Summary
Het algemene doel van dit artikel is op de standaardisering van het protocol voor de isolatie, karakterisering en differentiatie van cardiale stamcellen (CSCs) vanuit het hart van de volwassen muis. Hier beschrijven we een dichtheid kleurovergang centrifugeren methode om te isoleren lymfkliertest CSCs en uitgewerkte methoden voor CSC cultuur, proliferatie en differentiatie in cardiomyocytes.
Abstract
Myocardinfarct (MI) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Een belangrijk doel van regeneratieve geneeskunde is om aan te vullen van de dode myocard na MI. Hoewel verschillende strategieën zijn gebruikt om te regenereren myocard, blijft stamcel therapie een grote aanpak om te vullen het dode myocardium van een MI-hart. Vergaren van bewijs suggereert de aanwezigheid van resident stam hartcellen (CSCs) in het volwassen hart en hun verstoringen van de hormoonhuishouding en/of paracrine effecten op de cardiale regeneratie. CSC isolatie en hun karakterisering en differentiatie naar myocardcellen, vooral cardiomyocytes, blijft echter een technische uitdaging. In de huidige studie mits we een eenvoudige methode voor de isolatie, karakterisering en differentiatie van CSCs vanuit het hart van de volwassen muis. Hier beschrijven we een dichtheid-gradiëntenmethode voor de isolatie van CSCs, waar het hart wordt verteerd door een oplossing van 0,2% collagenase II. Karakteriseren de geïsoleerde CSCs, we de expressie van CSCs/cardiale markeringen Sca-1, NKX2-5 en GATA4, en markeringen pluripotent/stemness OCT4, SOX2 en Nanog geëvalueerd. Wij ook vastbesloten het potentieel van de proliferatie van geïsoleerde CSCs door hen in een petrischaal te kweken en beoordelen van de expressie van de proliferatie markering Ki-67. Voor het beoordelen van het potentieel van de differentiatie van CSCs, wij zeven tot tien - dagen gekweekte CSCs geselecteerd. Wij overgedragen hen aan een nieuwe plaat met een cardiomyocyte differentiatie medium. Ze worden geïncubeerd in een cel cultuur incubator voor 12 dagen, terwijl het differentiatie-medium wordt gewijzigd om de drie dagen. De gedifferentieerde CSCs express cardiomyocyte-specifieke Markeringen: actinin en troponine ik. Dus, CSCs geïsoleerd met dit protocol hebben stemness en cardiale markeringen, en ze hebben een potentieel voor de proliferatie en differentiatie naar cardiomyocyte bloedlijn.
Introduction
Ischemische hartziekte, met inbegrip van myocardinfarct (MI), is een belangrijke oorzaak van overlijden rond de wereld1. Stamcel therapie voor het regenereren van dode myocard blijft een grote aanpak ter verbetering van de hartfunctie van een MI hart2,3,4,5. Verschillende soorten stamcellen zijn gebruikt om aan te vullen van dode myocard en ter verbetering van de hartfunctie van een MI-hart. Ze kunnen in grote lijnen worden onderverdeeld in embryonale stamcellen6 en volwassen stamcellen. Volwassen stamcellen, verschillende soorten stamcellen gebruikt zijn, zoals het beenmerg-afgeleide mononucleaire cellen7,8, mesenchymale stamcellen afkomstig uit beenmerg9,10, adipeus weefsel 11,12, en13van de navelstreng en CSCs14,15. Stamcellen kunnen bevorderen cardiale regeneratie door verstoringen van de hormoonhuishouding en/of paracrine acties16,17,18,19,20. Echter een belangrijk minpunt van een stamcel therapie is het verkrijgen van een voldoende aantal cellen van de stam die kan verspreiden en/of differentiëren naar een specifieke cardiale lineage21,22. Autologe en allogene transplantatie van stamcellen is een belangrijke uitdaging in stamcel therapie9. CSCs zou een betere benadering voor cardiale regeneratie omdat ze zijn afgeleid van het hart en ze worden gemakkelijker onderscheid gemaakt cardiale lineages dan niet-cardiale cellen van de stam tussen kunnen. Dus, het vermindert het risico van Teratoom. Bovendien zou de endocriene en paracrine gevolgen van CSCs, zoals exosomes en miRNAs die zijn afgeleid van de CSCs, effectiever dan andere soorten stamcellen. Dus, CSCs blijft een betere optie voor cardiale regeneratie23,24.
