22-מיקרומטר.
  5. לחטא את 10-µL, 200-µL ועצות 1,000-µL פיפטה על ידי תא לחץ.
  6. להשתמש ללא אבקת nitrile כפפות ו-70% אתנול כדי לשמור על מצב סטרילי לאורך כל הניסוי.
  7. משתמשת במלבין 10% כמו חיטוי.
  8. השתמש זמינים מסחרית CSC תחזוקה בינונית, cardiomyocytes בידול בינוני על התרבות ועל הבידול של CSCs, בהתאמה.

2. שיטת בידוד תאי גזע לב

  1. המתת חסד גבר בוגר ארבעה עד חמישה (או אישה שאינה בהריון) עכברים באמצעות תא2 CO. לתקן הזרועות של העכבר בכל על קרטון ניתוח נפרד עם סיכות או קלטות דביק.
  2. תרסיס אתנול 70% על העכבר להיפטר מחיידקים חיצוניים ולשמור על התנאי סטיריליים במהלך קציר של הלב. אעשה חתך עם מספריים באמצע הבטן וחותכים את העור מן הבטן אל החזה בקו ישר. מסירים את העור משני צידי החתך האמצעי כדי לנקות את אזור הבטן של העור, שערות. באמצעות פינצטה ומספריים, חותכים את הסרעפת מתחת קשת הצלעות.
  3. פתח את חלל בית החזה של העכבר על ידי חיתוך קשת הצלעות בתוך המנוע. לחשוף את הלב ולהסיר את הדם ליד הלב. יש לשטוף את האזור שסביב הלב עם קרה כקרח PBS להיפטר דם באזור הלב.
  4. לנתח את הלב באמצעות מספריים כירורגיים פינצטה. מקום בלב בצלוחית 100-מ מ המכיל 10 מ"ל של PBS קר כקרח.
  5. Palpitate הלב באמצעות מלקחיים shank מעוקל ולהסיר את שאריות הדם בתוך הלב.
  6. להשתמש בלב שלם ניתוקה של CSCs.
  7. העברת כל ארבע או חמש לבבות כל צינור חרוטי 50-mL המכיל 10 מ"ל של HBSS קר כקרח. לשמור את הצינורית על הקרח עד עיבוד נוסף.
  8. נגב האחורה של אבטחה הקבינט עם-70% אתנול ליצירת סביבה מעוקר. לעקר את הצינור המכיל הלב וחומרים נדרשים אחרים עם 70% אתנול. למקם את הצינור המכיל הלב אבטחה הקבינט עיבוד נוסף.
  9. להעביר את הלבבות צלחת פטרי 100-מ מ המכיל 10 מ"ל של HBSS קר כקרח. לשטוף את הלבבות שוב על-ידי palpating כדי להסיר שאריות דם בתוך הלב. לשנות את הפתרון HBSS לשטוף אחרי זה כדי להבטיח הסרה מלאה של הדם.
  10. חותכים את הלבבות לחתיכות קטנות בעזרת מספריים כירורגיים בסדר או סכין כירורגית בצלוחית 100-מ מ המכיל 5-7 מ של פתרון HBSS. להחזיק כל לב עם זוג מלקחיים ולהשתמש זוג מספריים כירורגיים בסדר או סכין כירורגית כדי לחתוך את הלב לחתיכות 2 כדי 4-מ מ. לשנות את הפתרון HBSS בתדירות גבוהה כדי להבטיח HBSS ודוחף. מינצ הלבבות בפתרון HBSS.
  11. Centrifuge הרקמה טחון ב 500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע ולשמור בגדר.
  12. Resuspend בגדר ב- 5-6 מ"ל של 0.2% collagenase II פתרון צינור חרוטי 50-mL. עוצמת הקול של collagenase פתרון צריך להיות כמעט 1.5 - ל שתיים פי לנפח של בגדר.
    הערה: למערכת העיכול של רקמות, collagenase 0.2% ו- 2.5 U/mL dispase פתרון יכול להחליף 0.2% collagenase II. השתמש אמצעי כמעט שווה לפתרון dispase collagenase לי פתרון.
  13. ביסודיות מערבבים בגדר 0.2% collagenase II פתרון על-ידי לזעזע את הצינורית או נדנדה את הצינורית על מטרף ב 75 x g למשך 45-60 דקות ב 37 º C. לנער את הצינור נמרצות על ידי היד לאחר כל 20-30 דקות כדי לשפר את פירוק.
  14. Triturate את המיקס רקמת lysed באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ ל, עצה 1-mL פיפטה מביצועם הגוש רקמה לתוך התליה תא בודד.
