Summary
L'obiettivo generale di questo articolo è quello di standardizzare il protocollo per l'isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache (CSCs) dal cuore di topo adulto. Qui, descriviamo un metodo di centrifugazione su gradiente di densità per isolare murino CSCs e metodi elaborati per la cultura, la proliferazione e la differenziazione in cardiomiociti di CSC.
Abstract
Infarto miocardico (MI) è delle cause principali di morbilità e mortalità nel mondo. Degli obiettivi principali della medicina rigenerativa è per ricostituire il miocardio morto dopo MI. Anche se diverse strategie sono state utilizzate per rigenerare il miocardio, terapia con cellule staminali rimane un approccio importante per ricostituire il miocardio morto di un cuore MI. Raccogliendo la prova suggerisce la presenza di cellule staminali residenti cardiache (CSCs) nel cuore adulto e loro effetti endocrini o paracrino sulla rigenerazione cardiaca. Tuttavia, CSC isolamento e loro caratterizzazione e differenziazione verso le cellule del miocardio, soprattutto cardiomiociti, rimane una sfida tecnica. Nello studio presente, abbiamo fornito un metodo semplice per l'isolamento, caratterizzazione e differenziamento di CSCs dal cuore di topo adulto. Qui, descriviamo un metodo del gradiente di densità per l'isolamento delle CSCs, dove il cuore è digerito da una soluzione di 0,2% collagenosi II. Per caratterizzare le CSCs isolate, abbiamo valutato l'espressione di marcatori di CSCs/cardiaco Sca-1, NKX2-5 e GATA4 e marcatori di pluripotenza/staminalità OCT4, SOX2 e Nanog. Inoltre abbiamo determinato il potenziale di proliferazione di CSCs isolato messa in coltura in una capsula di Petri e valutando l'espressione del marker di proliferazione Ki-67. Per valutare il potenziale di differenziazione delle CSCs, abbiamo selezionato sette - dieci - giorni coltivate CSCs. Li abbiamo trasferito in una nuova piastra con un mezzo di differenziazione dei cardiomiociti. Essi vengono incubati in un'incubatrice di coltura cellulare per 12 giorni, mentre il mezzo di differenziazione viene cambiato ogni tre giorni. Le CSCs differenziate esprimono marcatori del cardiomyocyte specifiche: actinina e troponina I. Così, CSCs isolato con questo protocollo dispone di staminalità e marcatori cardiaci, e hanno un potenziale di proliferazione e differenziazione verso cardiomyocyte lignaggio.
Introduction
Cardiopatia ischemica, tra cui l'infarto miocardico (MI), è delle principali cause di morte intorno al mondo1. Terapia con cellule staminali per la rigenerazione del miocardio morto rimane un approccio importante per migliorare la funzione cardiaca di un MI cuore2,3,4,5. Diversi tipi di cellule staminali sono stati utilizzati per ricostituire il miocardio morto e migliorare la funzione cardiaca di un cuore MI. Essi possono essere categorizzati largamente in cellule staminali embrionali di6 e adulto di cellule staminali. In cellule staminali adulte, sono stati utilizzati vari tipi di cellule staminali, ad esempio cellule mononucleari derivate da midollo osseo7,8, cellule staminali mesenchimali derivate da midollo osseo9,10, tessuto adiposo 11,12e del cordone ombelicale13e CSCs14,15. Le cellule staminali possono promuovere rigenerazione cardiaca attraverso endocrine e/o paracrino azioni16,17,18,19,20. Tuttavia, una limitazione importante della terapia con cellule staminali è l'ottenimento di un adeguato numero di cellule staminali che possono proliferare e differenziarsi verso una specifica linea cardiaca21,22. Trapianto autologo e allogenico di cellule staminali è una sfida importante in cellule staminali terapia9. CSCs potrebbe essere un approccio migliore per la rigenerazione cardiaca perché sono derivati dal cuore e possono essere più facilmente differenziati in cardiaci lignaggi di cellule staminali non-cardiaca. Quindi, riduce il rischio di teratoma. Inoltre, gli effetti endocrino e paracrino delle CSCs, quali esosomi e Mirna derivati da CSCs, potrebbero essere più efficaci rispetto ad altri tipi di cellule staminali. Così, CSCs rimane un'opzione migliore per la rigenerazione cardiaca23,24.