Hoewel CSCs een betere kandidaat voor cardiale regeneratie in een MI hart als gevolg van hun cardiale oorsprong zijn, is een belangrijke beperking met CSCs minder opbrengst als gevolg van het ontbreken van een efficiënte isolatie-methode. Een andere beperking zou de verminderde differentiatie van CSCs richting cardiomyocytes lineage2,25,26,27. Om te omzeilen deze beperkingen, is het belangrijk voor de ontwikkeling van een efficiënt protocol voor CSC isolatie, karakterisering en differentiatie naar cardiale bloedlijn. Er is geen enkele aanvaardbare marker voor CSCs en een specifieke celoppervlak marker gebaseerde Isolatievan CSCs levert minder CSCs. Hier, standaardiseren wij een eenvoudige kleurverloop centrifugeren benadering CSCs isoleren van de muis hart dat is rendabel en resulteert in een verhoogd rendement van CSCs. Deze geïsoleerde CSCs kunnen worden geselecteerd voor specifieke celoppervlak markers door fluorescentie-geactiveerde cel kortsluiting. Naast CSCs isolatie voorzien we een protocol CSC cultuur, karakterisering en differentiatie naar cardiomyocyte bloedlijn. Dus presenteren we een elegante methode om te isoleren en te karakteriseren, cultuur, CSCs onderscheiden van volwassen muis harten (Figuur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De huisvesting, de verdoving, en het offer van muizen werden uitgevoerd na het goedgekeurde protocol van de IACUC van de Universiteit van Nebraska Medical Center.
1. materialen
- Gebruik 10 - tot 12-weken oude C57BL/6J zwarte mannelijke muizen, in-house bewaard bij de institutionele dier faciliteit, voor de isolatie van CSCs. CSCs ook kunnen worden geïsoleerd van niet-drachtige vrouwelijke muizen.
- Alle noodzakelijke chirurgische instrumenten, met inbegrip van chirurgische scharen, fijn chirurgische schaar, pincet gebogen schacht en een chirurgisch mes, in autoclaaf steriliseren hen vóór de euthanasie van de muis.
- CSC isolatie buffers in een gesteriliseerde voorwaarde voor te bereiden en hen bewaren bij 4 ° C op ijs. Deze buffers zijn polysucrose en een natrium diatrizoate oplossing aangepast aan een dichtheid van 1.077 g/mL, onvolledige Dulbecco van gemodificeerde Eagle's Medium, 1 x Ham evenwichtig zoutoplossing (HBSS) en cel cultuur-grade 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Een 1% collagenase II stockoplossing (gefilterd en gesteriliseerd) en een 0,2%-werkoplossing in HBSS voorbereiden.
- Houd de weefselkweek materialen in de gesteriliseerde staat in het biosafety kabinet, met inbegrip van een petrischaal 10 mm, een 6-well-plate, een 24-well-plate, T-25 en T-75 cultuur kolven, 15 mL en 50 mL conische buizen en wegwerp Serologische pipetten met 40-µm en 100 -µm cel vulinrichtingen met 0.22-µm filters.
- De 10-µL 200-µL en de uiteinden van de Pipet van de 1.000-µL door autoclaaf steriliseren.
- Poedervrije nitril handschoenen en 70% ethanol gebruiken om te handhaven van de steriele toestand gedurende het gehele experiment.
- 10% bleekwater gebruiken als een ontsmettingsmiddel.
