Summary
El objetivo general de este artículo es estandarizar el protocolo para el aislamiento, caracterización y diferenciación de células madre cardiacas (CSCs) desde el corazón de ratón adulto. Aquí, describimos un método de centrifugación del gradiente de densidad para aislar las CMC murinas y métodos elaborados por la cultura, la proliferación y la diferenciación en cardiomiocitos de CSC.
Abstract
Infarto de miocardio (IM) es una causa importante de morbilidad y mortalidad en el mundo. Una meta importante de la medicina regenerativa es reponer el miocardio muerto después de MI. Aunque se han utilizado varias estrategias para regenerar el miocardio, terapia de células madre sigue siendo un enfoque importante para reponer el miocardio muerto de un corazón de MI. La acumulación de pruebas sugiere la presencia de células cardíacas residentes (CSCs) en el corazón de adultos y sus efectos endocrinos o paracrinos en la regeneración cardiaca. Sin embargo, aislamiento de CSC y su caracterización y diferenciación hacia células del miocardio, especialmente cardiomiocitos, sigue siendo un desafío técnico. En el presente estudio, nos proporciona un método simple para el aislamiento, caracterización y diferenciación de las CMC desde el corazón de ratón adulto. Aquí, describimos un método de gradiente de densidad para aislamiento de CSC, donde se digiere el corazón por una solución de 0,2% colagenasa II. Para caracterizar las CSCs aislados, se evaluó la expresión de marcadores de CSCs cardíaca Sca-1, NKX2-5 y GATA4 y marcadores de pluripotencia/troncalidad OCT4, SOX2 y Nanog. También determinamos el potencial de proliferación de las CMC aislados por cultivo en una placa de Petri y la evaluación de la expresión del marcador de proliferación Ki-67. Para evaluar el potencial de diferenciación de las CMC, se seleccionaron siete a diez días cultivadas CSCs. Nos trasladaron a una nueva placa con un medio de diferenciación de cardiomiocitos. Se incuban en una incubadora de cultivo celular de 12 días, mientras que el medio de diferenciación se cambia cada tres días. El CSC diferenciada expresa marcadores específicos de cardiomiocitos: actinina y troponina I. Así, CSCs aislados con este protocolo tienen troncalidad y marcadores cardiacos, y tienen un potencial de proliferación y diferenciación hacia linaje de cardiomiocitos.
Introduction
Enfermedad isquémica del corazón, incluyendo infarto de miocardio (IM), es una causa importante de muerte en el mundo1. Terapia de células madre para regenerar el miocardio muerto sigue siendo un enfoque principal para mejorar la función cardiaca de un MI corazón2,3,4,5. Se han utilizado diferentes tipos de células madre para reponer el miocardio muerto y para mejorar la función cardiaca de un corazón de MI. Pueden categorizar ampliamente en células madre embrionarias6 y adulto células de vástago. En las células madre adultas, se han utilizado varios tipos de células, como las células mononucleares de médula ósea7,8, las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea9,10, el tejido adiposo 11,12y13de cordón umbilical y CSC14,15. Las células madre pueden promover la regeneración cardiaca, endocrina o paracrina acciones16,17,18,19,20. Sin embargo, una limitación importante de la terapia de células madre es la obtención de un número suficiente de células madre que pueden proliferar y diferenciarse hacia un linaje cardíaco específico21,22. Trasplantes autólogos y alogénicos de células madre es un reto importante en la terapia de células madre9. CSCs podrían ser un mejor enfoque para la regeneración cardiaca porque proceden del corazón y pueden ser distinguidos más fácilmente en linajes cardíacos que células no cardiacas. Por lo tanto, reduce el riesgo de teratoma. Además, los efectos endocrinos y paracrinos de CSC, como exosomas y miRNAs derivados de la CSC, podrían ser más eficaces que otros tipos de células madre. Así, las CMC sigue siendo una mejor opción para la regeneración cardiaca23,24.