Anche se CSC sono un candidato migliore per la rigenerazione cardiaca in un cuore MI dovuto la loro origine cardiaca, una limitazione importante con CSC è meno resa a causa della mancanza di un metodo efficiente isolamento. Un'altra limitazione potrebbe essere alterata differenziazione delle CSCs verso cardiomyocytes lineage2,25,26,27. Per ovviare a queste limitazioni, è importante sviluppare un efficiente protocollo per isolamento, caratterizzazione e differenziamento verso la linea cardiaca CSC. Non c'è nessun singolo indicatore accettabile per CSCs e un isolamento specifico di basati su marcatore cellula-superficie di CSCs produce meno CSCs. Qui, abbiamo standardizzare un approccio semplice centrifugazione su gradiente per isolare CSCs dal cuore del mouse che è conveniente e si traduce in un maggiore rendimento di CSCs. Questi CSCs isolato è selezionabile per specifici marcatori di superficie cellulare di corto circuito di fluorescenza-attivato delle cellule. Oltre all'isolamento di CSCs, abbiamo fornito un protocollo per cultura CSC, caratterizzazione e differenziamento verso cardiomyocyte lignaggio. Così, vi presentiamo un metodo elegante per isolare, caratterizzare, cultura e differenziare CSCs da cuori di topo adulto (Figura 5).
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Protocol
L'alloggiamento, l'anestesia e sacrificio dei topi sono stati effettuati seguendo il protocollo approvato IACUC dell'University of Nebraska Medical Center.
1. materiali
- Uso 10 a 12-week-old C57BL/6J nero topi maschi, mantenuti in-House presso l'impianto istituzionale degli animali, per l'isolamento delle CSCs. CSCs possono anche essere isolate da topi femmine non gravide.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici necessari, tra cui forbici chirurgiche, bene forbici chirurgiche, gambo curvo forcipe e una lama chirurgica, in autoclave prima l'eutanasia del mouse.
- Preparare il buffer di isolamento di CSC in una condizione sterilizzata e conservarli a 4 ° C sul ghiaccio. Questi tamponi includere polysucrose e una soluzione di sodio diatrizoate regolato ad una densità di 1,077 g/mL, incompleta Dulbecco modificato Medium di Eagle, di 1 x prosciutto soluzione salina (HBSS) equilibrata e delle cellule di cultura-grado 1 x tampone fosfato salino (PBS). Preparare una soluzione 1% collagenosi II stock (filtrata e sterilizzata) e una soluzione di lavoro 0,2% in HBSS.
- Conservare il materiale di coltura del tessuto nella condizione sterilizzata nella biosicurezza mobile, tra cui una capsula di Petri 10mm, una piastra a 6 pozzetti, una piastra a 24 pozzetti, T-25 e T-75 matracci di cultura, 15 mL e 50 mL provette coniche e pipette sierologiche monouso con 40-µm e 100 -filtri cella µm con filtri da 0,22 µm.
- Sterilizzare il 10-µ l, 200-µ l e puntali di 1.000-µ l in autoclave.
- Utilizzare guanti in nitrile senza polvere ed etanolo al 70% per mantenere una condizione sterile in tutto l'esperimento.
- Utilizzare candeggina al 10% come disinfettante.
- Utilizzare commercialmente disponibile mezzo di manutenzione di CSC e cardiomiociti mezzo di differenziazione per la cultura e la differenziazione delle CSCs, rispettivamente.
