Summary
Das übergeordnete Ziel dieses Artikels soll das Protokoll zur Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen (CSCs) aus dem Herzen der erwachsenen Maus zu standardisieren. Hier beschreiben wir eine Dichte Gradienten Zentrifugation Methode, murine CSCs zu isolieren und ausgearbeiteten Methoden für CSC-Kultur, Proliferation und Differenzierung in Herzmuskelzellen.
Abstract
Myokardinfarkt (MI) ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität auf der ganzen Welt. Ein wesentliches Ziel der regenerativen Medizin ist der Tote Herzmuskel nach MI wieder aufzufüllen. Obwohl mehrere Strategien verwendet wurden, um den Herzmuskel zu regenerieren, bleibt Stammzell-Therapie einen wichtigen Ansatz für Tote Herzmuskel eines MI Herzens wieder aufzufüllen. Beweise sammeln schlägt das Vorhandensein von resident kardiale Stammzellen (CSCs) in das Erwachsene Herz und ihre endokrine und/oder parakrine Effekte auf die kardialen Regeneration. CSC-Isolierung und deren Charakterisierung und Differenzierung in Richtung Herzmuskelzellen, vor allem Kardiomyozyten bleibt jedoch eine technische Herausforderung. In der vorliegenden Studie haben wir eine einfache Methode zur Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von CSCs aus dem Herzen der erwachsenen Maus. Hier beschreiben wir eine Dichte Gradienten Methode zur Isolierung von CSCs, wo das Herz durch eine 0,2 % Kollagenase II Lösung verdaut wird. Um das isolierte CSCs zu charakterisieren, haben wir den Ausdruck von CSCs/Cardiac Marker, Sca-1, NKX2-5 und GATA4 und Pluripotenz/Stemness Marker OCT4, SOX2 und Nanog ausgewertet. Wir bestimmt auch die Proliferation Potenzial der isolierten CSCs durch sie in einer Petrischale züchten und die Bewertung des Ausdrucks der Verbreitung Markierung Ki-67. Für die Bewertung der Differenzierung Potenzial des CSCs, wählten wir sieben - zehn - Tage kultiviert CSCs. Wir übertragen sie auf eine neue Platte mit einem Cardiomyocyte Differenzierung Medium. Sie werden in einer Zelle-Kultur-Inkubator für 12 Tage inkubiert, während die Differenzierung Medium alle drei Tage gewechselt wird. Die differenzierte CSCs express Cardiomyocyte-spezifische Marker: Actinin und Troponin ich. So CSCs isoliert mit diesem Protokoll haben Stemness und kardialen Marker, und sie haben ein Potenzial für Proliferation und Differenzierung in Richtung Cardiomyocyte Abstammung.
Introduction
Ischämische Herzkrankheiten, einschließlich Myokardinfarkt (MI), ist eine der Hauptursachen des Todes rund um die Welt1. Stammzell-Therapie für die Regeneration Tote Herzmuskel bleibt ein wichtiger Ansatz zur Verbesserung der Herzfunktion eine MI Herz2,3,4,5. Verschiedene Arten von Stammzellen haben, Tote Herzmuskel wieder aufzufüllen und die Herzfunktion eines MI Herzens zu verbessern. Sie können im großen und ganzen in6 und Erwachsenen Stammzellen embryonaler Stammzellen eingeteilt werden. In adulten Stammzellen wurden verschiedene Arten von Stammzellen, wie Knochenmark gewonnenen mononukleären Zellen7,8, mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark9,10, Fettgewebe verwendet 11,12, und Nabelschnur13und CSCs14,15. Stammzellen können kardiale Erholung durch endokrine und/oder parakrine Aktionen16,17,18,19,20fördern. Jedoch ist eine große Einschränkung der Stammzell-Therapie eine ausreichende Anzahl von Stammzellen erhalten, das vermehren und/oder gegenüber einem bestimmten kardialen Linie21,22unterscheiden können. Autologen und allogenen Transplantation von Stammzellen ist eine wichtige Herausforderung in Stammzell-Therapie-9. CSCs könnte ein besserer Ansatz zur kardialen Regeneration, denn sie aus dem Herzen stammen und sie können als nicht-kardialen Stammzellen leichter ins Herz Linien differenziert. Also, es reduziert das Risiko von Teratom. Darüber hinaus könnte die endokrinen und parakrine Effekte des CSCs, wie Exosomen und MiRNAs abgeleitet von CSCs, effektiver als andere Arten von Stammzellen. CSCs bleibt daher eine bessere Option für kardialen Regeneration23,24.