Aunque CSC es un mejor candidato para la regeneración cardiaca en un corazón de MI debido a su origen cardiaco, una limitación importante con CSC es menor rendimiento debido a la falta de un método de aislamiento eficientes. Otra limitación puede ser la diferenciación deteriorada de CSCs hacia cardiomiocitos linaje2,25,26,27. Para evitar estas limitaciones, es importante desarrollar un protocolo eficiente para el aislamiento, caracterización y diferenciación hacia linaje cardíaco de CSC. No hay ningún marcador aceptable solo para CSC y un aislamiento de basado en el marcador de superficie celular específico de CSCs rinde menos CSCs. Aquí, nos estandarizar un enfoque simple centrifugación gradiente para aislar CSC desde el corazón de ratón que es rentable y da lugar a un aumento del rendimiento de CSC. Estas CSCs aislados pueden seleccionarse para marcadores de superficie celular específicos cortocircuitando celular activado por fluorescencia. Además de aislamiento de las CMC, proporcionamos un protocolo para cultura de CSC, caracterización y diferenciación hacia linaje de cardiomiocitos. Así, presentamos un elegante método para aislar, caracterizar, cultura y distinguir las CMC de corazones de ratón adulto (figura 5).
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Protocol
La vivienda, la anestesia y el sacrificio de ratones fueron realizadas siguiendo el protocolo IACUC aprobado de la Universidad de Nebraska Medical Center.
1. materiales
- Negro de C57BL/6J de 10 a 12 semanas de edad uso ratones machos, mantenidos internos en las instalaciones animales institucional, para el aislamiento de las CMC. CSC también pueden ser aislado de ratones hembras no preñadas.
- Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos necesarios, incluyendo tijeras quirúrgicas, tijeras quirúrgicas finas, pinzas mango curvo y una cuchilla quirúrgica, en autoclave ellos antes de la eutanasia del ratón.
- Preparación de buffers de aislamiento de CSC en condiciones estériles y almacenarlos a 4 ° C en hielo. Estas reservas incluyen una solución de diatrizoato de sodio ajustada a una densidad de 1,077 g/mL y polysucrose incompleta Dulbecco modificado mediana Eagle, 1 x jamón equilibrada solución de sal (HBSS) y cultura grado 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) de la célula. Preparar una solución 1% colagenasa II stock (filtrada y esterilizada) y una solución de trabajo de 0.2% en HBSS.
- Conservar los materiales de cultivo de tejidos en estado esterilizado en la bioseguridad gabinete, incluyendo un plato de Petri de 10 mm, una placa de 6 pozos, una placa de 24 pocillos, T-25 T-75 frascos de cultivo, tubos cónicos de 15 mL y 50 mL y pipetas desechables con 40 μm y 100 -filtros de célula μm con filtros de 0,22 μm.
- Esterilizar los 10 μl, 200 μl y puntas de pipeta de 1.000 μl por autoclave.
- Utilizar guantes de nitrilo sin polvo y etanol al 70% para mantener una condición estéril durante todo el experimento.
- Usar 10% de lejía como desinfectante.
- Utilizar comercialmente disponible CSC mantenimiento medio y medio de diferenciación de cardiomiocitos para el cultivo y diferenciación de CSC, respectivamente.
2. método de aislamiento de células madre cardiacas
- Eutanasia a cuatro o cinco adultos (hembra o macho no embarazadas) ratones usando un compartimiento de CO2 . Fijar los brazos de cada ratón en un cartón separado disección con pasadores o cintas adhesivas.
- Rocíe el etanol al 70% en el ratón para deshacerse de los gérmenes exteriores y mantener las condiciones estériles durante la recolección del corazón. Hacer una incisión con las tijeras en el abdomen medio y cortar la piel del abdomen hasta el tórax en una línea recta. Retire la piel de ambos lados del corte medio para despejar la zona abdominal de piel y pelos. Usando tijeras y pinzas, cortar el diafragma por debajo de la caja torácica.
- Abrir la cavidad torácica del ratón mediante la reducción de la caja torácica dentro de la campana. Exponer el corazón y saque la sangre cerca del corazón. Lave el área alrededor del corazón de PBS helado para deshacerse de la sangre cerca del corazón.
- Diseccionar el corazón utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas. Coloque el corazón en caja Petri de 100 mm que contiene 10 mL de PBS helado.