2. metodo di isolamento di cellule staminali cardiache
- Eutanasia di quattro o cinque adulto uomo (o donna non gravida) topi utilizzando una camera di CO2 . Fissare i bracci di ogni topo su un cartone di dissezione separata con perni o nastri appiccicosi.
- Spruzzare etanolo al 70% sul mouse per sbarazzarsi di germi esterni e mantenere la condizione sterilizzata durante la raccolta del cuore. Fare un'incisione con le forbici al centro dell'addome e tagliare la pelle dall'addome fino al torace in linea retta. Togliere la pelle da entrambi i lati del taglio centrale per cancellare l'area addominale di pelle e peli. Tagliare con forbici e pinzette, il diaframma sotto la gabbia toracica.
- Aprire la cavità toracica del mouse tagliando la gabbia toracica all'interno della cappa. Esporre il cuore e rimuovere il sangue vicino al cuore. Lavare la zona circostante del cuore con PBS ghiacciata per sbarazzarsi di qualsiasi sangue nelle vicinanze del cuore.
- Sezionare il cuore utilizzando pinzette e forbici chirurgiche. Mettere il cuore in una capsula Petri 100 mm contenente 10 mL di PBS ghiacciata.
- Palpitare il cuore mezzo gambo curvo forcipe e rimuovere i residui di sangue all'interno del cuore.
- Utilizzare tutto il cuore per l'isolamento delle CSCs.
- Trasferire tutti i quattro o cinque cuori interi a una provetta conica da 50 mL contenente 10 mL di HBSS ghiacciata. Tenere il tubo sul ghiaccio fino al procedimento successivo.
- Strofinare all'interno e all'esterno di una biosicurezza armadietto con etanolo al 70% per creare un ambiente sterilizzato. Sterilizzare il tubo contenente cuore e gli altri materiali necessari con etanolo al 70%. Inserire il tubo contenente cuore nella biosicurezza armadietto per l'ulteriore elaborazione.
- Trasferire i cuori in una capsula Petri 100 mm contenente 10 mL di HBSS ghiacciata. Lavare nuovamente i cuori di palpazione per rimuovere eventuali residui di sangue all'interno del cuore. Cambiare la soluzione HBSS dopo ogni lavaggio per garantire la completa rimozione del sangue.
- Tagliare i cuori a pezzetti utilizzando forbici chirurgiche bene o una lama chirurgica in una capsula Petri 100 mm contenente 5-7 mL di soluzione HBSS. Tenere ogni cuore con un paio di pinze e utilizzare un paio di forbici chirurgiche bene o una lama chirurgica per tagliare il cuore in pezzi di 2 - 4 mm. Cambiare la soluzione HBSS frequentemente per assicurarsi HBSS privo di sangue. Tritare i cuori nella soluzione di HBSS.
- Centrifugare il tessuto macinato a 500 x g a 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante e tenere il pellet.
- Risospendere il pellet in 5-6 mL di soluzione di 0,2% della collagenosi II in una provetta conica da 50 mL. Il volume di soluzione della collagenosi dovrebbe essere quasi 1,5 - per 2 volte al volume del pellet.
Nota: per la digestione del tessuto, 0,2% collagenosi io e 2,5 U/mL di soluzione di dispase possiamo sostituire collagenosi 0,2% II. Utilizzare un volume quasi uguale di soluzione dispase la collagenosi ho soluzione. - Mescolare bene il pellet con soluzione di 0,2% della collagenosi II agitando il tubo o da dondolo il tubo su un agitatore a 75 x g per 45-60 min a 37 ° C. Agitare vigorosamente il tubo a mano dopo ogni 20-30 min per migliorare la lisi.
- Triturare il mix di tessuto lisato utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL e una punta di pipetta 1 mL per dissociare il grumo di tessuto nella sospensione unicellulare.