Obwohl CSCs ein besserer Anwärter zur kardialen Regeneration in einem MI Herzen aufgrund ihrer kardialen Ursprungs sind, ist eine große Einschränkung mit CSCs weniger Ertrag aufgrund des Fehlens einer effizienten Isolierung-Methode. Eine weitere Einschränkung könnte beeinträchtigt Differenzierung des CSCs in Richtung Herzzellen Lineage2,25,26,27. Um diese Einschränkungen zu umgehen, ist es wichtig, ein effizientes Protokoll für CSC-Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung in Richtung Herz Linie zu entwickeln. Es gibt keine einzige akzeptable Marker für CSCs und eine spezifische Zelloberfläche Marker-basierte Isolation des CSCs ergibt weniger CSCs. Hier, standardisieren wir einen einfachen Farbverlauf Zentrifugation Ansatz zur CSCs aus dem Herzen der Maus zu isolieren, ist kostengünstig und führt zu einer erhöhten Rendite von CSCs. Diese isolierten CSCs können für spezifische Zelloberfläche Marker durch Fluoreszenz-aktivierte Zelle kurzschließen ausgewählt werden. Neben CSCs isoliert haben wir ein Protokoll für CSC-Kultur, Charakterisierung und Differenzierung gegenüber Cardiomyocyte Abstammung. So präsentieren wir eine elegante Methode um zu isolieren, zu charakterisieren, Kultur, und CSCs von Erwachsenen Mäuseherzen (Abbildung 5) zu unterscheiden.
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Protocol
Gehäuse, Anästhesie und Opfer von Mäusen wurden nach dem genehmigten Protokoll der IACUC von der University of Nebraska Medical Center durchgeführt.
(1) Materialien
- Einsatz 10 bis 12 Wochen alten C57BL/6J schwarz können auch männliche Mäuse auf der institutionellen Tierhaus für die Isolierung von CSCs. CSCs im Haus gehalten werden von nicht-schwangeren weiblichen Mäusen isoliert.
- Alle notwendigen chirurgischen Instrumente, einschließlich Chirurgische Scheren, feine Chirurgische Scheren, gebogener Schaft Zange und einer chirurgischen Klinge durch Autoklavieren zu sterilisieren Sie vor der Euthanasie der Maus.
- CSC-Isolierung-Puffer in einem sterilisierten Zustand vorzubereiten und bei 4 ° C auf dem Eis aufbewahren. Diese Puffer sind Polysucrose und eine Natrium-Diatrizoate-Lösung angepasst an eine Dichte 1,077 g/mL, unvollständige Dulbecco geändert Adlers Medium, 1 X Ham ausgewogen Salzlösung (HBSS) und Zell-Kultur-Klasse 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Bereiten Sie eine 1 % Kollagenase II-Stammlösung (filtriert und sterilisiert) und eine 0,2 % funktionierende Lösung in HBSS vor.
- Halten Sie die Gewebekultur-Materialien in den sterilisierten Zustand in der Biosicherheit Kabinett, einschließlich einer 10-mm-Petrischale, ein 6-Well-Platte, einer 24-Well-Platte, t-25 T-75 Kulturflaschen, 15 mL und 50 mL konische Röhrchen und Einweg-serologische Pipetten mit 40 µm und 100 -µm Zelle Siebe mit 0,22 µm filtern.
- Sterilisieren Sie 10-µL und 200 µL 1.000 µL Pipettenspitzen von Autoklaven.
- Verwenden Sie puderfreie Nitril-Handschuhe und 70 % Ethanol, um einen sterilen Zustand während des Experiments zu erhalten.
- Verwenden Sie 10 % Bleichmittel als Desinfektionsmittel.
- Verwenden Sie handelsübliche CSC Wartung und Herzzellen Differenzierung Medium für die Kultur und die Differenzierung des CSCs, beziehungsweise.