- Palpitar el corazón con unas pinzas de mango curvo y extraiga la sangre residual en el corazón.
- Utilice el corazón entero para el aislamiento de las CMC.
- Transferencia de los cuatro o cinco corazones enteros a un tubo cónico de 50 mL que contiene 10 mL de helado HBSS. No el tubo en hielo hasta su procesamiento posterior.
- Limpie dentro y fuera de una Bioseguridad en gabinete con etanol al 70% para crear un ambiente esterilizado. Esterilizar el tubo que contiene el corazón y otros materiales requeridos con etanol al 70%. Coloque el tubo que contiene el corazón en la seguridad de la biotecnología gabinete para su posterior procesamiento.
- Transferir los corazones a un plato de Petri de 100 mm que contiene 10 mL de helado HBSS. Lavar los corazones otra vez palpando para quitar cualquier sangre residual en el corazón. Cambiar la solución HBSS después de cada lavado para asegurar la completa remoción de la sangre.
- Cortar los corazones en trozos pequeños con tijeras quirúrgicas finas o una cuchilla quirúrgica en un plato de Petri de 100 mm que contiene 5-7 mL de solución de HBSS. Sostenga cada corazón con un par de pinzas y un par de tijeras quirúrgicas finas o una cuchilla quirúrgica para cortar el corazón en pedazos de 2 a 4 mm. Cambiar la solución HBSS con frecuencia para asegurar HBSS sin sangre. Picar el corazón en la solución HBSS.
- Centrifugue el tejido picadito a 500 x g a 4 ° C por 5 min, descartar el sobrenadante y mantener el pellet.
- Resuspender el precipitado en 5-6 mL de solución al 0.2% colagenasa II en un tubo cónico de 50 mL. El volumen de solución de colagenasa debe casi 1.5 a 2 veces el volumen de la pastilla.
Nota: para la digestión de los tejidos, colagenasa 0.2% I y 2,5 U/mL de solución de dispase podemos reemplazar colagenasa 0.2% II. Utilizar un volumen casi igual de solución dispase a la colagenasa solución. - Mezclar bien el sedimento con solución al 0.2% colagenasa II por agitar el tubo o meciendo el tubo en un agitador a 75 x g durante 45-60 min a 37 ° C. Agite vigorosamente el tubo a mano después de cada 20-30 min para mejorar la lisis.
- Triturate la mezcla sometidas a lisis del tejido utilizando una pipeta serológica de 5 mL y una pipeta de 1 mL para disociar el bulto de tejido en la suspensión unicelular.
Nota: Para obtener la máxima recuperación de la CSC, triturate la mezcla de lisis durante al menos 5 minutos. Si los grumos de tejido son relativamente grandes, cortar la punta de una pipeta de 1 mL con unas tijeras o una cuchilla quirúrgica y utilizarlo para trituración. - Detener la lisis enzimática del tejido mediante la adición de medio de mantenimiento de CSC comercialmente disponible. Añadir casi 2-3 x tanto medio de mantenimiento como el volumen de los tejidos sometidos a lisis en paso 2.14.
- Pasar la suspensión digerida a través de un colador de celular 100 μm para eliminar los trozos de tejido sin digerir.
- Repita el paso 2.16 usando un tamiz de 40 μm células.
- Separar las células mediante centrifugación de gradiente de densidad. Para la separación de las células, recubrimiento suavemente un volumen igual del filtrado sobre polysucrose y sodio Diatrizoato solución. Por ejemplo, en primer lugar, añadir 20 mL de polysucrose y sodio Diatrizoato solución en un tubo cónico de 50 mL, añada 20 mL de filtrado del paso 2.17 sobre la polysucrose y sodio Diatrizoato solución.