Nota: Per ottenere il massimo recupero delle CSCs, triturare il mix di lisi per almeno 5 min. Se i grumi di tessuto sono relativamente grandi, tagliare la punta di una pipetta 1 mL con forbici o una lama chirurgica e utilizzarlo per triturazione. - Fermare la lisi enzimatica del tessuto aggiungendo mezzo di manutenzione CSC commercialmente disponibile. Aggiungere quasi 2-3 volte tanto mezzo di manutenzione come il volume del tessuto lisato nel passaggio 2.14.
- Passare la sospensione cellulare digerito attraverso un colino di cella da 100 µm per rimuovere eventuali pezzi di tessuto non digerito.
- Ripetere il passaggio 2.16 utilizzando un colino di cella da 40 µm.
- Separare le cellule mediante centrifugazione in gradiente di densità. Per la separazione delle cellule, polysucrose e sodio soluzione diatrizoate delicatamente sovrapporre un uguale volume del filtrato. Ad esempio, in primo luogo, aggiungere 20 mL della soluzione di diatrizoate polysucrose e sodio in una provetta conica da 50 mL e poi, aggiungere 20 mL di filtrato dal passaggio 2.17 sopra la soluzione diatrizoate polysucrose e sodio.
Nota: Prewarm la polysucrose e la soluzione di sodio diatrizoate a 37 ° C prima di utilizzare con le cellule. Aggiungere il filtrato dal passaggio 2.17 sopra la soluzione diatrizoate polysucrose e sodio molto lentamente e con cautela per evitare qualsiasi miscelazione delle due soluzioni. Questo è considerato un passo cruciale. - Centrifugare la provetta contenente entrambe le soluzioni a 500 x g per 20 min a temperatura ambiente utilizzando una centrifuga di secchio di oscillazione. Impostare la centrifuga ad una velocità di accelerazione e decelerazione inferiore per evitare di mescolare le due soluzioni e per la corretta separazione delle CSCs. Si tratta di un passo importante nell'isolamento di CSC. Mettere la provetta contenente la miscela gradiente molto lentamente senza disturbo all'interno della centrifuga e impostarlo per centrifugazione.
- Estrarre il buffy-coat insieme soluzione extra dallo strato superiore utilizzando una pipetta 1 mL o una pipetta di Pasteur plastica in una provetta sterilizzata 15 mL. Questo strato Bum conterrà le CSCs.
Nota: Prendere la precauzione supplementare durante il pipettaggio del cappotto buffy di non togliere lo strato di soluzione polysucrose e sodium diatrizoate perché è tossico al CSCs. - Aggiungere un volume uguale di mezzo di manutenzione CSC alla sospensione di cellule dal passaggio 2.20 e mescolare correttamente per neutralizzare il residuo polysucrose e sodio diatrizoate soluzione, se presente.
- Centrifugare la sospensione cellulare sopra a 500 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet in 7-10 mL di medium DMEM incompleta ed e centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 ° C per eliminare qualsiasi residuo polysucrose e sodium diatrizoate soluzione.
- Raccogliere la pallina, che contiene le CSCs purificate.
- Risospendere il pellet in 1 mL di mezzo di manutenzione di CSC, contare il numero di CSC e utilizzare il pellet per la cultura. Per contare il numero di CSC, utilizzare colorazione blu di Trypan e un emocitometro. Con quattro cuori di topo maschio, il rendimento delle CSCs è ~1.8 milioni.
- Seme CSCs in una piastra di coltura 6 pozzetti rivestiti con una soluzione di gelatina 0,02% contenente 0.5% fibronectina. Utilizzare 2 mL di mezzo di manutenzione completa per il seeding. Incubare la piastra di coltura in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2.
- Sostituire il mezzo di coltura CSCs con mezzo di manutenzione completo CSC ogni giorno fino al terzo giorno. Dopo di che, è necessario modificare il mezzo a giorni alterni.
- Determinare la crescita delle CSCs osservandoli al microscopio.