    הערה: כדי להשיג התאוששות מקסימלית של CSCs, triturate את המיקס פירוק לפחות 5 דקות. אם הרקמה הגושים הם יחסית גדול, חותכים את קצה טיפ 1-mL פיפטה עם מספריים או סכין כירורגית ולהשתמש בו עבור trituration.
  15. לעצור את פירוק אנזימטי של הרקמה על ידי הוספת זמינים מסחרית CSC תחזוקה בינוני. הוסף כמעט 2-3 x בינוני תחזוקה כמה שיותר נפח הרקמה lysed בשלב 2.14.
  16. עוברים התליה תא מתעכל מסננת תא 100-מיקרומטר כדי להסיר את כל חתיכות רקמה מעוכל.
  17. חזור על שלב 2.16 באמצעות מסננת תא 40-מיקרומטר.
  18. להפריד את התאים באמצעות צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות. לצורך הקמת מכשול ההפרדה של תאים, בעדינות כיסוי של נפח שווה פילטרט של מעל polysucrose, סודיום diatrizoate פתרון. לדוגמה, הוסף תחילה, 20 מ של פתרון diatrizoate polysucrose ו נתרן בצינור חרוט 50-mL ולאחר מכן, להוסיף 20 מ של פילטרט של מהשלב 2.17 על הפתרון diatrizoate polysucrose, נתרן.
    הערה: Prewarm polysucrose ופתרון diatrizoate נתרן ב 37 מעלות צלזיוס לפני להשתמש עם התאים. הוסף את פילטרט של שלב 2.17 על הפתרון diatrizoate polysucrose, נתרן מאוד לאט ובזהירות כדי למנוע כל ערבוב של שני הפתרונות. זה נחשב צעד מכריע.
  19. Centrifuge את הצינור המכיל שני פתרונות ב x 500 g למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות צנטריפוגה דלי הנדנדה. להגדיר לצנטריפוגה במהירות האצה והאטה נמוך יותר כדי למנוע ערבוב של שני פתרונות עבור הפרדה נכונה CSCs. זהו שלב חשוב בבידוד CSC. לשים את הצינור המכיל את התערובת הדרגתיות לאט מאוד ללא הפרעה בתוך לצנטריפוגה ולהגדיר אותו עבור צנטריפוגה.
  20. . תוציא את המעיל באפי יחד עם פתרון נוסף מהשכבה העליונה באמצעות פיפטה 1-mL או פיפטה פסטר פלסטיק צינור סטיריליים 15-mL שכבה זו באפי יכיל את CSCs.
    הערה: יזהרו במהלך pipetting של מעיל באפי לא להוציא השכבה פתרון diatrizoate polysucrose ו נתרן כי זה רעיל CSCs.
  21. להוסיף אמצעי שווה של CSC תחזוקה בינוני התליה תא מהשלב 2.20 ומערבבים אותו כראוי כדי לנטרל משקעי polysucrose של נתרן diatrizoate פתרון, אם קיים.
  22. Centrifuge התליה תא לעיל ב x 500 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
  23. Resuspend בגדר ב 7-10 מ"ל של מדיום DMEM לא שלם, centrifuge זה ב 500 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להיפטר כל שיורית polysucrose, סודיום diatrizoate פתרון.
  24. לאסוף את צניפה, אשר מכיל את CSCs מטוהרים.
  25. Resuspend בגדר ב 1 מ"ל של CSC תחזוקה בינוני, לספור את מספר CSC, ולהשתמש בגדר של תרבות. כדי לספור את מספר CSC, השתמש Trypan blue מכתים של hemocytometer. עם ארבעה לבבות עכברים זכרים, התשואה של CSCs הוא ~1.8 מיליון.
  26. זרע CSCs בצלחת 6-ובכן תרבות מצופה פתרון ג'לטין 0.02% המכיל fibronectin 0.5%. השתמש 2 מ של תחזוקה מלאה בינוני זריעה. דגירה לצלחת תרבות בתוך אינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2.
  27. החלף את המדיום של תרבות CSCs מלאה CSC תחזוקה בינוני כל יום עד היום השלישי. לאחר מכן, לשנות את המדיום לסירוגין.
  28. לקבוע את הצמיחה של CSCs על ידי התבוננות אותם תחת מיקרוסקופ.