- Verkrijgbare CSC onderhoud medium en cardiomyocytes differentiatie medium voor de cultuur en de differentiatie van CSCs, respectievelijk gebruiken.
2. isolatie methode van cardiale cellen van de stam
- Vier tot vijf volwassen mannetje (of niet-drachtige vrouwtje) euthanaseren muizen met behulp van een CO2 -kamer. Herstellen van elke muis wapens op een aparte dissectie karton met pinnen of kleverige tapes.
- Spray 70% ethanol op de muis te halen afhelpen van buiten kiemen en de gesteriliseerde voorwaarde te handhaven tijdens het oogsten van het hart. Maken van een sneetje met een schaar in het midden van de buik en snijd de huid van de buik tot aan de thorax in een rechte lijn. Verwijder de huid aan beide zijden van de middelste cut te wissen van de buikstreek van huid en haren. Met behulp van schaar en pincet, snijd het middenrif onder de ribbenkast.
- Open de borstholte van de muis door het snijden van de ribbenkast binnen de kap. Het hart bloot en verwijder het bloed in de buurt van het hart. Wassen van de omgeving van het hart met ijskoude PBS om zich te ontdoen van alle bloed in de nabijheid van het hart.
- Het ontleden van het hart met behulp van chirurgische schaar en pincet. Plaats het hart in een 100-mm petrischaal met 10 mL ijskoud PBS.
- Palpitate van het hart met gebogen schacht pincet en verwijder het resterende bloed in het hart.
- Gebruik het hele hart voor de isolatie van CSCs.
- Alle vier of vijf hele hart overbrengen in een conische buis van 50 mL, met 10 mL ijskoud HBSS. Houd de buis op ijs totdat zij worden verwerkt.
- Vegen binnen en buiten een bioveiligheid kabinet met 70% ethanol een gesteriliseerde omgeving te creëren. Het steriliseren van de hart-bevattende buis en andere benodigde materialen met 70% ethanol. Plaats de buis hart-bevattende in het biosafety kabinet voor verdere verwerking.
- De harten overbrengen in een 100-mm petrischaal met 10 mL ijskoud HBSS. De harten weer wassen door Palperende als u wilt verwijderen van alle resterende bloed in het hart. Wijzig de HBSS oplossing na elke wasbeurt om de volledige verwijdering van het bloed.
- Snijd de harten in kleine stukjes met fijne chirurgische schaar of een chirurgisch mes in een 100-mm petrischaal met 5-7 mL HBSS oplossing. Houd elk hart met een paar pincet en gebruik een paar chirurgische fijne schaar of een chirurgisch mes te snijden het hart in stukken van 2 - tot 4-mm. Wijzig de HBSS oplossing vaak om bloed-vrije HBSS. Mince de harten in de HBSS oplossing.
- Centrifugeer het gehakt weefsel bij 500 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. negeren het supernatant en houden de pellet.
- Resuspendeer de pellet in 5-6 mL 0,2% collagenase II oplossing in een conische buis van 50 mL. Het volume van collagenase oplossing moet bijna 1.5 - tot 2 keer aan het volume van het pellet.
Opmerking: voor de vertering van weefsel, 0,2% collagenase ik en 2.5 U/mL dispase oplossing 0,2% collagenase II kan vervangen. Gebruik een bijna gelijke hoeveelheid dispase oplossing voor de collagenase ik oplossing. - Grondig Meng de pellet met 0,2% collagenase II oplossing door schudden van de buis of het schommelen van de buis in een roteerapparaat bij 75 x g gedurende 45-60 minuten bij 37 ° C. Schud de buis krachtig met de hand na elke 20-30 min ter verbetering van de lysis.
- Triturate de lysed weefsel mix met behulp van een serologische 5 mL-pipet en een tip 1 mL pipet te distantiëren van de forfaitaire weefsel in de eencellige schorsing.