Nota: Prewarm el polysucrose y sodio Diatrizoato solución a 37 ° C antes de utilizan con las células. Agregar el filtrado de paso 2.17 sobre la polysucrose y sodio Diatrizoato solución muy lenta y cuidadosamente para evitar cualquier mezcla de las dos soluciones. Esto se considera un paso crucial. - Centrifugar el tubo que contiene ambas soluciones a 500 x g por 20 min a temperatura ambiente utilizando una centrífuga de cubo de swing. Establecer la centrífuga a una velocidad inferior de aceleración y desaceleración para evitar mezclar las dos soluciones y para la adecuada separación de la CSC. Este es un paso importante en el aislamiento de CSC. Poner el tubo que contiene la mezcla degradada muy lentamente sin perturbaciones dentro de la centrífuga y set para la centrifugación.
- Saque la capa anteada junto con solución adicional de la capa superior con una pipeta de 1 mL o una pipeta Pasteur plástica en un tubo de 15 mL estéril. Esta capa buffy contendrá el CSC.
Nota: Tenga precaución extra durante el pipeteo de la capa anteada no para sacar la capa de solución de polysucrose y sodio Diatrizoato porque es tóxico para los CSCs. - Añadir un volumen igual de medio de mantenimiento de CSC a la suspensión de células de paso 2.20 y se mezcla bien para neutralizar el polysucrose residual y solución de diatrizoato de sodio si está presente.
- Centrifugue la suspensión de células superior a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado en 7-10 mL de medio DMEM incompleta y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C para eliminar cualquier polysucrose residual y solución de diatrizoato de sodio.
- Recoger el diábolo, que contiene el CSCs purificadas.
- Resuspender el precipitado en 1 mL de medio de mantenimiento de CSC, cuente el numero de CSC y utilizar el sedimento para la cultura. Para contar el número de CSC, usar tinción Trypan azul y un hemocitómetro. Con cuatro corazones de ratones machos, la producción de CSCs es ~1.8 millones.
- Semilla de CSC en una placa de cultivo de 6 pozos recubiertos con una solución de gelatina 0.02% conteniendo 0,5% de fibronectina. Use 2 mL de medio de mantenimiento completa para la siembra. Incubar la placa de cultivo en un incubador a 37 ° C con 5% CO2.
- Reemplazar el medio de la cultura CSC con medio de mantenimiento completo CSC cada día hasta el tercer día. Después de eso, cambiar el medio en días alternos.
- Observar bajo un microscopio para determinar el crecimiento de la CSC.
3. cultura de mantenimiento y el paso de células madre cardiacas
- El CSC aislada en un medio de mantenimiento disponible en el mercado de la cultura. Reemplazar el medio de cultivo con medio de mantenimiento fresco en días alternos. Cuando la cultura CSC llega a confluencia, transferir el CSC a una nueva placa cubierta con gelatina y fibronectina, como se mencionó en el paso 2.26. Separar el CSCs cultivadas, almacenador intermediario de la disociación enzimática de la célula. Siga el protocolo estándar de la disociación de células de la placa de cultivo. En esta etapa, las CMC se consideran en el paso 0 (P0) etapa.
- Cultura P0 CSCs en una gelatina nueva placa revestida de fibronectina en medio de mantenimiento completo CSC a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 , les permiten ser confluente y luego siga paso 3.1 paso 1 (P1) P1 de CSCs. tienda CSCs en nitrógeno líquido o utilizarlos para experiencia ments.
- 0,5 millones de células en una placa de 6 pozos o células de 1 millón en T-25 para mantener la cultura de CSC en su etapa inicial de la semilla.
- Paso el CSC cuando se vuelven confluentes de 85% - 90%. CSC puede ser cultivado en el medio de mantenimiento hasta cuatro a seis semanas.
Nota: Mantenga la densidad de siembra inicial de los CSCs relativamente altas (40% - 50%) porque, en una menor densidad de siembra, la CSC puede cambiar su morfología plana y alargada.
4. Caracterización de células madre cardiacas
- Para caracterizar las CSCs cultivadas, observarlos en un phage-contraste o un microscopio de campo brillante. Coloque la placa que contiene CSC en el objetivo de un microscopio de fluorescencia. Establecer el aumento relativamente bajo (10 X) concentrar las células. Utilizar apertura de contraste de fase para observar las células. Aumentar la ampliación a 20 X cambiando la lente del objetivo y el CSC. aumento el objetivo a 40 X de la imagen y el CSC de la imagen. En dos días, el CSC aparece casi redondo en la forma y el tamaño de la célula aumenta con el tiempo y en siete días, el CSC aparece casi cilíndrico en forma (figura 1A - 1C).
- Realizar la inmunotinción de la CSC con marcadores de pluripotencia/troncalidad (OCT4, SOX2 y Nanog), proliferación (Ki-67) (figura 2A - 2D) y células de origen cardiaca/progenitoras (Sca-1, NKX2-5 o GATA4) (Figura 3A - 3C).
- Para la inmunotinción de la CSC, semilla 10.000 CSCs en una placa de cultivo de 24 pozos.
- Al día siguiente (después de 18-24 h), fijar el CSCs en 300 μL de paraformaldehído al 4% durante 10 minutos.
- Lavar el CSC con 500 μl de PBS helado, 3 veces con intervalos de 5 minutos.
- Permeabilizar el CSC con 300 μL de 0,2% Tritón X-100 diluido en PBS durante 10 minutos.
- Lavar el CSC con 500 μl de PBS helado, 3 veces con intervalos de 5 minutos.
- Realizar el bloqueo de la CSC con 300 μL de BSA 1% diluido en SAFT (PBS + 0,1% Tween 20) o 300 μL del suero de pollo normal 10% diluido en SAFT durante 1 hora.
- Incubar el CSCs en 200 μL de anticuerpo primario diluido en el bloqueo de solución durante la noche a 4 ° C. Diluir el anticuerpo primario según las recomendaciones de la hoja de datos de anticuerpos o según la normalización.
- Lavar el CSC con 500 μl de PBS helado, 3 veces con intervalos de 5 minutos.
- Incubar el CSCs en 200 μL del anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo (ver paso 4.2.6) por 1 h a temperatura ambiente. Diluir el anticuerpo secundario según las recomendaciones de la hoja de datos de anticuerpos o según la normalización.
- Lavar el CSC con 500 μl de PBS helado, 3 veces con intervalos de 5 minutos.
- Contratinción CSC con 200 μL de DAPI (1 μg/mL) diluido en PBS durante 5 minutos.
- Lavar el CSC 1 x con 500 μl de PBS helado. Luego, añadir 300 μL de PBS helado en cada pozo.
- Realizar proyección de imagen usando un microscopio de fluorescencia. Siga las instrucciones del fluorescente de la proyección de imagen, tal que se evite la luz directa sobre la placa. Mantenga la placa de cultura bajo el microscopio. Se centran las células en diferentes aumentos. Observar las células bajo contraste de fase y filtros de excitación diferentes y guardar las imágenes.
- Tienda la placa en la oscuridad a 4 ° C.
5. diferenciación de células madre cardiacas en cardiomiocitos
- Para la diferenciación de las CMC, semilla de 500.000 CSCs en una placa de 6 pozos con 2 mL de medio de mantenimiento de CSC comercialmente disponible prewarm (37 ° C).
- Incube la placa que contiene el CSC en un incubador de CO2 a 37 ° C. Permita que el CSC anexar y proliferan hasta el confluente crecimiento. Si el medio se vuelve amarillo, sustituir el medio de cultivo con medio de mantenimiento fresco.
- En el 85-90% de confluencia, sustituir el medio de mantenimiento con 2 mL de cardiomiocitos prewarm (37 ° C) medio de diferenciación. Incube la placa en un incubador de CO2 a 37 ° C durante 2-3 semanas.
- Cambiar el medio de diferenciación cada 2-3 d. observar morfología de los CSCs bajo el microscopio cada vez durante al medio el cambio para asegurar las condiciones de cultivo buenas.
- Después de 12 d de cultura CSC en medio de la diferenciación, imagen el CSC para marcadores de diferenciación siguiendo una inmunotinción estándar protocolo (ver pasos 4.2.1 - 4.2.14). Guardar las imágenes fluorescentes para la expresión de marcadores de cardiomiocitos (Figura 4A - 4B).
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Representative Results
En el presente estudio, se aislaron las CMC de corazones de ratones machos de 10 a 12 semanas de edad C57BL/6J. Aquí, hemos presentado un método sencillo para CSC aislamiento y la caracterización usando marcadores de pluripotencia. También presentamos un método elegante para la diferenciación de la CSC y la caracterización de las CMC que diferencian hacia cardiomiocitos linaje. Se observó una morfología de forma de huso de las CMC 2 - a 3-días-cultivadas bajo un microscopio de contraste de fase (figura 1A y 1B). Encontramos un cambio en la morfología de las CMC en 7 días de cultivo en medio de mantenimiento, tiempo durante el cual se convierten las células alargadas (figura 1). Caracteriza las CMC para marcadores de pluripotencia y encontró que expresan OCT4, SOX2 y Nanog (figura 2A - 2C). También observamos que los CSCs proliferan en medio de cultivo y expresan el marcador de proliferación Ki-67 (Figura 2D). Para caracterizar el origen cardiaco del CSC, se determinó la expresión de marcadores cardiacos GATA4 en CSC, Sca-1 y NKX2-5. Encontramos una expresión de marcadores cardiacos en el CSC cultivada (Figura 3A - 3C). Para determinar la diferenciación de las CMC hacia cardiomiocitos linaje, cultivan CSCs en medio de la diferenciación de cardiomiocitos durante 12 días. Después de 12 días, reflejada las CSCs diferenciados para el cardiomiocito marcadores actinina y troponina I. Observamos que cardiomiocitos marcadores se expresaban en CSC diferenciado (Figura 4A - 4B). En general, estos resultados demuestran que se aislaron con éxito CSC de mouse de corazon y que estas CSCs pueden proliferar y diferenciarse hacia cardiomiocitos linaje.
Figura 1: morfología de CSCs cultivadas. Estos paneles muestran la proyección de imagen de contraste de fase de CSCs cultivados, a saber: Representante CSC después de 2 días de cultivo en un medio de mantenimiento a (A1) 20 X y (A2) 40 X objetivos, representante CSC después de 3 días de cultivo en medio de mantenimiento a) B1) 20 X y (B2) 40 X objetivos y representante CSC después de 7 días de cultivo en un medio de mantenimiento a (C1) 20 X y (C2) 40 X objetivos. Las barras de escala son 100 μm para el aumento de X 40 y 200 para los aumentos de X 20.
Figura 2: caracterización de las CMC para marcadores de pluripotencia. Estos paneles muestran imágenes de fluorescencia representante de CSCs cultivadas para marcadores de pluripotencia (OCT4, SOX2 y Nanog) y proliferación (Ki-67). Paneles A Mostrar expresiones de OCT4 (verde) y DAPI (azul) en las CMC en (A1) 20 X y (A2) 40 X aumentos. B los paneles muestran expresiones de SOX2 (verde) y DAPI (azul) en CSC en (B1) 20 X y (B2) 40 X aumentos. Paneles C Mostrar expresiones de Nanog (verde) y DAPI (azul) en las CMC en (C1) 20 X y (C2) 40 X aumentos. Paneles D Mostrar expresiones de Ki-67 (rojo) y DAPI (azul) en las CMC en (D1) 20 X y (D2) 40 X aumentos. Las barras de escala son 100 μm para el aumento de X 40 y 200 para los aumentos de X 20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: caracterización de las CMC para marcadores cardiacos. Estos paneles muestran imágenes de fluorescencia representante de CSCs cultivadas para marcadores cardiacos. Paneles A Mostrar expresiones de Sca-1 (rojo) y DAPI (azul) en las CMC en (A1) 20 X y (A2) 40 X aumentos. Paneles B Mostrar expresiones de NKX2-5 (verde) y DAPI (azul) en las CMC en (B1) 20 X y (B2) 40 X aumentos. C los paneles muestran expresiones de GATA4 (rojo) y DAPI (azul) en CSC en (C1) 20 X y (C2) 40 X aumentos. Las barras de escala son 100 μm para el aumento de X 40 y 200 para los aumentos de X 20.
Figura 4: caracterización de CSC la diferenciación hacia el linaje del cardiomiocito. Estos paneles muestran representante de contraste de fases y fluorescencia proyección de imagen de 12 días distinguidos CSC. (A) este panel muestra la expresión de cardiomiocitos marcador actinina en CSC diferenciado, con (a) una imagen de contrato de la fase, (b ) una imagen de fluorescencia de DAPI (núcleo de tinción), (c) una fluorescencia imagen actinina (verde) e imagen (d) un combinado de paneles un - c. Los aumentos son de 40 X. (B) este panel muestra la expresión de la troponina marcador de cardiomiocitos distinguir las CMC, con (a) una contrato de la fase imagen, (b) una fluorescencia de DAPI (núcleo de tinción), (c) una fluorescencia de imagen de troponina I (verde) y (d) una imagen fusionada de paneles un - c. Los aumentos son de 40 X. Las barras de escala son 100 μm para el aumento de X 40 y 200 para los aumentos de X 20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: representación esquemática de los diferentes pasos de CSC aislamiento, cultivo y diferenciación. Utilizamos corazón quirúrgico quitado de cuatro a cinco ratones de adulto para el aislamiento de las CMC. Se presenta el proceso paso a paso de CSC aislamiento, cultivo y diferenciación hacia linajes de cardiomiocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los pasos críticos de este protocolo de aislamiento de CSC son las siguientes. 1) una condición esterilizada debe mantenerse para la extracción de los corazones de los ratones. Cualquier contaminación durante la extracción del corazón puede comprometer la calidad de la CSC. 2) la sangre debe eliminarse completamente antes de picar el corazón, que se realiza por varios lavados de todo corazón y el corazón pedazos con solución HBSS. 3) las piezas de corazón deben lisis totalmente en una suspensión unicelular con solución de colagenasa. 4) la polysucrose y sodio Diatrizoato solución gradiente para la separación de las células debe ser precalentada. 5) el medio para el cultivo de CSC debe ser precalentado. 6) la confluencia de la CSC durante la siembra en una placa de cultivo debe ser alta ya que, en confluencia baja, CSCs pueden cambiar su morfología. 7) el CSC debe ser marcados después del aislamiento del corazón y antes de la chapa en una placa de cultivo. El número de las CMC indica la eficacia del aislamiento del corazón. El recuento de los CSCs es importante para la siembra de la CSC en la placa de cultivo.
Hemos utilizado ratones adultos para aislar CSC, que ha sido utilizado por otros investigadores en modelos de roedores23,28. CSC puede ser aislado de corazones roedores neonatales29,30 y aun de la biopsia de un corazón humano31. Los protocolos de aislamiento previamente divulgados de CSC tienen algunas limitaciones, como un procedimiento complejo aislamiento, menos rendimiento, una larga duración para la diferenciación y menos cardiomiocitos diferenciación potencial de32,33, 34. Protocolo de aislamiento de la CSC presentado aquí es simple: toma menos tiempo y es rentable y más eficiente rendimiento de CSC. Además, el aislado CSC es Sca-1+ ve (un marcador bien aceptado para ratón CSCs) (figuras 1A1 - 2 de 3). Para la diferenciación de las CMC, otros protocolos necesitan de tres a cuatro semanas35,36. Sin embargo, este protocolo requiere 12 días (figuras 4A - 4B). Gradiente basado en la centrifugación CSC aislamiento presentado rendimientos ~1.8 millones CSCs de corazones de ratones machos de cuatro.
Aunque el rendimiento de las CMC es alto, una limitación de este protocolo es la uniformidad y pureza de los CSCs aislados. Porque no hay ningún marcador aceptable solo para CSC, es difícil utilizar un marcador de superficie de la célula solo para seleccionar CSCs. Sin embargo, CSCs aislados por este protocolo pueden utilizarse para obtener una población uniforme de CSCs basado en un marcador específico o varios marcadores de CSC, utilizando clasificación celular activado por fluorescencia. Así, este método de aislamiento de CSC es rentable con un alto rendimiento y tiene la opción de obtener una población uniforme de CSC basada en marcador de superficie celular específicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado, en parte, por las institutos nacionales de salud subvenciones HL-113281 HL116205 a Paras Kumar Mishra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
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