3. תרבות מעבר של תאי גזע לב ותחזוקה

  1. תרבות CSCs מבודדים במדיום אחזקה זמינים מסחרית. החלף המדיום תרבות טריים תחזוקה בינוני לסירוגין. כאשר התרבות CSC הגיעה confluency, להעביר את CSCs צלחת חדשה מצופה עם הג'לטין ואת fibronectin, כפי שהוזכר בשלב 2.26. לנתק את CSCs בתרבית על-ידי מאגר דיסוציאציה תא אנזימטיות. בצע הפרוטוקול הסטנדרטי של דיסוציאציה התא לצלחת תרבות. בשלב זה, CSCs נחשבים-מעבר שלב 0 (P0).
  2. תרבות CSCs P0 בג'לטין חדש וצלחת מצופים fibronectin במדיום תחזוקה CSC מלאה ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5%, מאפשרים להם להיות confluent ולאחר מכן בצע צעד 3.1 להיכנס מעבר 1 (P1) CSCs. חנות P1 CSCs חנקן נוזלי או להשתמש בהם עבור החוויה הקצאות.
  3. זרע 0.5 מיליון תאים צלחת. ובכן 6 או 1 מיליון תאים T-25 כדי לשמור על התרבות CSC בשלב הראשוני שלה.
  4. המעבר CSCs כאשר הם הופכים confluent 85%-90%. CSCs יכול להיות מחונן במדיום תחזוקה ועד ארבעה עד שישה שבועות
    הערה: לשמור על צפיפות זריעה הראשונית של CSCs גבוה יחסית (40% - 50%), כי בזריעה צפיפות נמוכה יותר, CSCs עשויות להשתנות המורפולוגיה שלהם שטוח וארוך.

4. אפיון של תאי גזע לב

  1. כדי לאפיין את CSCs בתרבית, לצפות בהם תחת ניגוד phage או מיקרוסקופ שדה בהיר. מניחים את הצלחת המכילות CSC על המטרה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הגדר את רמת ההגדלה נמוך למדי (10 X) כדי למקד את התאים. השתמש שלב חדות צמצם כדי לבחון את התאים. העלאת מידת ההגדלה ל- 20 X על-ידי שינוי העדשה המטרה תמונה CSCs. גידול המטרה 40 X, תמונה של CSCs. בעוד יומיים, CSCs מופיעים כמעט עגול צורה, אבל הגודל של התא גדל עם הזמן, בשבעה ימים, CSCs מופיעים כמעט גלילי במצב (איור 1 א' - ג' 1).
  2. לבצע immunostaining של CSCs עם סמנים של pluripotency/stemness (OCT4, SOX2 או Nanog), התפשטות (Ki-67) (איור 2 א - 2D), הלב מוצא/ובתאים (Sca-1, NKX2-5 או GATA4) (איור 3 א - 3 C).
    1. עבור, immunostaining של CSCs הזרעים CSCs 10,000 לתוך צלחת 24-ובכן תרבות.
    2. למחרת (אחרי ה' 18-24), לתקן את CSCs µL 300 של 4% paraformaldehyde למשך 10 דקות.
    3. לשטוף את CSCs עם µL 500 ל- PBS קר כקרח, 3 x עם מרווחי 5-מין.
    4. Permeabilize את CSCs עם µL 300 של 0.2% טריטון X-100 מדולל ב- PBS למשך 10 דקות.
    5. לשטוף את CSCs עם µL 500 ל- PBS קר כקרח, 3 x עם מרווחי 5-מין.
    6. לבצע חסימת CSCs עם µL 300 של BSA 1% מעורבבת עם PBST (PBS + 0.1% Tween 20) או µL 300 של נסיוב עוף רגיל 10% מעורבבת עם PBST לשעה.
    7. דגירה של CSCs ב µL 200 של נוגדן ראשוני מעורבבת עם חסימת פתרון בן לילה ב 4 º C. לדלל נוגדן ראשוני כמומלץ על ידי גליון הנתונים של נוגדנים או לפי התקינה.
    8. לשטוף את CSCs עם µL 500 ל- PBS קר כקרח, 3 x עם מרווחי 5-מין.
    9. דגירה של CSCs ב µL 200 של נוגדנים משניים מעורבבת עם חסימת פתרון (ראה שלב 4.2.6) לשעה בטמפרטורת החדר. לדלל הנוגדן משני כמומלץ על ידי גליון הנתונים של נוגדנים או לפי התקינה.
    10. לשטוף את CSCs עם µL 500 ל- PBS קר כקרח, 3 x עם מרווחי 5-מין.
    11. Counterstain את CSCs עם µL 200 של דאפי (1 µg/mL) מדולל ב- PBS במשך 5 דקות.
    12. לשטוף את CSCs 1 x עם µL 500 ל- PBS קר כקרח. לאחר מכן, מוסיפים 300 µL ל- PBS קר כקרח מכל קידוח.
    13. לבצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ זריחה. בצע את ההוראות של פלורסנט הדמיה, כגון להימנע אור ישיר על הצלחת. לקחת את הצלחת תרבות מתחת למיקרוסקופ. מקדו את התאים בהגדלות שונות. לבחון את התאים תחת שלב ניגוד ו/או מסננים שונים עירור ולשמור את התמונות.
    14. לאחסן את הצלחת בחושך ב 4 º C.