Opmerking: Als u de maximale terugwinning van de CSCs, triturate de lysis mix voor minstens 5 min. Als de weefsel klontjes relatief groot zijn, knip het uiteinde van een 1 mL pipet tip met schaar of een chirurgisch mes en gebruiken voor verpulvering. - Stop de enzymatische lysis van het weefsel door verkrijgbare CSC onderhoud medium toe te voegen. Bijna 2-3 x zo veel onderhoud medium als het volume van het lysed weefsel in stap 2.14 toevoegen.
- De verteerd celsuspensie passeren door een zeef 100-µm cel te verwijderen alle stukken onverteerd weefsel.
- Herhaal stap 2.16 met behulp van een 40-µm cel zeef.
- Scheid de cellen via dichtheid kleurovergang centrifugeren. Voor de scheiding van cellen, zachtjes overlay een gelijk volume van het filtraat over polysucrose en natrium diatrizoate oplossing. Bijvoorbeeld, eerst, voeg toe 20 mL polysucrose en natrium diatrizoate-oplossing in een conische buis van 50 mL en dan, Voeg 20 mL van het filtraat uit stap 2.17 ten opzichte van de polysucrose en natrium diatrizoate-oplossing.
Opmerking: Prewarm de polysucrose en natrium diatrizoate oplossing bij 37 ° C voor gebruik met de cellen. Het filtraat uit stap 2.17 ten opzichte van de polysucrose en natrium diatrizoate-oplossing toevoegen zeer zorgvuldig en langzaam om te voorkomen dat enige mengen van de twee oplossingen. Dit wordt beschouwd als een cruciale stap. - Centrifugeer de buis met beide oplossingen bij 500 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een centrifuge schommel emmer. Stel de centrifuge met een lagere versnelling en vertraging om te voorkomen dat de twee oplossingen mengen en correcte scheiding van de CSCs. Dit is een belangrijke stap in de CSC isolatie. Zet de buis die de kleurovergang mengsel zeer langzaam zonder verstoring binnen de centrifuge en stel het voor centrifugeren.
- Haal de buffy coat samen met extra oplossing uit de bovenste laag met een 1 mL pipet of een plastic pipet van Pasteur in een gesteriliseerde tube van 15 mL. Deze buffy laag bevat de CSCs.
Opmerking: Neem extra voorzorgsmaatregelen tijdens de pipetteren van de buffy coat niet te nemen uit de polysucrose en natrium diatrizoate oplossing laag, omdat het is giftig voor CSCs. - Toevoegen van een gelijk volume van CSC onderhoud medium aan de celsuspensie uit stap 2.20 en meng het goed te neutraliseren de residuele polysucrose en natrium diatrizoate oplossing, indien aanwezig.
- Centrifugeer het bovenstaande celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 7-10 mL van onvolledig DMEM medium samen en Centrifugeer het bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C om zich te ontdoen van eventuele resterende polysucrose en natrium diatrizoate oplossing.
- De pellet, waarin de gezuiverde CSCs verzamelen.
- Resuspendeer de pellet in 1 mL van CSC onderhoud medium, CSC tellen en de pellet te gebruiken voor cultuur. Gebruikt om te tellen het aantal CSC, Trypan blauw kleuring en een hemocytometer. De opbrengst van CSCs is met vier mannelijke muizen harten, ~1.8 miljoen.
- Zaad de CSCs in een 6-well cultuur bord bedekt met een oplossing van 0,02% gelatine met 0,5% fibronectine. Gebruik 2 mL compleet onderhoud voedingsbodem voor het zaaien. Incubeer de plaat van de cultuur in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
- Vervang het medium van cultuur CSCs met volledige CSC onderhoud medium elke dag tot de derde dag. Na dat, door het medium op alternatieve dagen te wijzigen.
- De groei van de CSCs bepalen door het observeren van hen onder een microscoop.
