Summary
Det övergripande målet med denna artikel är att standardisera protokollet för isolering, karakterisering och differentiering av hjärt stamceller (CSCs) från vuxen mus hjärtat. Här, beskriver vi en täthet lutning centrifugering metod att isolera murina CSCs och utarbetade metoder för CSC kultur, proliferation och differentiering in hjärtmuskelcellerna.
Abstract
Hjärtinfarkt (MI) är en ledande orsak till sjuklighet och dödlighet runt om i världen. Ett viktigt mål för regenerativ medicin är att fylla på den döda hjärtmuskeln efter MI. Även om flera strategier har använts för att regenerera myokardiet, fortfarande stamcellsterapi en större strategi för att fylla på den döda hjärtmuskeln i en MI-hjärta. Ackumulerande bevis tyder på förekomsten av bosatta hjärt stamceller (CSCs) i vuxen hjärtat och deras endokrina eller parakrin effekter på hjärtats förnyelse. CSC isolering samt karakterisering och differentiering mot hjärtmuskelceller, särskilt hjärtmuskelceller, förblir dock en teknisk utmaning. I den aktuella studien gett vi en enkel metod för isolering, karakterisering och differentiering av CSCs från vuxen mus hjärtat. Här beskriver vi en densitet gradient metod för isolering av CSCs, där hjärtat är smälta av en 0,2% kollagenas II lösning. För att karakterisera de isolerade CSCs, utvärderade vi uttrycket av CSCs/hjärt markörer Sca-1, NKX2-5 och GATA4, och pluripotency/stemness markörer OCT4, SOX2 och Nanog. Vi har också konstaterat isolerade CSCs spridning potential genom att odla dem i en petriskål och utvärdera uttryck för spridning markören Ki-67. För att utvärdera CSCs differentiering potential, vi valt ut sju till tio - dagar odlade CSCs. Vi överfört dem till en ny platta med en hjärtmuskelcellen differentiering medium. De inkuberas i en cell kultur inkubator i 12 dagar, medan differentiering mediet byts var tredje dag. De differentierade CSCs express hjärtmuskelcellen-specifika markörer: actinin och troponin jag. Således, CSCs isolerad med detta protokoll har stemness och kardiella markörer, och de har en potential för spridning och differentiering mot hjärtmuskelcellen härstamning.
Introduction
Ischemisk hjärtsjukdom, inklusive hjärtinfarkt (MI), är en viktig orsak till dödsfall runt om världen1. Stamcellsterapi för regenererande döda hjärtmuskeln förblir en viktig strategi för att förbättra hjärtfunktionen en MI hjärtat2,3,4,5. Olika typer av stamceller har använts att fylla på döda hjärtmuskeln och förbättra hjärtfunktionen i en MI-hjärta. De kan i huvudsak delas in i embryonala stamceller6 och vuxna stamceller. I vuxna stamceller, har olika typer av stamceller använts, såsom benmärg-derived mononukleära celler7,8, mesenkymala stamceller som härstammar från benmärgen9,10, fettvävnad 11,12, och navelsträngen13och CSCs14,15. Stamceller kan främja hjärt regenerering genom endokrina eller parakrin åtgärder16,17,18,19,20. En stor begränsning av stamcellsterapi är dock att få ett tillräckligt antal stamceller som kan föröka sig och differentiera mot en specifik hjärt härstamning21,22. Autologa och prövningar transplantation av stamceller är en viktig utmaning i stamceller terapi9. CSCs kan vara en bättre strategi för hjärtats förnyelse eftersom de härstammar från hjärtat och de kan skiljas lättare in i hjärt härstamningar än icke-kardiell stamceller. Det minskar därför risken för teratoma. Dessutom kunde endokrina och parakrin effekterna av CSCs, såsom exosomes och MicroRNA härrör från CSCs, vara mer effektivt än andra typer av stamceller. CSCs förblir således ett bättre alternativ för hjärtats förnyelse23,24.
Även om CSCs är en bättre kandidat för hjärtats förnyelse i ett MI hjärta på grund av deras hjärt ursprung, är en stor begränsning med CSCs mindre avkastning på grund av bristen på en effektiv isolering metod. En annan begränsning kan vara nedsatt differentiering av CSCs mot hjärtmuskelceller lineage2,25,26,27. För att kringgå dessa begränsningar, är det viktigt att utveckla en effektiv protokoll för CSC isolering, karakterisering och differentiering mot hjärt härstamning. Det finns ingen enda godtagbara markör för CSCs och en specifik cellytan markör-baserade isolering av CSCs ger mindre CSCs. Här, standardisera vi en enkel lutning centrifugering metod för att isolera CSCs från mus hjärtat som är kostnadseffektiv och resulterar i en ökad avkastning av CSCs. Dessa isolerade CSCs kan väljas för särskilda cell-yta markörer genom fluorescens-aktiverad cell kortsluter. Förutom CSCs isolering som vi ett protokoll för CSC kultur, karakterisering och differentiering mot hjärtmuskelcellen härstamning. Således presenterar vi en elegant metod för att isolera, karakterisera, kultur, och differentiera CSCs från vuxen mus hjärtan (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I bostäder, anestesi och offrandet av möss utfördes efter godkänd IACUC protokollet av University of Nebraska Medical Center.
1. material
- Använd 10 - till 12-vecka-gammal C57BL/6J svart hanmöss, hålls internt på institutionella djuranläggningen, för isolering av CSCs. CSCs kan också isoleras från icke-dräktiga honmöss.
- Sterilisera alla nödvändiga kirurgiska instrument, inklusive kirurgisk sax, fina kirurgiska saxar, krökt skaft pincett och en kirurgisk blad, genom autoklavering dem innan dödshjälpen av musen.
- Förbereda CSC isolering buffertar i en steriliserad skick och lagra dem vid 4 ° C på is. Dessa buffertar inkluderar polysucrose och en natrium diatrizoate lösning anpassas till en densitet på 1.077 g/mL, ofullständig Dulbecco's modified örnens Medium, 1 x Hams balanserad saltlösning (HBSS) och cell kultur-grade 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Förbered en 1% kollagenas II stamlösning (filtreras och steriliserad) och en 0,2% fungerande lösning i HBSS.
- Hålla vävnadsodling material i steriliserat skick i biosäkerhet skåp, inklusive en 10 mm petriskål, en 6-well platta, en 24-well platta, T-25 och T-75 kultur kolvar, 15 mL och 50 mL koniska rör, och disponibel serologiska pipetter med 40 µm och 100 -µm cell silar med 0,22 µm filter.
- Sterilisera den 10-µL och 200-µL 1000-µL pipettspetsar av autoklav.
- Använda puderfria nitrilhandskar och 70% etanol för att upprätthålla ett sterilt skick under hela försöket.
- Använd 10% blekmedel som desinfektionsmedel.
- Använda kommersiellt tillgängliga CSC underhåll medium och hjärtmuskelceller differentiering medium för kultur och differentiering av CSCs, respektive.
2. isolering metod för hjärt stamceller
- Avliva fyra till fem vuxen hane (eller icke-gravid kvinna) möss använder en CO2 kammare. Fixa varje musens armar på en separat dissektion kartong med stift eller klibbiga band.
- Spray 70% etanol på musen för att bli av med utanför bakterier och upprätthålla steriliserat skick under skörd av hjärtat. Gör ett snitt med sax i mitten av buken och skära huden från buken upp till bröstkorgen i en rak linje. Ta bort skinnet från båda sidor av middle cut att rensa buken av hud och hår. Använda sax och pincett, skära membranet nedanför bröstkorgen.
- Öppna brösthålan musen genom att skära bröstkorgen inuti huven. Exponera hjärtat och ta bort blodet nära hjärtat. Tvätta området runt hjärtat med iskall PBS bli av blod i närheten av hjärtat.
- Dissekera hjärtat med kirurgisk sax och pincett. Placera mitt i en 100 mm petriskål innehållande 10 mL iskallt PBS.
- Palpitate hjärtat med krökt skaft tång och ta bort kvarvarande blodet inne i hjärtat.
- Använd hela hjärtat för isolering av CSCs.
- Överföra alla fyra eller fem hela hjärtan till en 50 mL konisk slang innehållande 10 mL iskallt HBSS. Håll röret på is tills vidare bearbetning.
- Torka inuti och utanför en biosäkerhet skåp med 70% etanol att skapa en steriliserad miljö. Sterilisera hjärtat-innehållande röret och andra material som behövs för med 70% etanol. Ställ hjärtat-innehållande röret i biosäkerhet skåp för vidare bearbetning.
- Överföra hjärtan till en 100 mm petriskål innehållande 10 mL iskallt HBSS. Tvätta hjärtan igen av palperas för att ta bort eventuella kvarvarande blod inne i hjärtat. Ändra HBSS lösningen efter varje tvätt att säkerställa fullständig borttagning av blodet.
- Skär hjärtan i små bitar med fina kirurgisk sax eller en kirurgisk kniv i en 100 mm petriskål innehållande 5-7 mL HBSS lösning. Håll varje hjärta med ett par pincett och Använd ett par kirurgiska fin sax eller en kirurgisk kniv för att skära hjärtat i 2 - till 4-mm bitar. Ändra HBSS lösningen ofta för att säkerställa att blod-fri HBSS. Finhacka hjärtan i HBSS lösningen.
- Centrifugera malet vävnaden vid 500 x g vid 4 ° C i 5 min. Kassera supernatanten och hålla pelleten.
- Återsuspendera pelleten i 5-6 mL 0,2% kollagenas II lösning i en 50 mL konisk slang. Volymen av kollagenas lösning bör vara nästan 1,5 till 2 gånger volymen av pelleten.
Obs: för nedbrytning av vävnad, 0,2% kollagenas jag och 2,5 U/mL dispase lösning kan ersätta 0,2% kollagenas II. Använd en nästan lika stor volym av dispase lösning till kollagenas jag lösning. - Grundligt blanda pelleten med 0,2% kollagenas II lösning genom att agitera röret eller gunga röret på en shaker på 75 x g under 45-60 minuter vid 37 ° C. Skaka tuben kraftigt för hand efter varje 20-30 min att förbättra Lys.
- Pulverisera lyserat vävnad mixen med 5 mL serologiska pipett och en 1 mL pipettspetsen för att dissociera vävnad klump till de encelliga suspensionen.
Obs: För att få maximal återvinning av CSCs, pulverisera lysis mixen i minst 5 minuter. Om vävnad klumparna är relativt stora, skär spetsen av en 1 mL pipettspetsen med sax eller en kirurgisk kniv och använda den för sönderdelning. - Stoppa den enzymatisk lysis av vävnad genom att lägga till kommersiellt tillgängliga CSC underhåll medium. Lägg till nästan 2-3 x så mycket underhåll medium som volymen av lyserat vävnaden i steg 2.14.
- Passera en 100 µm cell SIL att ta bort eventuella osmält vävnad bitarna smälta cellsuspension.
- Upprepa steg 2.16 använder en 40 µm cell SIL.
- Separera celler genom täthet lutning centrifugering. För separation av celler, försiktigt överlagra en lika stor volym av filtratet över polysucrose och natrium diatrizoate lösning. Exempelvis först, tillsätt 20 mL av polysucrose och natrium diatrizoate lösning i en 50 mL konisk slang och Lägg sedan till 20 mL av filtratet från steg 2.17 över polysucrose och natrium diatrizoate lösningen.
Obs: Prewarm polysucrose och natrium diatrizoate lösning vid 37 ° C innan använda med celler. Lägg till filtratet från steg 2.17 över polysucrose och natrium diatrizoate lösningen mycket försiktigt och långsamt att undvika någon blandning av de två lösningarna. Detta anses vara ett avgörande steg. - Centrifugera röret som innehåller båda lösningarna på 500 x g i 20 min i rumstemperatur med en swing hink centrifug. Ange centrifugen med lägre acceleration och retardation hastighet för att undvika att blanda de två lösningarna och ordentlig separation av CSCs. Detta är ett viktigt steg i CSC isolering. Placera röret som innehåller gradient blandningen mycket långsamt utan störningar inuti centrifugen och ställa in den för centrifugering.
- Ta ut buffy pälsen tillsammans med extra lösning från det övre lagret med antingen 1 mL pipett eller en plast Pasteur-pipett i en 15 mL steriliserat tube. Detta buffy lager kommer att innehålla CSCs.
Obs: Ta extra försiktighet under den pipettering av buffy pälsen inte att ta ut polysucrose och natrium diatrizoate lösning lagret eftersom det är giftigt för CSCs. - Tillsätt en motsvarande volym av CSC underhåll medium att cellsuspensionen från steg 2.20 och blanda det ordentligt för att neutralisera de kvarvarande polysucrose och natrium diatrizoate lösning, om den finns.
- Centrifugera ovan cellsuspension på 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 7-10 mL ofullständigt DMEM medium och centrifugera det 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C att få bort eventuella kvarvarande polysucrose och natrium diatrizoate lösning.
- Samla pelleten, som innehåller de renade CSCs.
- Återsuspendera pelleten i 1 mL av CSC underhåll medium, räkna antalet CSC och använda pelleten för kultur. För att räkna antalet CSC, Använd Trypan blå färgning och en hemocytometer. Med fyra manliga möss hjärtan är avkastningen av CSCs ~1.8 miljoner.
- Utsäde i CSCs i en 6-väl kultur platta belagd med en 0.02% gelatin lösning innehållande 0,5% Fibronektin. Använd 2 mL komplett underhåll medium för sådd. Inkubera kultur plattan i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2.
- Byt ut medlet av kultur CSCs med komplett CSC underhåll medium varje dag fram till den tredje dagen. Efter det, ändra medium varannan dag.
- Bestämma tillväxten av CSCs genom att observera dem i Mikroskop.
3. kultur underhåll och Passage av hjärt stamceller
- Kultur de isolerade CSCs i ett kommersiellt tillgängliga underhåll medium. Byt ut odlingssubstratet med färska underhåll medium varannan dag. När CSC kulturen har nått konfluens, överföra CSCs till en ny platta belagd med gelatin och Fibronektin, som nämns i steg 2.26. Lossa de odlade CSCs genom enzymatisk cell dissociation buffert. Följ standardprotokollet av cell dissociation från kultur plattan. I detta skede anses CSCs på passage 0 (P0) scenen.
- Kultur P0 CSCs i en ny gelatin och Fibronektin-belagd plåt i komplett CSC underhåll medium vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator, låta dem vara konfluenta och följ sedan steg 3.1 att få passage 1 (P1) CSCs. Store P1 CSCs i flytande kväve eller använda dem för erfa ment.
- Utsäde 0,5 miljoner celler i en 6-well platta eller 1 miljon celler i T-25 att upprätthålla CSC kulturen i sitt inledande skede.
- Passage av CSCs när de blir 85-90% konfluenta. CSCs kan vara odlade i underhåll medium upp till fyra till sex veckor.
Obs: Hålla ursprungliga sådd tätheten av de relativt höga CSCs (40% - 50%) eftersom, på en lägre sådd täthet, CSCs kan ändra deras morfologi till platta och långsträckt.
4. karakterisering av hjärt stamceller
- För att karakterisera de odlade CSCs, observera dem under en phage-kontrast eller ljusa fält Mikroskop. Placera plattan CSC-innehållande på målet av ett fluorescerande Mikroskop. Ställ in förstoringen ganska låg (10 X) fokusera cellerna. Använd faskontrast bländare för att iaktta cellerna. Öka förstoringen till 20 X genom att ändra objektivet och bild CSCs. ökningen målet till 40 X och bild i CSCs. I två dagar, CSCs visas nästan rund i formen, men storleken på cellen ökar med tiden, och i sju dagar, i CSCs visas nästan cylindriska form (figur 1A - 1 C).
- Utföra immunfärgning av CSCs med markörer för pluripotens/stemness (OCT4, SOX2, eller Nanog), proliferation (Ki-67) (figur 2A - 2D) och hjärt ursprung/stamceller (Sca-1, NKX2-5 eller GATA4) (figur 3A - 3 C).
- För immunfärgning av CSCs, utsäde 10.000 CSCs i en 24-väl kultur plattan.
- Nästa dag (efter 18-24 h), fixa CSCs i 300 µL av 4% PARAFORMALDEHYD i 10 min.
- Tvätta CSCs med 500 µL av iskall PBS, 3 x med 5 minuters mellanrum.
- Permeabilize i CSCs med 300 µL av 0,2% Triton x-100 utspätt i PBS i 10 min.
- Tvätta CSCs med 500 µL av iskall PBS, 3 x med 5 minuters mellanrum.
- Utföra en blockering av CSCs med 300 µL av 1% BSA utspätt i PBST (PBS + 0,1% Tween-20) eller 300 µL 10% normala kyckling serum utspätt i PBST för 1 h.
- Inkubera i CSCs i 200 µL av primär antikropp utspätt i blockering lösning över natten vid 4 ° C. Späd den primär antikroppen som rekommenderas av databladet av antikroppar eller enligt standardisering.
- Tvätta CSCs med 500 µL av iskall PBS, 3 x med 5 minuters mellanrum.
- Inkubera i CSCs i 200 µL av sekundär antikropp utspätt i blockering lösning (se punkt 4.2.6) för 1 h i rumstemperatur. Späd den sekundära antikroppen som rekommenderas av databladet av antikroppar eller enligt standardisering.
- Tvätta CSCs med 500 µL av iskall PBS, 3 x med 5 minuters mellanrum.
- Counterstain i CSCs med 200 µL DAPI (1 µg/mL) spädd i PBS för 5 min.
- Tvätta CSCs 1 x med 500 µL av iskall PBS. Lägg sedan till 300 µL av iskall PBS i varje brunn.
- Utföra imaging med fluorescens Mikroskop. Följ instruktionerna av fluorescerande imaging, sådan att undvika direkt ljus på plattan. Hålla kultur plattan under mikroskopet. Fokusera cellerna vid olika förstoringar. Observera cellerna under faskontrast och/eller olika excitation filter och spara bilderna.
- Förvara plattan i mörker vid 4 ° C.
5. differentiering av hjärt stamceller i hjärtmuskelcellen
- För differentiering av CSCs, utsäde 500.000 CSCs i en 6-well platta med 2 mL av prewarm (37 ° C) kommersiellt tillgängliga CSC underhåll medium.
- Inkubera plattan som innehåller CSCs i en CO2 inkubator vid 37 ° C. Låt CSCs bifoga och föröka tills sub konfluenta tillväxt. Om mediet blir gul, ersätta odlingssubstratet med färska underhåll medium.
- På 85-90% konfluens, ersätta underhåll medium med 2 mL prewarm (37 ° C) hjärtmuskelcellerna differentiering medium. Inkubera plattan i en CO2 inkubator vid 37 ° C i upp till 2-3 veckor.
- Ändra den differentiering medium varje 2-3 d. Observera den CSCs' morfologi i Mikroskop varje gång under medellång ändra för att på bra kultur.
- Efter 12 d av CSC kultur i differentiering medium, bild på CSCs för differentiering markörer efter en standard immunfärgning protokoll (se stegen 4.2.1 - 4.2.14). Spara de fluorescerande bilderna för uttrycket av hjärtmuskelceller markörer (figur 4A - 4B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den aktuella studien isolerade vi CSCs från 10 - till 12-vecka-gammal C57BL/6J hanmöss hjärtan. Här har vi presenterat en enkel metod för CSC isolering och karakterisering med hjälp av markörer för pluripotens. Vi presenterade också en elegant metod för CSC differentiering och karakterisering av CSCs som differentierade mot hjärtmuskelceller härstamning. Vi observerade en spindel form morfologi av 2 - till 3-dagar-odlade CSCs under ett faskontrastmikroskop (figur 1A och 1B). Vi hittade en förändrad morfologi av CSCs 7 dagar av kultur i underhåll medium, under vilken tid stamcellerna blir långsträckt (figur 1 c). Vi kännetecknas CSCs markörer av pluripotency och fann att de uttrycker OCT4, SOX2 och Nanog (figur 2A - 2 C). Vi fann också att CSCs föröka i odlingsmedium och uttrycka den spridning markören Ki-67 (figur 2D). För att karakterisera CSCs hjärt ursprung, bestämda vi uttryck för kardiella markörer Sca-1, NKX2-5 och GATA4 i CSCs. Vi hittade ett uttryck av kardiella markörer i de odlade CSCs (figur 3A - 3 C). För att avgöra differentiering av CSCs mot hjärtmuskelcellen härstamning, odlade vi CSCs i hjärtmuskelcellen differentiering medium i 12 dagar. Efter 12 dagar, vi avbildas de differentierade CSCs för hjärtmuskelcellen markörer actinin och troponin jag. Vi observerade att hjärtmuskelcellen markörer uttrycktes i differentierade CSCs (figur 4A - 4B). Sammantaget visar dessa resultat att vi framgångsrikt isolerade CSCs från mus hjärta och att dessa CSCs kan föröka sig och differentiera mot hjärtmuskelceller härstamning.
Figur 1: morfologi av odlade CSCs. Dessa paneler Visa faskontrast avbildning av odlade CSCs, nämligen representant CSCs efter 2 dagar av odling i underhåll medium på (A1), 20 X och (A2), 40 X mål, representant CSCs efter 3 dagar av odling i underhåll medium på) B1) 20 X och (B2), 40 X mål och representant CSCs efter 7 dagars odling i underhåll medium på (C1), 20 X och (C2), 40 X mål. Skala barerna är 100 µm för 40 X förstoringar och 200 µm för de 20 X förstoring.
Figur 2: karakterisering av CSCs för pluripotens markörer. Dessa paneler visar representativa fluorescens avbildning av odlade CSCs markörer av pluripotency (OCT4, SOX2 och Nanog) och spridning (Ki-67). Paneler A Visa uttryck för OCT4 (grön) och DAPI (blå) i CSCs på (A1), 20 X och (A2), 40 X förstoring. Paneler B Visa uttryck för SOX2 (grön) och DAPI (blå) i CSCs (B1), 20 X och (B2), 40 X förstoring. Paneler C Visa uttryck för Nanog (grön) och DAPI (blå) i CSCs på (C1), 20 X och (C2), 40 X förstoring. Paneler D Visa uttryck för Ki-67 (röd) och DAPI (blå) i CSCs på (D1), 20 X och (D2), 40 X förstoring. Skala barerna är 100 µm för 40 X förstoringar och 200 µm för de 20 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: karakterisering av CSCs för kardiella markörer. Dessa paneler visar representativa fluorescens avbildning av odlade CSCs för kardiella markörer. Paneler A Visa uttryck för Sca-1 (röd) och DAPI (blå) i CSCs på (A1), 20 X och (A2), 40 X förstoring. Paneler B Visa uttryck för NKX2-5 (grön) och DAPI (blå) i CSCs (B1), 20 X och (B2), 40 X förstoring. Paneler C Visa uttryck för GATA4 (röd) och DAPI (blå) i CSCs på (C1), 20 X och (C2), 40 X förstoring. Skala barerna är 100 µm för 40 X förstoringar och 200 µm för de 20 X förstoring.
Figur 4: karakterisering av CSC differentiering mot hjärtmuskelcellen härstamning. Dessa paneler Visa representant faskontrast och fluorescens avbildning av 12-dagar differentierade CSCs. (A) i denna panel visas uttryck för hjärtmuskelcellen markör actinin i differentierade CSCs, med (a) en fas-avtalet bild, (b ) en fluorescens bild av DAPI (färgning nucleus), (c) en fluorescens bilden av actinin (grön) och (d) en sammanslagen bild av paneler en - c. Förstoringar är 40 X. (B) denna panel visar uttrycket av den hjärtmuskelcellen markören troponin I differentierade CSCs, med (en) en fas-avtalet avbildning (b) en fluorescens av DAPI (färgning nucleus), (c) en fluorescens bild av Troponin I (grön), och (d) en sammanslagen bild av paneler en - c. Förstoringar är 40 X. Skala barerna är 100 µm för 40 X förstoringar och 200 µm för de 20 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Schematisk bild av de olika stegen i CSC isolering, kultur och differentiering. Vi använde kirurgiskt borttagna hjärtan från fyra till fem vuxna möss för isolering av CSCs. Stegvis processen för CSC isolering, kultur och differentiering mot hjärtmuskelceller utvecklingslinjerna presenteras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiska steg i detta CSC isolering protokoll är följande. (1) en steriliserad skick måste upprätthållas för utvinning av hjärtan från mössen. All kontaminering under hjärtat utvinning kan äventyra kvaliteten i CSCs. 2) blodet måste tas bort helt före malning hjärtat, vilket görs genom flera tvättar av hela hjärtat och hjärta bitar med HBSS lösning. (3) hjärtat bitar måste vara helt lyserat till en enskild cell suspension med kollagenas lösning. (4) polysucrose och natrium diatrizoate gradient lösningen för separation av cellerna måste vara föruppvärmd. (5) medium för CSC kulturen måste vara föruppvärmd. 6) sammanflödet av CSCs under sådd i en kultur skålen bör vara hög eftersom, i låga konfluens, CSCs kan ändra deras morfologi. (7) antalet CSC bör vara poängsätts efter isolering från hjärtat och före plätering i en kultur skålen. Antalet CSCs visar effektiviteten av isolering från hjärtat. Räkning av CSCs är viktigt för odling av CSCs i kultur plattan.
Vi använde vuxna möss för att isolera CSCs, som har använts av andra utredare i djurmodeller23,28. CSCs kan isoleras från neonatal gnagare hjärtan29,30 och även från biopsi av ett mänskligt hjärta31. De tidigare rapporterade CSC isolering protokoll har vissa begränsningar, såsom mindre avkastning, en komplex isolering förfarande, en lång varaktighet för differentiering, och mindre hjärtmuskelcellen differentiering potentiella32,33, 34. the CSC isolering protokoll presenteras här är enkel: det tar mindre tid och är mer effektiva i CSC avkastning. Dessutom, de isolerade CSCs är Sca-1+ ve (en väl accepterade markör för mus CSCs) (siffror 1A1 - 3 c 2). För differentiering av CSCs behöver andra protokoll tre till fyra veckor35,36. Detta protokoll kräver dock 12 dagar (figurerna 4A - 4B). Gradient centrifugering-baserade CSC isolering presenteras här ger ~1.8 miljoner CSCs från fyra hanmöss hjärtan.
Även om avkastningen av CSCs är hög, är en begränsning av detta protokoll enhetlighet och renhet av de isolerade CSCs. Eftersom det finns ingen enda godtagbara markör för CSCs, är det svårt att använda en single-cell-ytan markör för att välja CSCs. CSCs isoleras genom detta protokoll kan dock användas att erhålla en enhetlig befolkning på CSCs baserat på en specifik markör eller flera markörer av CSCs, med hjälp av fluorescens-aktiverad cell sortering. Således, denna metod för CSC isolering är kostnadseffektivt med en hög avkastning och har möjlighet att få en enhetlig CSC population baserat på specifika cellytan marker(s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds, i delar av National Institutes of Health bidragen HL-113281 och HL116205 att Paras Kumar Mishra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146 (2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
- Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
- Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
- Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
- Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
- Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
- Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
- Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
- Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
- Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162 (2015).
- Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
- Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
- Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
- Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
- Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
- Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
- Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
- Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
- Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265 (2011).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet? Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
- Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
- Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
- Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
- Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
- Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
- Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
- Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).