5. התמיינות של תאי גזע הלב לתוך Cardiomyocyte

  1. עבור הבידול של CSCs, זרע 500,000 CSCs בצלחת 6-ובכן עם 2 מ של prewarm (37 מעלות צלזיוס) זמינים מסחרית CSC תחזוקה בינוני.
  2. דגירה לצלחת המכילה את CSCs ב חממה2 CO ב 37 º C. אפשר את CSCs לצרף להתרבות עד צמיחה תת confluent. אם המדיום לצהוב, להחליף המדיום תרבות טריים תחזוקה בינונית.
  3. ב- 85% - 90% confluency, להחליף את המדיום תחזוקה 2 מ של prewarm (37 מעלות צלזיוס) cardiomyocytes בידול בינוני. דגירה על צלחת חממה2 CO ב 37 ° C עד 2-3 שבועות.
  4. לשנות את המדיום בידול ד כל 2-3 להתבונן המורפולוגיה של CSCs תחת מיקרוסקופ בכל פעם במהלך המדיום לשנות על מנת להבטיח את התנאים תרבות טובה.
  5. לאחר 12 d של CSC תרבות במדיום בידול, התמונה CSCs עבור סמני בידול בעקבות immunostaining סטנדרטי של פרוטוקול (ראה שלבים 4.2.1 - 4.2.14). שמור את התמונות פלורסנט עבור הביטוי של סמנים cardiomyocytes (איור 4A - 4B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במחקר הנוכחי, אנחנו מבודדים CSCs מ- 10 עד 12-בת C57BL/6J עכברים זכרים לבבות. . הנה, הוצגו שיטה פשוטה עבור CSC בידוד ואפיון באמצעות סמנים של pluripotency. אנחנו גם הציג שיטה אלגנטי עבור בידול CSC, אפיון CSCs זה הבדיל לכיוון cardiomyocytes השושלת. הבחנו מורפולוגיה צורת פלך של 2 עד 3-ימים-תרבותי CSCs במיקרוסקופ ניגוד שלב (איור 1A ו 1B). מצאנו את שינוי המבנה של CSCs ב 7 ימים של תרבות תחזוקה בינוני, אשר במהלכו הופכים תאי גזע מאורך (איור 1C). אנחנו מאופיין CSCs עבור סמנים של pluripotency ומצא שהן מבטאות OCT4, SOX2 ו- Nanog (איור 2 א - ג 2). מצאנו גם כי CSCs להתרבות במדיום תרבות ולבטא את דה מרקר התפשטות Ki-67 (איור דו-ממדי). כדי לאפיין את מקור לבבי CSCs, קבענו את הביטוי של סמני לב Sca-1, NKX2-5 ו GATA4 ב CSCs. מצאנו ביטוי של הלב סמני CSCs בתרבית (איור 3 א - 3 C). כדי לקבוע את הבידול של CSCs כלפי השושלת cardiomyocyte, אנחנו תרבותי CSCs cardiomyocyte בידול בינוני 12 ימים. לאחר 12 ימים, אנחנו עם תמונה של CSCs הבדיל כדי להפוך את cardiomyocyte סמנים actinin טרופונין אני. הבחנו כי סמנים cardiomyocyte שבאו לידי ביטוי ב- CSCs הבדיל (איור 4A - 4B). באופן כללי, תוצאות אלו מדגימים בהצלחה אנחנו מבודדים CSCs מהלב עכבר, כי אלה CSCs יכול להתרבות, להבדיל לכיוון cardiomyocytes השושלת.