3. cultuur onderhoud en Passage van de cardiale cellen van de stam
- Cultuur van de geïsoleerde CSCs in een medium verkrijgbare onderhoud. Vervang het kweekmedium met verse onderhoud medium op alternatieve dagen. Wanneer de CSC cultuur heeft bereikt confluentie, overbrengen in de CSCs een nieuwe plaat bekleed met gelatine en fibronectine, zoals vermeld in stap 2.26. Loskoppelen van de gekweekte CSCs door enzymatische cel dissociatie buffer. Volg het standaardprotocol van cel dissociatie van de cultuur-plaat. In dit stadium, CSCs worden beschouwd als bij passage 0 (P0) stadium.
- Cultuur P0 CSCs in een nieuwe gelatine fibronectine beklede plaat in volledige CSC onderhoud medium bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator, laten worden confluente en volg stap 3.1 te krijgen passage 1 (P1) CSCs. winkel P1 CSCs in vloeibare stikstof of gebruiken voor uit menten.
- Zaad 0,5 miljoen cellen in een 6-well-plate of 1 miljoen cellen in T-25 te houden van de CSC cultuur in haar beginstadium.
- Passage de CSCs wanneer ze 85-90% heuvels. CSCs kunnen worden gekweekt in het onderhoud medium maximaal vier tot zes weken.
Opmerking: Houd de eerste seeding dichtheid van de CSCs relatief hoog (40% - 50%), omdat, bij een lagere seeding dichtheid, de CSCs kunnen veranderen hun morfologie plat en langgerekt.
4. karakterisering van de cardiale cellen van de stam
- Karakteriseren de gekweekte CSCs, zien ze onder een bacteriofaag-contrast of een helder-veld Microscoop. Plaats de CSC-bevattende plaat op de doelstelling van een fluorescente microscoop. Stel het vergrotingsniveau vrij laag (10 X) om zich te concentreren op de cellen. Gebruik fase contrast diafragma te observeren van de cellen. Het zoompercentage op 20 X door het veranderen van het objectief en de CSCs. verhoging van de doelstelling tot 40 X beeld- en beeld de CSCs. In twee dagen, de CSCs lijken bijna rond van vorm, maar de grootte van de verhogingen van de cel met de tijd, en in zeven dagen, de CSCs verschijnen bijna cilindrisch in vorm (figuur 1A - 1 C).
- Uitvoeren van immunokleuring van de CSCs met markers van pluripotent/stemness (OCT4, SOX2 of Nanog), proliferatie (Ki-67) (figuur 2A - 2D) en cardiale oorsprong/voorlopercellen (Sca-1, NKX2-5 of GATA4) (figuur 3A - 3 C).
- Zaad voor de immunokleuring van de CSCs, 10.000 CSCs in een 24-well cultuur plaat.
- De volgende dag (na 18-24 h), bevestigen de CSCs in 300 µL van 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten.
- Wassen van de CSCs met 500 µL van ijskoude PBS, 3 x met 5-min intervallen.
- Permeabilize de CSCs met 300 µL van 0,2% Triton X-100 verdund in PBS gedurende 10 minuten.
- Wassen van de CSCs met 500 µL van ijskoude PBS, 3 x met 5-min intervallen.
- Uitvoeren van het blokkeren van de CSCs met 300 µL van 1% BSA verdund in PBST (PBS + 0,1% Tween 20) of 300 µL van 10% normale kip serum verdund in PBST gedurende 1 uur.
- Incubeer de CSCs in 200 µL van primair antilichaam verdund in het blokkeren van oplossing 's nachts bij 4 ° C. Verdun het primaire antilichaam zoals aanbevolen door het gegevensblad van antilichamen of per normalisatie.
- Wassen van de CSCs met 500 µL van ijskoude PBS, 3 x met 5-min intervallen.
- Incubeer de CSCs in 200 µL van secundair antilichaam verdund in het blokkeren van de oplossing (zie stap 4.2.6) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verdun het secundaire antilichaam zoals aanbevolen door het gegevensblad van antilichamen of per normalisatie.