(2) Isolationsmethode kardiale Stammzellen
- Vier bis fünf männlichen Erwachsenen (oder nicht-trächtige Weibchen) einschläfern Mäuse mit einer CO2 -Kammer. Befestigen Sie jede Maus Arme auf einem separaten Dissektion Karton mit Stiften oder klebrigen Bänder.
- Sprühen Sie 70 % igem Ethanol auf die Maus, um äußere Keime loszuwerden und pflegen den sterilisierten Zustand während der Ernte des Herzens. Machen Sie einen Schnitt mit der Schere in der Mitte des Bauches und schneiden Sie die Haut vom Bauch bis zu den Thorax in einer geraden Linie. Entfernen Sie die Haut von beiden Seiten der mittleren Schnitt um den Bauchbereich Haut und Haaren zu löschen. Schneiden Sie Scheren und Pinzetten, die Membran unterhalb des Brustkorbs.
- Öffnen Sie die Brusthöhle der Maus durch Schneiden des Brustkorbs in der Kapuze. Setzen Sie das Herz und entfernen Sie das Blut nahe dem Herzen. Waschen Sie die Umgebung des Herzens mit eiskaltem PBS get rid of Blut in der Nähe des Herzens.
- Das Herz mit chirurgische Schere und Pinzette zu sezieren. Legen Sie das Herz in einer 100-mm-Petrischale mit 10 mL eiskaltem PBS.
- Pocht das Herz mit gebogenen Schaft Pinzette und entfernen Sie das restliche Blut im Inneren des Herzens.
- Verwenden Sie das ganze Herz für die Isolierung von CSCs.
- Übertragen Sie alle vier oder fünf ganze Herzen auf eine 50 mL konische Röhrchen mit 10 mL eiskaltes HBSS. Halten Sie das Rohr auf dem Eis bis Weiterverarbeitung.
- Wischen Sie innerhalb und außerhalb eines Biosafety Schrank mit 70 % Ethanol, eine sterilisierte Umgebung zu schaffen. Sterilisieren Sie die Herz-haltige Rohr- und andere benötigten Materialien mit 70 % Ethanol. Legen Sie das Herz-haltigen Rohr in die Biosicherheit Schaltschrank für die Weiterverarbeitung.
- Übertragen Sie die Herzen auf einer 100-mm-Petrischale mit 10 mL eiskaltes HBSS. Waschen Sie die Herzen wieder durch Abtasten um jede verbleibende Blut im Inneren des Herzens zu entfernen. Ändern Sie die HBSS-Lösung nach jedem Waschen um die vollständige Entfernung des Blutes zu gewährleisten.
- Schneiden Sie die Herzen mit feinen Chirurgische Scheren oder einer chirurgischen Klinge in einer 100-mm-Petrischale mit ca. 5-7 mL HBSS Lösung in kleine Stücke. Halten Sie jedes Herz mit einer Zange und verwenden Sie ein paar feine Chirurgische Scheren oder einer chirurgischen Klinge, um das Herz in 2 - 4 mm Stücke geschnitten. Wechseln Sie die HBSS Lösung häufig um Blut-freie HBSS sicherzustellen. Zerkleinere die Herzen in der HBSS-Lösung.
- Zentrifugieren Sie dem Hackfleisch / Gewebe bei 500 X g bei 4 ° C für 5 min. verwerfen des Überstands und halten Sie das Pellet.
- Das Pellet in 5-6 mL 0,2 % Kollagenase II Lösung in einem 50 mL konische Röhrchen aufzuwirbeln. Das Volumen der Kollagenase-Lösung sollte fast 1,5 - bis 2-Fach auf das Volumen des Geschosses.
Hinweis: für die Verdauung von Gewebe, 0,2 % Kollagenase ich und 2,5 U/mL Dispase-Lösung 0,2 % Kollagenase II ersetzen kann. Verwenden Sie zum fast gleichen Volumen Dispase Lösung für die Kollagenase ich Lösung. - Mischen Sie das Pellet mit 0,2 % Kollagenase II Lösung durch rühren das Rohr oder rockt die Röhre auf einen Shaker bei 75 X g für 45-60 min bei 37 ° C. Schütteln Sie das Rohr von Hand nach alle 20-30 min um die Lyse zu verbessern.
- Genannte lysierten Gewebe Mix mit einer serologischen 5-mL-Pipette mit einer 1-mL-Pipettenspitze Gewebe Klumpen in die einzelne Zelle Suspension zu distanzieren.
Hinweis: Um die maximale Erholung des CSCs erhalten, genannte Lyse Mischung mindestens 5 min lang. Wenn die Klumpen Gewebe relativ groß sind, schneiden Sie die Spitze einer 1-mL-Pipette-Spitze mit einer Schere oder einem chirurgischen Klinge und verwenden Sie es für Verreibung. - Stoppen Sie die enzymatische lyse des Gewebes durch Zugabe von handelsüblichen CSC Wartung Medium. Fast 2-3 x so viel Wartung Medium als das Volumen des lysierten Gewebes im Schritt 2.14 hinzufügen.
- Ein 100 µm Zelle Sieb keine unverdauten Gewebe Stücke entfernen durchlaufen Sie die verdauten Zellsuspension.
- Wiederholen Sie Schritt 2.16 mit einem 40 µm Zelle Sieb.
- Trennen der Zellen durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung. Für die Trennung von Zellen überlagern Sie sanft ein gleiches Volumen an das Filtrat über Polysucrose und Natrium-Diatrizoate-Lösung. Beispielsweise fügen Sie zunächst 20 mL Polysucrose und Natrium-Diatrizoate-Lösung in einem 50 mL konische Röhrchen und fügen Sie dann 20 mL Filtrat aus Schritt 2.17 über die Polysucrose und Natrium-Diatrizoate-Lösung.
Hinweis: Prewarm die Polysucrose und Natrium-Diatrizoate-Lösung bei 37 ° C vor dem verwenden mit den Zellen. Fügen Sie das Filtrat aus Schritt 2.17 über die Polysucrose und Natrium Diatrizoate Lösung, sehr vorsichtig und langsam zu vermeiden, eine Vermischung der beiden Lösungen. Dies gilt als ein entscheidender Schritt. - Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit beiden Lösungen bei 500 X g für 20 min bei Raumtemperatur mit einer Schaukel-Eimer-Zentrifuge. Legen Sie die Zentrifuge bei niedrigeren Drehzahlen zu vermeiden, mischen die beiden Lösungen beschleunigen und Abbremsen und für die ordnungsgemäße Trennung des CSCs. Dies ist ein wichtiger Schritt im CSC-Isolierung. Habe das Rohr mit dem Farbverlauf Mischung sehr langsam ohne Störung in der Zentrifuge und setzen Sie ihn für Zentrifugation.
- Nehmen Sie die buffy Mantel zusammen mit extra Lösung aus der oberen Schicht mit einer 1-mL-Pipette oder einem Kunststoff Pasteurpipette in eine sterilisierte 15-mL-Tube. Diese buffy Schicht enthält das CSCs.
Hinweis: Nehmen Sie zusätzliche Vorsichtsmaßnahme beim Pipettieren der buffy Mantel nicht, nehmen Sie die Polysucrose und Natrium Diatrizoate Lösung Schicht, weil es giftig für CSCs. - Die Zellsuspension aus Schritt 2.20 ein gleiches Volumen von CSC Wartung Medium hinzu und mischen Sie es richtig, um die verbleibende Polysucrose und Natrium Diatrizoate Lösung, neutralisieren, falls vorhanden.
- Zentrifugieren Sie die oben genannten Zellsuspension bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
- Das Pellet in 7-10 mL unvollständig DMEM Medium Aufschwemmen und 500 X g für 5 min bei 4 ° C, um loszuwerden, alle restlichen Polysucrose und Natrium Diatrizoate Lösung zentrifugieren.
- Sammeln Sie die Pellets, die gereinigten CSCs enthält.
- Aufschwemmen Sie das Pellet in 1 mL CSC Wartung Medium, zählen Sie, wie CSC und verwenden Sie das Pellet für Kultur. Um die CSC-Nummer zu zählen, verwenden Sie Trypan blau Färbung und eine Hemocytometer. Mit vier männlichen Mäusen Herzen ist die Ausbeute des CSCs ~1.8 Millionen.
- Samen des CSCs in einer Kultur 6-Well-Platte beschichtet mit 0,02 % Gelatine-Lösung mit 0,5 % Fibronektin. Verwenden Sie 2 mL komplette Wartung Medium für die Aussaat. Inkubieren Sie die Kultur-Platte in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2.
- Ersetzen Sie das Medium der Kultur CSCs mit kompletten CSC Wartung Medium jeden Tag bis zum dritten Tag. Danach ändern Sie das Medium an wechselnden Tagen.
- Bestimmen Sie das Wachstum des CSCs, indem sie unter dem Mikroskop zu beobachten.
3. Kultur Wartung und Durchgang von kardialen Stammzellen
- Kultur der isolierten CSCs in einem handelsüblichen Wartung Medium. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit frischen Wartung Medium, jeden zweiten Tag. Wenn die CSC Kultur Konfluenz erreicht hat, übertragen das CSCs auf eine neue Platte beschichtet mit Gelatine und Fibronektin, wie in Schritt 2.26 erwähnt. Die kultivierten CSCs durch enzymatische Zelle Dissoziation Puffer abnehmen. Folgen Sie das Standardprotokoll der Zelle Dissoziation aus der Kultur-Platte. Zu diesem Zeitpunkt gelten CSCs in der Passage 0 (P0) Bühne.
- Kultur P0 CSCs in eine neue Gelatine und Fibronektin-beschichtete Platte in komplette CSC-Wartung-Medium bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator, konfluierende werden lassen, und dann folgen Schritt 3.1 Durchgang 1 (P1) CSCs. Store P1 CSCs in flüssigem Stickstoff oder verwenden sie für Erfahrungen rungen.
- 0,5 Millionen Samenzellen in einer 6-Well-Platte oder 1 Million Zellen in t-25, die CSC Kultur in seiner Anfangsphase beizubehalten.
- Durchgang des CSCs bei 85-90 % Zusammenfluss. CSCs können Wartung Mittel-bis zu vier bis sechs Wochen kultiviert werden.
Hinweis: Bewahren Sie die ursprünglichen Aussaatdichte des CSCs relativ hoch (40-50 %) da bei einem niedrigeren Aussaatdichte CSCs ihrer Morphologie, flachen und länglichen ändern können.
4. Charakterisierung der kardialen Stammzellen
- Um die kultivierten CSCs zu charakterisieren, beobachten sie unter einem Phagen-Kontrast oder ein Hellfeld Mikroskop. Das Ziel eines fluoreszierenden Mikroskops die CSC-haltigen Platte auflegen. Legen Sie die Vergrößerung relativ gering (10 X), die Zellen zu konzentrieren. Verwenden Sie Phasenkontrast-Blende, um die Zellen zu beobachten. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf 20 X durch eine Änderung der Objektivlinse und Bild das CSCs erhöhen das Ziel, 40 X und Bild das CSCs. In zwei Tagen das CSCs erscheinen fast runde Form, sondern die Größe der Zelle steigt mit der Zeit und in sieben Tagen, CSCs erscheinen fast zylindrisch (Abbildung 1A - 1 C).
- Immunostaining des CSCs mit Markern der Pluripotenz/Stemness (OCT4, SOX2 und Nanog), Verbreitung (Ki-67) (Abbildung 2A - 2D) und kardialen Ursprungs/Progenitorzellen (Sca-1, NKX2-5 oder GATA4) durchführen (Abb. 3A - 3 C).
- Für die Immunostaining des CSCs Samen 10.000 CSCs in einer Kultur 24-Well-Platte.
- Am nächsten Tag (nach 18-24 h), beheben das CSCs in 300 µL 4 % Paraformaldehyd für 10 Minuten.
- Das CSCs mit 500 µL eiskaltem PBS waschen 3 X mit 5-min-Takt.
- Permeabilize das CSCs mit 300 µL 0,2 % Triton x-100 für 10 min in PBS verdünnt.
- Das CSCs mit 500 µL eiskaltem PBS waschen 3 X mit 5-min-Takt.
- Führen Sie die Sperrung des CSCs mit 300 µL 1 % BSA in PBST verdünnt (PBS + 0,1 % Tween 20) oder 300 µL 10 % normales Huhn Serum für 1 h in PBST verdünnt.
- Das CSCs in 200 µL Primärantikörper verdünnt in blocking-Lösung über Nacht bei 4 ° c inkubieren Verdünnen Sie den primären Antikörper, wie das Datenblatt von Antikörpern oder nach Standardisierung empfohlen.
- Das CSCs mit 500 µL eiskaltem PBS waschen 3 X mit 5-min-Takt.
- Inkubieren Sie das CSCs in 200 µL der Sekundärantikörper in blocking-Lösung verdünnt (siehe Schritt 4.2.6) für 1 h bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper wie das Datenblatt von Antikörpern oder nach Standardisierung empfohlen.
- Das CSCs mit 500 µL eiskaltem PBS waschen 3 X mit 5-min-Takt.
- Counterstain CSCs mit 200 µL DAPI (1 µg/mL) für 5 min in PBS verdünnt.
- Waschen Sie das CSCs 1 X mit 500 µL eiskaltem PBS. Fügen Sie dann 300 µL eiskaltem PBS in jede Vertiefung.
- Durchführen Sie Bildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop. Folgen Sie den Anweisungen von fluoreszierend imaging, um direktes Licht auf die Platte zu vermeiden. Halten Sie die Kultur-Platte unter die Lupe genommen. Konzentrieren Sie sich die Zellen bei verschiedenen Vergrößerungen. Beobachten Sie die Zellen unter Phasenkontrast-und/oder andere Erregung Filter und speichern Sie die Bilder.
- Speichern Sie die Platte im Dunkeln bei 4 ° C.
5. Differenzierung der kardialen Stammzellen in Cardiomyocyte
- Für die Differenzierung von CSCs Samen 500.000 CSCs in einem 6-Well-Platte mit 2 mL Prewarm (37 ° C) im Handel erhältlichen CSC Wartung Medium.
- Inkubieren Sie die Platte enthält das CSCs in eine CO2 Inkubator bei 37 ° c Das CSCs zu befestigen und vermehren sich bis südlich konfluierende Wachstum zu ermöglichen. Wenn das Medium gelb dargestellt wird, ersetzen Sie das Kulturmedium mit frischen Wartung Medium.
- Bei 85-90 % Konfluenz, ersetzen Sie die Wartung Medium mit 2 mL Prewarm (37 ° C) Kardiomyozyten Differenzierung Medium. Bis zu 2-3 Wochen inkubieren Sie die Platte in eine CO2 Inkubator bei 37 ° C.
- Ändern der Differenzierung Medium jeder 2-3 d. beobachten das CSCs Morphologie unter dem Mikroskop jedes Mal während des Mediums ändern, um die guten Kulturbedingungen sicherzustellen.
- Nach 12 d von CSC Kultur in Differenzierung Medium Bild das CSCs für Differenzierung Marker nach einem standard Immunostaining Protokoll (siehe Schritte 4.2.1 - 4.2.14). Speichern Sie die fluoreszierenden Bilder für den Ausdruck der Kardiomyozyten Marker (Abbildung 4A - 4 b).
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Representative Results
In der vorliegenden Studie werden CSCs von 10 bis 12 Wochen alten C57BL/6J männliche Mäuse Herz isoliert. Hier haben wir eine einfache Methode für CSC-Isolierung und Charakterisierung mit Hilfe von Markern der Pluripotenz präsentiert. Wir stellten auch eine elegante Methode zur Differenzierung der CSC und die Charakterisierung von CSCs, die in Richtung Herzzellen Linie unterschieden. Wir beobachteten eine Spindel Form Morphologie des 2 -, 3-Tage-kultivierte CSCs unter dem Phasenkontrast-Mikroskop (Abb. 1A und 1 b). Wir fanden, dass eine Änderung in der Morphologie des CSCs 7 Tage Kultur in Wartung Medium, während welcher Zeit die Stammzellen werden länglich (Abbildung 1). Wir für Marker der Pluripotenz CSCs gekennzeichnet und festgestellt, dass sie OCT4, SOX2 und Nanog (Abbildung 2A - 2 C) ausdrücken. Wir fanden auch, dass CSCs in Kulturmedium vermehren und die Verbreitung Marker Ki-67 (Bild 2D) ausdrücken. Um die kardialen Ursprungs des CSCs zu charakterisieren, haben wir den Ausdruck der kardialen Marker Sca-1, NKX2-5 und GATA4 in CSCs festgestellt. Wir fanden einen Ausdruck der kardialen Marker in der kultivierten CSCs (Abb. 3A - 3 C). Um die Differenzierung von CSCs in Richtung Cardiomyocyte Abstammung zu ermitteln, haben wir CSCs in Cardiomyocyte Differenzierung Medium für 12 Tage kultiviert. Nach 12 Tagen abgebildet wir differenzierte CSCs für die Cardiomyocyte-Marker-Actinin und Troponin ich. Wir beobachteten, dass Cardiomyocyte Marker in differenzierten CSCs (Abbildung 4A - 4 b) zum Ausdruck gebracht wurden. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass wir erfolgreich CSCs aus Maus Herzen isoliert und diese CSCs können sich vermehren und in Richtung Herzzellen Linie zu unterscheiden.
Abbildung 1: Morphologie der kultivierten CSCs. Diese Tafeln zeigen Phasenkontrast-Bildgebung des kultivierten CSCs, nämlich Vertreter CSCs nach 2 Tagen der Kultivierung Wartung Medium an (A1), 20 X und (A2) 40 X Ziele, Vertreter CSCs nach 3 Tagen der Kultivierung in Wartung Medium an) B1) 20 X und (B2) 40 X Ziele und Vertreter CSCs nach 7 Tagen der Kultivierung in Wartung Medium an (C1), 20 X und (C2) 40 X Zielen. Der Maßstabsbalken sind 100 µm für die 40 X Vergrößerungen und 200 µm für die 20 X Vergrößerungen.
Abbildung 2: Charakterisierung von CSCs für Pluripotenz Marker. Diese Tafeln zeigen repräsentative Fluoreszenz-Bildgebung des kultivierten CSCs für Marker der Pluripotenz (OCT4, SOX2 und Nanog) und Verbreitung (Ki-67). Seitenteile A zeigen Ausdrücke OCT4 (grün) und DAPI CSCs (A1), 20 X und (A2) 40 X Vergrößerungen (blau). Platten B zeigen Ausdrücke SOX2 (grün) und DAPI in CSCs im (B1), 20 X und (B2) 40 X Vergrößerungen (blau). Panels C zeigen Ausdruck von Nanog (grün) und DAPI CSCs an (C1), 20 X und (C2) 40 X Vergrößerungen (blau). Panels D zeigen Ausdrücke von Ki-67 (rot) und DAPI in CSCs am (D1) 20 X und (D2) 40 X Vergrößerungen (blau). Der Maßstabsbalken sind 100 µm für die 40 X Vergrößerungen und 200 µm für die 20 X Vergrößerungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Charakterisierung von CSCs für kardiale Marker. Diese Tafeln zeigen repräsentative Fluoreszenz-Bildgebung des kultivierten CSCs für kardiale Marker. Seitenteile A zeigen Ausdrücke der Sca-1 (rot) und DAPI (blau) in CSCs (A1), 20 X und (A2) 40 X Vergrößerungen. Panels B zeigen Ausdrücke der NKX2-5 (grün) und DAPI CSCs im (B1), 20 X und (B2) 40 X Vergrößerungen (blau). Seitenteile C zeigen Ausdrücke GATA4 (rot) und DAPI in CSCs an (C1), 20 X und (C2) 40 X Vergrößerungen (blau). Der Maßstabsbalken sind 100 µm für die 40 X Vergrößerungen und 200 µm für die 20 X Vergrößerungen.
Abbildung 4: Charakterisierung der CSC Differenzierung in Richtung Cardiomyocyte Abstammung. Diese Tafeln zeigen Vertreter Phasenkontrast- und Fluoreszenz-Bildgebung der 12-Tage differenziert CSCs. (A) dieses Panel zeigt dem Ausdruck der Cardiomyocyte Marker Actinin in differenzierten CSCs mit (a) ein Phase-Vertrag-Bild (b ) (d) eine zusammengeführte Bild des Panels ein - c, Fluoreszenzbild des DAPI (befleckenden Kern) und (c) eine Fluoreszenz-Image des Actinin (grün). Die Vergrößerungen sind 40 X. (B) dieses Panel zeigt den Ausdruck der Cardiomyocyte Marker Troponin I CSCs, mit (einem) eine Phase-Vertrag (b) eine Fluoreszenz Bild des DAPI (befleckenden Kern), Bild (c) eine Fluoreszenz differenziert Troponin I (grün) und (d) eine zusammengefügte Bild der Platten ein - c. Die Vergrößerungen sind 40 X. Der Maßstabsbalken sind 100 µm für die 40 X Vergrößerungen und 200 µm für die 20 X Vergrößerungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Schematische Darstellung der verschiedenen Schritte der CSC Isolation, Kultur und Differenzierung. Wir verwendeten chirurgisch entfernte Herzen von vier bis fünf Erwachsene Mäuse für die Isolierung von CSCs. Der schrittweise Prozess der CSC-Isolation, Kultur und Differenzierung in Richtung Herzzellen Linien werden vorgestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die entscheidenden Schritte dieses CSC-Isolierung-Protokolls sind wie folgt. (1) ein sterilisierter Zustand ist für die Extraktion der Herzen von den Mäusen einzuhalten. Eine Kontamination während der Extraktion des Herzens beeinträchtigen die Qualität des CSCs. 2) Blut muss vollständig entfernt werden, bevor trippelnd Herzens, die durch mehrere Wäschen von ganzem Herzen und dem Herzen Stücke mit HBSS Lösung erfolgt. (3) das Herz-Stück müssen vollständig in einer einzelligen Suspension mit Kollagenase Lösung lysiert werden. (4) die Polysucrose und Natrium Diatrizoate gradient Lösung für die Trennung der Zellen muss vorgewärmt werden. (5) das Medium für die CSC Kultur muss vorgewärmt werden. (6) der Zusammenfluss des CSCs während der Aussaat in einer Kulturschale sollte hoch sein, da in niedrigen Konfluenz CSCs ihrer Morphologie ändern können. (7) die CSC-Nummer sollte nach der Isolierung aus dem Herzen und vor der Beschichtung in der Kulturschale gewertet. Die Anzahl der CSCs zeigt die Effizienz der Isolation von Herzen. Die Zählung des CSCs ist wichtig für die Aussaat des CSCs in der Kultur-Platte.
Wir haben Erwachsene Mäusen isolieren CSCs, die von anderen Forschern in Nagermodellen23,28verwendet wurde. CSCs können von Neugeborenen Nagetier Herzen29,30 und sogar aus der Biopsie ein Menschenherz31isoliert werden. Die bisher gemeldeten CSC Isolierung Protokolle haben einige Einschränkungen, z. B. weniger Ertrag, eine komplexe Isolierung-Prozedur, eine lange Dauer für Differenzierung und weniger Cardiomyocyte Differenzierung möglicher32,33, 34. die CSC Isolierung Protokoll hier vorgestellten ist einfach: es braucht weniger Zeit und ist kostengünstiger und effizienter in der CSC-Ausbeute. Darüber hinaus sind die isolierten CSCs Sca-1+ Ve (einem anerkannten Marker für Maus CSCs) (Figuren 1A1 - 3-2). Für die Differenzierung von CSCs benötigen andere Protokolle drei bis vier Wochen35,36. Allerdings erfordert dieses Protokoll 12 Tage (Abbildungen 4A - 4 b). Der gradient Zentrifugation-basierte CSC Isolation hier vorgestellten ergibt ~1.8 million CSCs aus vier männliche Mäuse Herzen.
Obwohl der Ertrag des CSCs hoch ist, ist eine Einschränkung dieses Protokolls die Homogenität und Reinheit der isolierten CSCs. Da gibt es keinen einzigen akzeptablen Marker für CSCs, ist es schwierig, eine einzelne Zelle Oberfläche Textmarker CSCs auswählen. Jedoch können CSCs isoliert durch dieses Protokoll verwendet werden, um eine einheitliche Population des CSCs basierend auf einer spezifischen Marker oder mehrere Markierungen des CSCs, mit Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zu erhalten. So, diese Methode der CSC Isolation ist kostengünstig mit einem hohen Ertrag und hat die Möglichkeit, eine einheitliche CSC-Population, basierend auf spezifischen Zelloberfläche Marker(s) bekommen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird in Teilen, durch die National Institutes of Health Zuschüsse HL-113281 und HL116205, Paras Kumar Mishra unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
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