Figure 1
איור 1: מורפולוגיה של CSCs בתרבית. לוחות אלה להראות ניגוד שלב הדמיה של CSCs בתרבית, כלומר נציג CSCs לאחר 2 ימי culturing ב תחזוקה בינוני-(A1) 20 X ויעדים (A2) 40 X, נציג CSCs אחרי 3 ימים של culturing תחזוקה בינוני ב ( B1) 20 X מטרות (B2) 40 X ו נציג CSCs לאחר 7 ימים של culturing ב תחזוקה בינוני-(C1) 20 X ויעדים (C2) 40 X. בפסי בקנה מידה הם 100 מיקרומטר עבור הגדלה X 40 µm 200 עבור הגדלה X 20.

Figure 2
איור 2: אפיון של CSCs עבור סמני pluripotency. לוחות אלה מראים פלורסצנטיות נציג הדמיה של CSCs בתרבית של סמני של pluripotency (OCT4, SOX2 ו Nanog) והתפשטות (Ki-67). פאנלים א' תראה ביטויים של OCT4 (ירוק), דאפי (כחול) CSCs-(A1) 20 X ו (A2) 40 X הגדלה. לוחות B הצג ביטויים של SOX2 (ירוק), דאפי (כחול) ב- CSCs-(B1) 20 X ו (B2) 40 X הגדלה. לוחות ג הצג ביטויים של Nanog (ירוק), דאפי (כחול) ב- CSCs-(C1) 20 X ו (C2) 40 X הגדלה. לוחות D מראים ביטויים של Ki-67 (אדום) ודאפי (כחול) CSCs-(D1) 20 X ו (D2) 40 X הגדלה. בפסי בקנה מידה הם 100 מיקרומטר עבור הגדלה X 40 µm 200 עבור הגדלה X 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: אפיון של CSCs עבור סמני לב. לוחות אלה מראים פלורסצנטיות נציג הדמיה של CSCs בתרבית של סמני הלב. פאנלים א' תראה ביטויים של Sca-1 (אדום) ודאפי (כחול) CSCs-(A1) 20 X ו (A2) 40 X הגדלה. לוחות B הצג ביטויים של NKX2-5 (ירוק) ודאפי (כחול) ב- CSCs-(B1) 20 X ו (B2) 40 X הגדלה. C מראות ביטויים של GATA4 (אדום) ודאפי (כחול) CSCs-(C1) 20 X ו (C2) 40 X הגדלה. בפסי בקנה מידה הם 100 מיקרומטר עבור הגדלה X 40 µm 200 עבור הגדלה X 20.