3. cultura manutenzione e passaggio di cellule staminali cardiache
- Cultura il CSCs isolata in un mezzo di manutenzione disponibili in commercio. Sostituire il terreno di coltura con mezzo di manutenzione fresco a giorni alterni. Quando la cultura di CSC ha raggiunto la confluenza, trasferire le CSCs una nuova piastra ricoperta di gelatina e fibronectina, come indicato nel passaggio 2.26. Staccare le CSCs coltivate dal buffer di dissociazione enzimatica delle cellule. Seguire il protocollo standard di dissociazione delle cellule dalla piastra di coltura. In questa fase, CSCs sono considerati al passaggio 0 (P0) fase.
- Cultura P0 CSCs in una gelatina nuova e rivestite di fibronectina piastra in mezzo di manutenzione completo CSC a 37 ° C in un incubatore a CO2 5%, permettono loro di essere confluenti e quindi seguire passo 3.1 per ottenere il passaggio 1 (P1) CSCs. Store P1 CSCs in azoto liquido o utilizzarli per Experia menti.
- Cellule di 0,5 milioni di semi in una piastra a 6 pozzetti o 1 milione cellule in T-25 a mantenere la cultura di CSC nella sua fase iniziale.
- Passaggio CSCs quando diventano 85% - 90% confluenti. I CSC possono essere coltivati in mezzo di manutenzione fino a quattro a sei settimane.
Nota: Mantenere la densità di semina iniziale delle CSCs relativamente alta (40% - 50%) perché, a una minore densità di semina, CSCs possono cambiare la loro morfologia piatta e allungata.
4. caratterizzazione delle cellule staminali cardiache
- Per caratterizzare le CSCs coltivate, osservarli sotto un fago-contrasto o un microscopio a campo chiaro. Posizionare la piastra contenente CSC sull'obiettivo di un microscopio a fluorescenza. Impostare l'ingrandimento abbastanza basso (10 X) per concentrare le cellule. Utilizzare aperture di contrasto di fase per osservare le cellule. Aumentare l'ingrandimento 20x modificando la lente dell'obiettivo e l'aumento di CSCs. l'obiettivo di 40 X di immagine e immagine CSCs. In due giorni, il CSCs appaiono quasi rotonda in forma, ma la dimensione della cella aumenta con il tempo e in sette giorni, CSCs appaiono quasi cilindriche in forma (Figura 1A - 1C).
- Eseguire immunostaining delle CSCs con marcatori di pluripotenza/staminalità (OCT4, SOX2 o Nanog), proliferazione (Ki-67) (Figura 2A - 2D) e cellule di origine cardiaca/progenitrici (Sca-1, NKX2-5 o GATA4) (Figura 3A - 3C).
- Immunostaining delle CSCs, seme 10.000 CSCs in una piastra di coltura 24 pozzetti.
- Il giorno successivo (dopo 18-24 h), fissare le CSCs in 300 µ l di paraformaldeide al 4% per 10 min.
- Lavare le CSCs con 500 µ l di PBS ghiacciata, 3 volte con intervalli di 5 min.
- Permeabilize le CSCs con 300 µ l di 0,2% Triton X-100 diluito in PBS per 10 min.
- Lavare le CSCs con 500 µ l di PBS ghiacciata, 3 volte con intervalli di 5 min.
- Eseguire il blocco delle CSCs con 300 µ l di BSA 1% diluito in PBST (PBS + 0.1% Tween 20) o 300 µ l di siero di pollo normale 10% diluito in PBST per 1 h.
- Incubare le CSCs in 200 µ l di anticorpo primario diluito in blocco soluzione durante la notte a 4 ° C. Diluire l'anticorpo primario come consigliato dal datasheet di anticorpi o secondo la standardizzazione.
- Lavare le CSCs con 500 µ l di PBS ghiacciata, 3 volte con intervalli di 5 min.