- Wassen van de CSCs met 500 µL van ijskoude PBS, 3 x met 5-min intervallen.
- Counterstain de CSCs met 200 µL van de DAPI (1 µg/mL) verdund in PBS voor 5 min.
- Wassen van de CSCs 1 x met 500 µL van ijskoude PBS. Dan, voeg 300 µL van ijskoude PBS in elk putje.
- Geschikt zijn met behulp van een fluorescentie Microscoop uitvoeren Volg de aanwijzingen van TL imaging, zodanig vermijden van direct licht op de plaat. Houd de plaat van de cultuur onder de Microscoop. Het richten van de cellen in verschillende vergrotingen. Observeren van de cellen onder fase contrast en/of verschillende excitatie filters en de afbeeldingen opslaan.
- Opslaan van de plaat in het donker bij 4 ° C.
5. de differentiatie van de cardiale cellen van de stam in Cardiomyocyte
- Zaad voor de differentiatie van CSCs, 500.000 CSCs in een 6-well plaat met 2 mL prewarm (37 ° C) verkrijgbare CSC onderhoud voedingsbodem.
- Incubeer de plaat met de CSCs in een CO2 incubator bij 37 ° C. Laat de CSCs te hechten en vermenigvuldigen tot sub confluente groei. Als het medium omslaat naar geel, vervangt u het kweekmedium met verse onderhoud medium.
- Op 85-90% confluentie, vervangen door het onderhoud medium 2 mL prewarm (37 ° C) cardiomyocytes differentiatie medium. Incubeer de plaat in een CO2 incubator bij 37 ° C gedurende maximaal 2-3 weken.
- Het medium van de differentiatie elke 2-3 d. observeren morfologie van de de CSCs onder een Microscoop telkens tijdens het medium wijzigen om ervoor te zorgen de goede kweekomstandigheden wijzigen
- Na 12 d van CSC cultuur in differentiatie medium, afbeelding de CSCs voor differentiatie markeertekens na een standaard immunokleuring protocol (Zie stappen 4.2.1 - 4.2.14). Sla de fluorescerende afbeeldingen voor de expressie van cardiomyocytes markers (figuur 4A - 4B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de huidige studie geïsoleerd we CSCs van 10 naar 12-weken oude C57BL/6J mannelijke muizen harten. Wij hebben hier een eenvoudige methode voor CSC isolatie en karakterisering met behulp van merkers van pluripotent gepresenteerd. We presenteerde ook een elegante methode voor CSC differentiatie en de karakterisatie van CSCs die gedifferentieerd naar cardiomyocytes bloedlijn. We hebben vastgesteld een spindel vorm morfologie van 2 - tot 3-dagen-gekweekte CSCs onder een Microscoop fase contrast (figuur 1A en 1B). We vonden dat een verandering in de morfologie van CSCs op 7 dagen van de cultuur in onderhoud medium, gedurende welke tijd de stamcellen worden langwerpige (Figuur 1 c). We CSCs gekenmerkt voor markers van pluripotent en vond dat ze OCT4, SOX2 en Nanog (figuur 2A - 2 C geven). We vonden ook dat CSCs in kweekmedium vermenigvuldigen en uiten van de proliferatie markering Ki-67 (figuur 2D). Het karakteriseren van de cardiale oorsprong van CSCs, vastbesloten wij de expressie van cardiale markers Sca-1, NKX2-5 en GATA4 in CSCs. We vonden een expressie van cardiale markers in de gekweekte CSCs (figuur 3A - 3 C). Om te bepalen van de differentiatie van CSCs richting cardiomyocyte bloedlijn, gekweekt we CSCs in cardiomyocyte differentiatie medium voor 12 dagen. Na 12 dagen, we de gedifferentieerde CSCs voor de cardiomyocyte markeringen actinin en troponine beeld ik. We hebben vastgesteld dat cardiomyocyte markeringen werden uitgedrukt in gedifferentieerde CSCs (figuur 4A - 4B). Over het geheel genomen is deze resultaten tonen aan dat we met succes geïsoleerd CSCs van muis hart en dat deze CSCs kunnen vermenigvuldigen en onderscheid naar bloedlijn van cardiomyocytes.
Figuur 1: morfologie van gekweekte CSCs. Deze panelen Toon fase contrast beeldvorming van gekweekte CSCs, namelijk vertegenwoordiger CSCs na 2 dagen van kweken in onderhoud medium bij (A1) 20 X en (A2) 40 X doelstellingen, vertegenwoordiger CSCs na 3 dagen van het kweken in onderhoud medium bij) B1) 20 X en (B2) 40 X doelstellingen en vertegenwoordiger CSCs na 7 dagen van kweken in onderhoud medium bij (C1) 20 X en (C2) 40 X doelstellingen. De schaal bars zijn 100 µm voor de 40 X vergrotingen en 200 µm voor de 20 X vergrotingen.
Figuur 2: karakterisering van CSCs voor pluripotent markeringen. Deze panelen tonen representatieve fluorescentie beeldvorming van gekweekte CSCs voor markers van pluripotent (OCT4, SOX2 en Nanog) en proliferatie (Ki-67). Panelen A vertonen uitingen van OCT4 (groen) en de DAPI (blauw) CSCs op (A1) 20 X en (A2) 40 X vergrotingen. Panelen B vertonen uitingen van SOX2 (groen) en de DAPI (blauw) CSCs op (B1) 20 X en (B2) 40 X vergrotingen. Panelen C Toon uitingen van Nanog (groen) en de DAPI (blauw) in CSCs op (C1) 20 X en (C2) 40 X vergrotingen. Panelen D vertonen uitingen van Ki-67 (rood) en de DAPI (blauw) CSCs op (D1) 20 X en (D2) 40 X vergrotingen. De schaal bars zijn 100 µm voor de 40 X vergrotingen en 200 µm voor de 20 X vergrotingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: karakterisering van CSCs voor cardiale markeringen. Deze panelen weergeven representatieve fluorescentie beeldvorming van gekweekte CSCs voor cardiale markeringen Panelen A weergeven uitingen van Sca-1 (rood) en de DAPI (blauw) in CSCs op (A1) 20 X en (A2) 40 X vergrotingen. Panelen B vertonen uitingen van NKX2-5 (groen) en de DAPI (blauw) CSCs op (B1) 20 X en (B2) 40 X vergrotingen. C panelen vertonen uitingen van GATA4 (rood) en de DAPI (blauw) CSCs op (C1) 20 X en (C2) 40 X vergrotingen. De schaal bars zijn 100 µm voor de 40 X vergrotingen en 200 µm voor de 20 X vergrotingen.