Figure 4
איור 4: אפיון של CSC בידול כלפי השושלת cardiomyocyte. מראות אלה נציג שלב-ניגודיות והדימות זריחה של 12-ימים הבדיל CSCs. (א) לוח זה מציג הביטוי של cardiomyocyte סמן actinin CSCs הבדיל, עם () תמונת שלב-החוזה, (b ) קרינה פלואורסצנטית תמונה של דאפי (מוכתמים גרעין), (ג) פלורסצנטיות התמונה של actinin (ירוק) ותמונה (d) ממוזג של לוחות - c. הגדלה הם 40 X. (B) לוח זה מראה את הביטוי של טרופונין סמן cardiomyocyte הבדיל אני ב CSCs, עם () תמונת שלב-החוזה, (b) פלורסצנטיות תמונה של דאפי (מוכתמים גרעין), (ג) פלורסצנטיות דימוי טרופונין אני (ירוק) ו- (ד) תמונת הממוזג של לוחות - c. הגדלה הם 40 X. בפסי בקנה מידה הם 100 מיקרומטר עבור הגדלה X 40 µm 200 עבור הגדלה X 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: ייצוג סכמטי של השלבים השונים של CSC בידוד, תרבות בידול. השתמשנו הלבבות שהוסרו בניתוח ארבע עד חמש עכברים בוגרים עבור בידודו של CSCs. התהליך stepwise של בידוד CSC, תרבות, בידול כלפי cardiomyocytes שושלות מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

להלן השלבים הקריטיים של הפרוטוקול בידוד CSC. 1) תנאי סטיריליים חייבות להישמר לחילוץ של הלבבות של העכברים. כל זיהום במהלך החילוץ הלב עלול לסכן את איכות CSCs. 2) הדם להסירו לחלוטין לפני הא הלב, אשר נעשה על ידי מספר שוטף של כל הלב והלב חלקים עם HBSS פתרון. 3) החלקים הלב חייב להיות lysed לחלוטין להשעיה תא בודד עם פתרון collagenase. 4) חייב להיות prewarmed polysucrose, סודיום diatrizoate הדרגתיות הפתרון עבור הפרדת התאים. 5) חייב להיות prewarmed המדיום לתרבות CSC. 6) הנהרות CSCs במהלך זריעה בקערה תרבות צריך להיות גבוה, כי ב- confluency נמוך, CSCs עשוי לשנות את המורפולוגיה שלהם. 7) המספר CSC צריך להיות הבקיע לאחר הבידוד מהלב ולפני את ציפוי לתוך תבשיל תרבות. המספר של CSCs מציין את היעילות של הבידוד מהלב. ספירת CSCs חשוב זריעה של CSCs בצלחת תרבות.

השתמשנו עכברים בוגרים כדי לבודד CSCs, אשר שימש על ידי חוקרים אחרים מודלים מכרסמים23,28. CSCs ניתן לבודד לבבות מכרסמים neonatal29,30 , אפילו את הביופסיה של לב האדם31. הפרוטוקולים בידוד CSC שדווחה בעבר. יש כמה מגבלות, כגון פחות תשואה, הליך מורכב בידוד, משך זמן עבור בידול, ופחות cardiomyocyte בידול פוטנציאל32,33, 34. פרוטוקול בידוד CSC המובאת כאן היא פשוטה: זה לוקח פחות זמן והוא חסכוני ויעיל יותר כממוצע CSC. יתר על כן, CSCs מבודדים הם Sca-1+ ve (סמן מקובל היטב בעכבר CSCs) (דמויות 1A1 - 3C 2). עבור הבידול של CSCs, פרוטוקולים אחרים זקוקים לשלושה עד ארבעה שבועות35,36. עם זאת, פרוטוקול זה דורש 12 ימים (4A דמויות - 4B). מעבר צבע מבוסס צנטריפוגה CSC הבידוד המובאת כאן התשואות ~1.8 CSCs מיליון מתוך ארבעה עכברים זכרים לבבות.