- Incubare le CSCs in 200 µ l di anticorpo secondario diluito in soluzione di blocco (Vedi punto 4.2.6) per 1 h a temperatura ambiente. Diluire l'anticorpo secondario come consigliato dal datasheet di anticorpi o secondo la standardizzazione.
- Lavare le CSCs con 500 µ l di PBS ghiacciata, 3 volte con intervalli di 5 min.
- Colorante di contrasto le CSCs con 200 µ l di DAPI (1 µ g/mL) diluito in PBS per 5 min.
- Lavare le CSCs 1 x con 500 µ l di PBS ghiacciata. Quindi, aggiungere 300 µ l di PBS ghiacciata in ciascun pozzetto.
- Eseguire imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza. Seguire le istruzioni di fluorescente di imaging, tali da evitare la luce diretta sulla piastra. Tenere la piastra di coltura sotto il microscopio. Concentrare le cellule a diversi ingrandimenti. Osservare le cellule in contrasto di fase e/o filtri di eccitazione differente e salvare le immagini.
- Conservare la piastra al buio a 4 ° C.
5. differenziazione delle cellule staminali cardiache in cardiomiociti
- Per la differenziazione delle CSCs, seme 500.000 CSCs in una piastra a 6 pozzetti con 2 mL di mezzo di manutenzione disponibile in commercio CSC prewarm (37 ° C).
- Incubare la piastra che contiene le CSCs in incubatore a CO2 a 37 ° C. Consentire le CSCs di allegare e proliferare fino a crescita Sub-confluente. Se il mezzo diventa giallo, è possibile sostituire il terreno di coltura con mezzo di manutenzione fresco.
- Al confluency di 85% - 90%, sostituire il mezzo di manutenzione con 2 mL di prewarm (37 ° C) cardiomiociti mezzo di differenziazione. Incubare la piastra in un incubatore a CO2 a 37 ° C per 2-3 settimane.
- Cambiare il mezzo di differenziazione d. ogni 2-3 osservare la morfologia degli CSCs sotto un microscopio ogni volta durante il mezzo cambia per garantire le condizioni di buona cultura.
- Dopo 12 d della cultura di CSC in mezzo di differenziazione, immagine CSCs per marcatori di differenziazione seguendo un immunostaining standard protocollo (Vedi punti 4.2.1 - 4.2.14). Salvare le immagini fluorescenti per l'espressione di marcatori di cardiomiociti (fig. 4A - 4B).
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Representative Results
Nello studio presente, abbiamo isolato il CSCs da cuori di topo maschio di 10 a 12-week-old C57BL/6J. Qui, abbiamo presentato un metodo semplice per CSC isolamento e caratterizzazione mediante marcatori di pluripotenza. Abbiamo anche presentato un metodo elegante per il differenziamento di CSC e la caratterizzazione delle CSCs che differenziati verso cardiomyocytes lignaggio. Abbiamo osservato una morfologia di forma dell'alberino di CSCs 2 - a 3-giorni-coltivati sotto un microscopio a contrasto di fase (Figura 1A e 1B). Abbiamo trovato un cambiamento nella morfologia delle CSCs alle 7 giorni di cultura in mezzo di manutenzione, durante i quali le cellule staminali diventano allungata (Figura 1). Abbiamo caratterizzato CSCs per marcatori di pluripotenza e abbiamo trovato che essi esprimono OCT4, SOX2 e Nanog (Figura 2A - 2C). Abbiamo anche trovato che CSCs proliferano in terreno di coltura ed esprimono il marker di proliferazione Ki-67 (Figura 2D). Per caratterizzare l'origine cardiaca delle CSCs, abbiamo determinato l'espressione di marcatori cardiaci Sca-1, NKX2-5 e GATA4 in CSCs. Abbiamo trovato un'espressione di marcatori cardiaci in CSCs coltivate (Figura 3A - 3C). Per determinare la differenziazione delle CSCs verso cardiomyocyte lignaggio, abbiamo coltivato CSCs nel mezzo di differenziazione del cardiomyocyte per 12 giorni. Dopo 12 giorni, abbiamo ripreso le CSCs differenziate per i cardiomiociti marcatori actinina e troponina I. Abbiamo osservato che i marcatori dei cardiomiociti sono stati espressi in differenziato CSCs (Figura 4A - 4B). Nel complesso, questi risultati dimostrano che abbiamo isolato con successo CSCs dal cuore del topo e che questi CSCs possono proliferare e differenziarsi verso cardiomyocytes lignaggio.
Figura 1: morfologia delle CSCs colta. Questi pannelli mostrano imaging contrasto di fase delle CSCs coltivate, vale a dire il rappresentante CSCs dopo 2 giorni di coltura in mezzo di manutenzione a (A1), 20x e (A2), 40 X obiettivi, rappresentante CSCs dopo 3 giorni di coltura in mezzo di manutenzione al ( B1) 20 X e (B2), 40 X obiettivi e rappresentante CSCs dopo 7 giorni di coltura in mezzo di manutenzione presso (C1), 20 X e gli obiettivi (C2), 40 X. Le barre di scala sono 100 µm per gli ingrandimenti X 40 e 200 µm per gli ingrandimenti X 20.
Figura 2: caratterizzazione di CSCs per marcatori di pluripotenza. Questi pannelli mostrano l'imaging di fluorescenza rappresentativo delle CSCs coltivate per marcatori di pluripotenza (OCT4, SOX2 e Nanog) e di proliferazione (Ki-67). Pannelli A mostrano espressioni di OCT4 (verde) e DAPI (blu) in CSCs a (A1), 20x e ingrandimenti (A2), 40 X. Pannelli B mostrano espressioni di SOX2 (verde) e DAPI (blu) in CSCs (B1), 20 X e (B2), 40 X ingrandimenti. Pannelli C mostrare espressioni di Nanog (verde) e DAPI (blu) in CSCs (C1), 20 X e (C2), 40 X ingrandimenti. Pannelli D mostrano espressioni di Ki-67 (rosso) e DAPI (blu) in CSCs (D1) X 20 e (D2), 40 X ingrandimenti. Le barre di scala sono 100 µm per gli ingrandimenti X 40 e 200 µm per gli ingrandimenti X 20. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: caratterizzazione di CSCs per marcatori cardiaci. Questi pannelli mostrano l'imaging di fluorescenza rappresentativo delle CSCs coltivate per marcatori cardiaci. Pannelli A mostrano espressioni di Sca-1 (rosso) e DAPI (blu) in CSCs a (A1), 20x e ingrandimenti (A2), 40 X. Pannelli B mostrare espressioni di NKX2-5 (verde) e DAPI (blu) in CSCs (B1), 20 X e (B2), 40 X ingrandimenti. Pannelli C mostrano espressioni di GATA4 (rosso) e DAPI (blu) in CSCs (C1), 20 X e (C2), 40 X ingrandimenti. Le barre di scala sono 100 µm per gli ingrandimenti X 40 e 200 µm per gli ingrandimenti X 20.
Figura 4: caratterizzazione di differenziazione di CSC verso cardiomyocyte lignaggio. Questi pannelli mostrano rappresentante contrasto di fase e formazione immagine di fluorescenza del 12-giorni differenziati CSCs. (A) questo pannello mostra l'espressione del cardiomyocyte marcatore actinina in CSCs differenziato, con (a) un'immagine di fase-contratto, (b ) un immagine di fluorescenza di DAPI (colorazione nucleo), immagine (c) una fluorescenza di actinina (verde) e (d) una nuova immagine di pannelli un - c. Gli ingrandimenti sono 40 X. (B), questo pannello mostra l'espressione della troponina di marcatore del cardiomyocyte I nel differenziato CSCs, con (un) un'immagine fase-contratto, (b) una fluorescenza di DAPI (colorazione nucleo), immagine (c) una fluorescenza di troponina I (verde) e (d) un'immagine unita di pannelli un - c. Gli ingrandimenti sono 40 X. Le barre di scala sono 100 µm per gli ingrandimenti X 40 e 200 µm per gli ingrandimenti X 20. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: rappresentazione schematica delle diverse fasi di differenziazione, cultura e CSC isolamento. Abbiamo usato i cuori chirurgicamente rimossi da quattro a cinque topi adulti per l'isolamento delle CSCs. Il graduale processo di isolamento, la cultura e la differenziazione verso cardiomyocytes lignaggi di CSC sono presentati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I punti critici di questo protocollo di isolamento del CSC sono come segue. 1) una condizione sterilizzata deve essere mantenuta per l'estrazione dei cuori dai topi. Qualsiasi contaminazione durante l'estrazione del cuore può compromettere la qualità della CSC. 2) il sangue deve essere completamente rimosso prima di tritare il cuore, che è fatto da diversi lavaggi di tutto il cuore e il cuore a pezzi con soluzione HBSS. 3) i pezzi di cuore devono essere completamente lisati in sospensione unicellulare con soluzione della collagenosi. 4) la soluzione diatrizoate polysucrose e sodio gradiente per la separazione delle cellule deve essere preriscaldata. 5) il mezzo per la cultura di CSC deve essere preriscaldato. 6) alla confluenza delle CSCs durante la semina in una piastra di coltura dovrebbe essere alta perché, in basso confluency, CSCs possono cambiare la loro morfologia. 7) il numero di CSC dovrebbe essere segnati dopo l'isolamento dal cuore e prima della placcatura in una piastra di coltura. Il numero di CSCs indica l'efficienza dell'isolamento dal cuore. Il conteggio delle CSCs è importante per la semina delle CSCs nella piastra di coltura.
Abbiamo usato i topi adulti per isolare CSCs, che è stato utilizzato da altri ricercatori in modelli di roditori23,28. CSCs possono essere isolate da cuori roditore neonatale29,30 e anche dalla biopsia di un cuore umano31. I protocolli di isolamento CSC precedentemente segnalati hanno alcune limitazioni, ad esempio meno resa, una procedura di isolamento complessi, una lunga durata per differenziazione e meno del cardiomyocyte differenziazione potenziali32,33, 34. protocollo di isolamento il CSC ha presentato qui è semplice: richiede meno tempo ed è conveniente ed efficiente nella resa di CSC. Inoltre, il CSC isolato sono Sca-1+ ve (un indicatore ben accettato per mouse CSCs) (figure 1A1 - 2 di 3). Altri protocolli per la differenziazione delle CSCs, bisogno di tre o quattro settimane35,36. Tuttavia, questo protocollo richiede 12 giorni (figure 4A - 4B). Il gradiente isolamento del CSC basati su centrifugazione presentato qui produce ~1.8 milioni CSCs da cuori di topo maschio quattro.
Anche se la resa delle CSCs è elevata, una limitazione di questo protocollo è l'uniformità e la purezza delle CSCs isolata. Poiché non esiste nessun singolo indicatore accettabile i CSC, è difficile utilizzare un marcatore singolo-cellula-superficie per selezionare CSCs. Tuttavia, CSCs isolato dal presente protocollo può essere utilizzato per ottenere una popolazione uniforme delle CSCs basato su un indicatore specifico o parecchi indicatori di CSCs, utilizzando l'ordinamento fluorescenza-attivato delle cellule. Pertanto, questo metodo di isolamento di CSC è conveniente con un rendimento elevato e ha la possibilità di ottenere una popolazione uniforme di CSC basata su specifiche cellula-superficie marker(s).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato, in parti, dalle sovvenzioni National Institutes of Health HL-113281 e HL116205 a. punti Kumar Mishra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
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