Figuur 4: karakterisering van CSC differentiatie naar cardiomyocyte bloedlijn. Deze panelen Toon vertegenwoordiger fase contrast en fluorescentie beeldvorming van 12-dagen gedifferentieerde CSCs. (A) dit paneel toont de uitdrukking van cardiomyocyte markering actinin in gedifferentieerde CSCs, met (a) een fase-contract beeld, (b ) een beeld van de fluorescentie van de DAPI (kleuring nucleus), (c) een fluorescentie beeld van actinin (groen) en (d) een samengevoegde afbeelding van panelen een - c. De vergrotingen zijn 40 X. (B) dit paneel toont de uitdrukking van de cardiomyocyte marker troponine ik in CSCs, met (een) een beeld van de fase-contract, (b) een fluorescentie beeld van de DAPI (kleuring kern), (c) een fluorescentie beeld van gedifferentieerde troponine I (groen), en (d) een samengevoegde afbeelding van panelen een - c. De vergrotingen zijn 40 X. De schaal bars zijn 100 µm voor de 40 X vergrotingen en 200 µm voor de 20 X vergrotingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: schematische weergave van de verschillende stappen van de CSC isolatie, cultuur en differentiatie. We gebruikten Operatief verwijderde harten van vier naar vijf volwassen muizen voor de isolatie van CSCs. De stapsgewijze proces van CSC isolatie, cultuur en differentiatie naar cardiomyocytes lineages worden gepresenteerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritische stappen van dit protocol van de isolatie CSC zijn als volgt. 1) een gesteriliseerde voorwaarde moet worden gehandhaafd voor de extractie van de harten van de muizen. Elke besmetting tijdens de extractie van het hart kan het compromis van de kwaliteit van de CSCs. 2) het bloed moet volledig worden verwijderd voordat het hakken van het hart, dat wordt gedaan door meerdere wasbeurten van het hele hart en het hart stukken met HBSS oplossing. 3) het hart stukken moeten volledig worden lysed in een eencellige ophanging met collagenase oplossing. 4) de polysucrose en natrium diatrizoate kleurovergang oplossing voor de scheiding van de cellen moet worden voorverwarmde. 5) het medium voor de CSC cultuur moet worden voorverwarmde. 6) de samenvloeiing van de CSCs tijdens het zaaien in een cultuur schotel moet hoog zijn omdat, in lage confluentie, CSCs kunnen veranderen hun morfologie. 7) het CSC-nummer moet worden gescoord na het isolement van het hart en vóór de beplating in een cultuur schotel. Het aantal CSCs geeft de efficiëntie van het isolement van het hart. Het tellen van de CSCs is belangrijk voor het zaaien van de CSCs in de cultuur-plaat.
Wij volwassen muizen gebruikt om te isoleren CSCs, die is gebruikt door andere onderzoekers in knaagdier modellen23,28. CSCs kunnen worden geïsoleerd van neonatale knaagdier harten29,30 en zelfs van de biopsie van een menselijk hart31. De eerder gerapporteerde CSC isolatie protocollen hebben enkele beperkingen, zoals minder opbrengst, een complexe isolatie-procedure, een lange duur voor differentiatie, en minder cardiomyocyte differentiatie potentiële32,33, 34. de CSC isolatie protocol hier gepresenteerd is eenvoudig: het kost minder tijd en is rendabel en efficiënter in CSC opbrengst. Bovendien zijn de geïsoleerde CSCs Sca-1+ ve (een goed aanvaarde marker voor muis CSCs) (cijfers 1A1 - 3 c 2). Andere protocollen nodig voor de differentiatie van CSCs, drie tot vier weken35,36. Dit protocol vereist echter 12 dagen (cijfers 4A - 4B). De kleurovergang centrifugeren gebaseerde CSC isolatie gepresenteerde levert ~1.8 miljoen CSCs uit vier mannelijke muizen hart.
Hoewel de opbrengst van CSCs hoog is, wordt een beperking van dit protocol is de uniformiteit en de zuiverheid van de geïsoleerde CSCs. Omdat er geen enkel aanvaardbaar marker voor CSCs, is het moeilijk te gebruiken van een één-cel-oppervlakte marker CSCs selecteren. Echter, CSCs geïsoleerd door dit protocol kunnen worden gebruikt om een uniforme populatie van CSCs op basis van een specifieke marker of verschillende merkers van CSCs, met behulp van fluorescentie-geactiveerde cel sorteren. Deze methode van CSC isolatie is rendabel met een hoge opbrengst en heeft dus de mogelijkheid om een uniforme CSC bevolking op basis van specifieke celoppervlak marker(s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt in delen, ondersteund door de National Institutes of Health subsidies HL-113281 en HL116205 naar de Paras Kumar Mishra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146 (2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
- Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
- Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
- Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
- Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
- Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
- Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
- Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
- Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
- Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162 (2015).
- Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
- Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
- Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
- Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
- Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
- Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
- Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
- Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
- Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265 (2011).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet? Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
- Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
- Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
- Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
- Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
- Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
- Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
- Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).