התשואה של CSCs אמנם גבוהה, מגבלה של פרוטוקול זה הוא אחידות טוהר CSCs מבודדים. כי אין סמן מקובל יחיד CSCs, קשה להשתמש בסמן בודד-תא-השטח כדי לבחור CSCs. עם זאת, CSCs מבודדת על ידי פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבל אוכלוסייה אחידה של CSCs המבוסס על סמן מסוים או מספר סמנים של CSCs, באמצעות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון. לכן, בשיטה זו של CSC בידוד היא חסכונית עם תשואה גבוהה ויש לו האופציה לקבל אוכלוסייה CSC אחיד בהתבסס על marker(s) תא-משטח מסוים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת, חלקים, המענקים מכוני הבריאות הלאומיים HL-113281 ו- HL116205 כדי פאראס קומאר מישרה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice The Jackson laboratory, USA Stock no. 000664
Antibodies:
OCT4- Abcam ab18976 (rabbit polyclonal) OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
SOX2 Abcam ab97959 (rabbit polyclonal) SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Nanog Abcam ab80892 (rabbit polyclonal) Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Ki67 Abcam ab16667 (rabbit polyclonal) Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Sca I Millipore AB4336 (rabbit polyclonal) Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
NKX2-5 Santa Cruz sc-8697 (goat polyclonal) NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
GATA4 Abcam ab84593 (rabbit polyclonal) GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
MEF2C Santa Cruz sc-13268 (goat polyclonal) MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Troponin I Millipore MAB1691 (mouse monoclonal) Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Actinin Millipore MAB1682 (mouse monoclonal) Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
ANP Millipore AB5490 (mouse polyclonal) ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Alex Fluor-488 checken anti-rabbit Life technology Ref no. A21441
Alex Fluor-594 goat anti-rabbit Life technology Ref no. A11012
Alex Fluor-594 rabbit anti-goat Life technology Ref no. A11078
Alex Fluor-488 checken anti-mouse Life technology Ref no. A21200
Alex Fluor-594 checken anti-goat Life technology Ref no. A21468
Name Company Catalog Number Comments
Culture medium:
CSC maintenance medium Millipore SCM101 Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells
cardiomyocytes differentiation medium Millipore SCM102
DMEM Sigma-Aldrich D5546
Name Company Catalog Number Comments
Cell Isolation buffer:
polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) Sigma 10771
HBSS Gibco 2018-03
Collagenase I Sigma C0130
Dispase solution STEMCELL Technologies 7913
PBS LONZA S1226
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermoscientific A1110501
Other reagents:
BSA Sigma A7030
Normal checken serum Vector laboratory S3000
DAPI solution Applichem A100,0010 Dapi, working concentration-1 µg/mL
Trypan blue Biorad 145-0013
Trypsin Sigma T4049
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A1110501
Formaldehyde Sigma 158127
Triton X-100 ACROS Cas No. 900-293-1
Tween 20 Fisher Sceintific Lot No. 160170
Ethanol Thermo Scientific
Name Company Catalog Number Comments
Tissue culture materials:
100 mm petri dish Thermo Scientific
6-well plate Thermo Scientific
24-well plate Thermo Scientific
T-25 flask Thermo Scientific
T-75 flask Thermo Scientific
15 ml conical tube Thermo Scientific
50 mL conical tube Thermo Scientific
40 µm cell stainer Fisher Scientific 22363547
100 µm cell stainer Fisher Scientific 22363549
0.22 µm filter Fisher Scientific 09-719C
10 mL syring BD Ref no. 309604
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips Fisher Scientific
5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette Thermo Scientific
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
Centrufuge machine Thermo Scientific LEGEND X1R centrifuge
EVOS microscope Life technology
Automated cell counter Biorad
Cell counting slide Biorad 145-0011
Pippte aid Thermo Scientific S1 pipet filler
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Instruments:
Surgical scissors Fine Scientific Tool
Fine surgical scissors Fine Scientific Tool
Curve shank forceps Fine Scientific Tool
Surgical blade Fine Scientific Tool

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146 (2017).
  2. Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
  3. Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
  4. Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
  5. Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
  6. Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
  7. Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
  8. Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
  9. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
  10. Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
  11. Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
  12. Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
  13. Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162 (2015).
  14. Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
  15. Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
  16. Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
  17. Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
  18. Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
  19. Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
  20. Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
  21. Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
  22. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
  23. Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265 (2011).
  24. Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
  25. Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet? Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
  26. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
  27. Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
  28. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
  29. Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
  30. Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
  31. Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
  32. Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
  33. Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
  34. Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
  35. Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).
  36. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).

Tags

ביולוגיה גיליון 143 Sca-1 OCT4 Nanog Ki-67 NKX2-5 GATA4 actinin טרופונין אני
בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yadav, S. K., Mishra, P. K.… More

Yadav, S. K., Mishra, P. K. Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart. J. Vis. Exp. (143), e58448, doi:10.3791/58448 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter