Summary
אנו מתארים יישום לא פולשנית ויוו הדמיה פרוטוקול מאופין בעיצוב חסכוני, ניצול L-012, chemiluminescent הלומינול-אנלוגי, כדי להמחיש ולכמת מינים חמצן תגובתי (ROS) שנוצר במודל של עכברים excisional פצע.
Abstract
הדור של מינים חמצן תגובתי (ROS) מהווה סימן היכר של תהליכים דלקתיים, אך עודף, סטרס חמצוני הוא נרחב בהפרות פתולוגיות שונות כגון סרטן, טרשת עורקים, סכרת. אנחנו בעבר הראו כי תפקוד של הגורם הגרעיני (נגזר erythroid 2)-אוהב 2 (Nrf2) / כמו Kelch erythroid תא, נגזר חלבון 1 (אותו1) איתות לשביל מוביל לחוסר איזון ROS קיצוני במהלך עורית פצע ריפוי סוכרת. מאז רמות ROS הן אינדיקטור חשוב של התקדמות של ריפוי הפצע, כימות ספציפי ומדויק בטכניקות הם בעלי ערך. תוארו מספר במבחנה מבחני למדוד ROS ב תאים ורקמות; עם זאת, הם רק מספקים מידה מצטברות יחיד עבור דגימה. לאחרונה, הפיתוח של מחוונים מבוססי חלבונים ושל שיטות הדמיה אפשרו עבור ניתוחים ייתכן ייחודי. L-012 (C13H8ClN4נאו2) היא נגזרת הלומינול יכול לשמש הן בתוך vivo והן במבחנה chemiluminescent זיהוי של ROS שנוצר על ידי אוקסידאז NAPDH. L-012 פולטת אות חזק יותר מאשר אחרים הגששים פלורסנט, הוכח להיות רגיש וגם אמינה לגילוי ROS. זמן לשגות תחולתה של L-012-ידי הדמיה מספק מידע חשוב אודות תהליכים דלקתיים תוך כדי הקטנת הצורך להקריב, הכולל הפחתת מספר חיות מחקר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ניצול L-012-ידי ויוו הדמיה לכמת סטרס חמצוני במודל של ריפוי הפצע excisional שימוש בעכברים סוכרתיים עם Nrf2 לא מתפקדת באופן מקומי/Keap1.
Introduction
מטבוליטים החמצן שנוצר באמצעות תהליכים דלקתיים לתרום cascades איתות שונים, כמו גם שינוי ההרסני של מרכיבי התא1. ניצול טכניקות רגישות וספציפיות למדוד ROS חיוני ללמוד תהליכים דלקתיים, אפיון השפעת סטרס חמצוני. דימות in vivo יקר בשל יכולתה לספק נתונים יכולות דינמיות ברקמת החיים. L-012 שווה בדיקה chemiluminescent סינתטי, כי היא רגישה מאוד עבור אניונים סופראוקסיד מייצרת עוצמת אור גבוה יותר מאשר אחרים הגששים פלואורסצנט תאים, רקמות, ו דם1,2,3, 4. זה כבר בהצלחה מועסקים עבור הדמיה ויוו במודלים מאתר ללמוד מספר מחלות דלקתיות, כולל דלקת מפרקים ו קוליטיס5,6. זה טרם ישתלב פציעה עורית הוקמה ריפוי מודל. מדידה של ROS שנוצר רלוונטי באותה מידה להעריך את ההתקדמות של ריפוי הפצע בתנאים שונים. הרגישות ואת הטבע לא פולשנית של שיטה זו הופכת טכניקה המבטיחים לימוד ריפוי הפצע על פני דגמים מאתר.
Nrf2 הוא מנהל התקן הגדולות של תגובת חמצון, גורם תעתיק עם ירידה לפרטים לרכיב נוגד חמצון תגובה (הם) נפוצה באזורים המקדם של אנזימים נוגדי חמצון מספר8. בהיעדרו של סטרס חמצוני, Nrf2 הוא מבודד בציטופלסמה על-ידי Keap1, מה שגורם לאחר מכן שלה ubiquitination והשפלה. חוסר איזון של הנתיב Nrf2/Keap1 היה מעורב חמצון-חיזור בלתי הולם הומאוסטזה ומתת ריפוי הפצע מושהית בסביבה של לחץ חימצוני מוגבר9. אנחנו בעבר הראו כי דיכוי Keap1 מעוררת פעילות Nrf2 מוגברת מקדם הצלה של ריפוי פצעים עורית פיפטות ב סוכרת פצעים9.
כאן נתאר פרוטוקול אשר מנצל ביולומינסנציה L 012-בסיוע הדמיה כדי למדוד רמות ROS במודל הפצע עורית excisional הריפוי, אשר הוא קריטי עבור הדגשת הקשר בין ROS לבין ריפוי הפצע. טכניקה זו מדגים שינויים בזמן אמת עומס חמצוני בתוך הפצעים ואת הפריפריה הקרובה. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת להערכה מהירה של התערבויות ומנגנונים טיפול חמצון-חיזור זה משפיע. כאן אנו משתמשים מודל של נוקאאוט אותו1 לשיקום חמצון-חיזור הומאוסטזיס כדי להעריך את הישימות של האסטרטגיה שלנו. מכיוון הטכניקה שלנו אינה פולשנית הפצעים הם ללא הפרעה, אותה חיה יכול לשמש עבור נוסף מאשרות ניתוחים על בסיס היסטולוגיה או תא lysates.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של ניו יורק הספר לרפואה של אוניברסיטת. כל העכברים שוכנות מאחורי מחסום, כל אנשי הצוות ללבוש ציוד מגן אישי המתאים.
1. יום 0: הכנת מודל מאתר של ריפוי הפצע Excisional
- עזים ומתנגד בעכברים סוכרתיים (Leprdb/db), בגילאי 8-12 שבועות, עם inhalational איזופלוריין 2%. ודא כי כל עכבר יש כבר כראוי ומורדמת באמצעות מבחן קמצוץ כרית כף הרגל. חומר סיכה עינית סטרילי חלות על כל עין כדי למנוע גירוי של יובש. חוקרים פעל על פי הנחיות הצוות הוטרינרי מוסדיים שלהם כאשר מאלחש בעלי החיים באמצעות איזופלוריין.
- שוקל העכברים ולהקליט את משקל הגוף של כל עכבר. לאשר את מצב הסוכרת של בעלי חיים ע י הקלטת את הגלוקוז בדם של כל בעל חיים באמצעות של סוכר.
- לחטא סביבת פרוצדורלי וציוד ההרדמה. להסיר שיער הגבי של העכברים באמצעות מכונת תספורת לשיער, ואחריו היישום של קרם להסרת שיער לנגב שיער עודף משם. השתמש מגבונים אלכוהוליים כדי לנקות את העור חשוף, פעמיים, אפשר להתייבש.
- צור שני פצעים מלא-עובי 10 מ מ, הרחבת דרך carnosus panniculus באמצעות אגרופים ביופסיה סטרילי 10 מ מ לפי פצע excisional ומבוססת ריפוי טכניקה7,8. השתמש בכפפות סטריליות עבור כל ניתוח הישרדות. אוטוקלב כל מכשירי ניתוח בשקיות לפני הניתוח ופתח רק בתחום כירורגית.
- סד הפצעים לפתוח באמצעות גיליון סיליקון בעובי 0.5 מ מ עם מגזרות עגול 10 מ מ ולהבטיח סטנטים את המקום באמצעות קטע התפרים משי 4-0.
- הניתוח שלהלן, חיות להסיר מן ההרדמה ומניחים על חימום pad כדי לאפשר התאוששות נאותה. ראוי לציין, אם טמפרטורת הגוף החי מקטין במהלך ההליך, החיה עשויות להיות מועברות אל משטח חימום מוקדם יותר כדי למזער את איבוד חום הגוף תחת הרדמה. נטר את החיות עד שהם ער, ניידים.
- לאחר החלימו לחלוטין, לחזור חיות בכלובים בודדים, המכיל מזון ומים (להבטיח שאוכל כמה הוא על רצפת הכלוב העשרה לאחר הניתוח). מספקים מגבות נייר גרוס נוספים חומר קינון עבור 2 שבועות. לא בית חיות אשר עברו ניתוח עם חיות אחרות, כדי למנוע אינטראקציות שליליות ושינויים פצע את מצב ריפוי.
- לשיכוך כאבים לאחר הניתוח, להזריק עכברים subcutaneously. הבופרנורפין ב 0.1 mg/kg של משקל גוף פעמיים ביום, החל מיד לאחר ההליך, במשך 3 ימים.
2. יום 1: הכנת Keap1 siRNA
הערה: להכין את כל הטיפולים בתוך ארון אבטחה.
- להכין siRNA דילול על ידי שילוב 37.5 µL של מדיום מופחת סרום עם 12.5 µL של siRNA Keap1 20 מיקרומטר (סיאותו1) (250 pmol) צינור microcentrifuge 1.5 mL על קרח.
- הכן ליפוזום דילול על ידי שילוב של 25 µL של מדיום מופחת סרום עם 25 µL של ליפוזום לערבב פנימה צינור microcentrifuge 1.5 mL.
- להוסיף 50 µL של דילול siRNA דילול ליפוזום µL 50 dropwise (כרך 1:1) ומערבבים בעדינות.
- תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- מוסיפים 50 µL של 2% methylcellulose ג'ל במים ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
- מתייחסים כל חיה עם גם שטויות סיאס (בקרה) או סיאותו1 (ניסיוני). הג'ל חלות על החלק העליון של הפצע. לעטוף את פלג הגוף העליון של החיה עם רוטב סרט שקוף כדי לשמור ג'ל במקום, שמירה על הגפיים חינם לשמור על ניידות.
3. יום 3: הכנת פתרון L-012
הערה: להכין כל ריאגנטים ב אבטחה ארון.
- צינור microcentrifuge 1.5 mL, להכין את L-012 ב- PBS X 1-ריכוז של 0.5 מ"ג/100 מ"ל.
- באופן ידני מערבולת הצינור microcentrifuge. L-012 לא נמסים לחלוטין לתוך מגניב, אולם צריך להיות מושעים באופן שווה בתוך הנוזל. ראוי לציין, אל תנסו לפזר L-012 במים כדי להימנע מטרידה הפיזיולוגיות אלקטרוליט מאוזן לאחר ההזרקה.
- להעביר את הפתרון לתוך מזרק 1 מ"ל באמצעות מחט 27 גרם.
הערה: הקפד על הפתרון L-012 מפני אור.
4. יום 3: In Vivo הדמיה של פצעי סוכרת
- עזים ומתנגד עכברים עם inhalational איזופלוריין 2%. חוקרים פעל על פי הנחיות הצוות הוטרינרי מוסדיים שלהם כאשר מאלחש בעלי החיים באמצעות איזופלוריין. ודא כי כל עכבר יש כבר כראוי ומורדמת באמצעות מבחן קמצוץ כרית כף הרגל. חומר סיכה עינית סטרילי חלות על כל עין כדי למנוע גירוי של יובש.
- הסר בעדינות את הרוטב סרט שקוף מן העכברים מבלי להפריע את הפצעים.
- הצב העכברים בבית הבליעה הדמיה בהזמנות שלהם בהתאמה. כדי לשמור על רמות2 O נכונה בבית הבליעה, הגדר מהזרימה מערכת הדמיה ואת רמות2 קאמרית O אינדוקציה 1.0 L/min.
- תמונה העכברים ביולומינסנציה ואת התמונה בנקודת ההתחלה לפני הזרקת תרכובת L-012.
- לנגב את הבטן עם מגבונים אלכוהוליים ולאפשר להתייבש. לבצע זריקה בקרום הבטן של הפתרון L-012 ב 5 מ ג 200 גרם משקל הגוף באמצעות מחט 27-מד. לדוגמה, לעכבר השוקל 20 גרם אמור לקבל 0.5 מ ג של L-012.
- מיד לאחר הזריקה L-012, מקום העכברים בחזרה במקומות המתאימים שלהם בבית הבליעה הדמיה. תמונה העכברים במשך 60 דקות, במשך דקה אחת במרווחים של-4 דקות. הגדר את הפצע. 10-מ מ אזור עניין לקביעת רמת ROS.
- הניתוח שלהלן, חיות להסיר מן ההרדמה ומניחים על חימום pad כדי לאפשר התאוששות נאותה. נטר את החיות עד שהם ער, ניידים.
- לאחר החלימו לחלוטין, לחזור חיות בכלובים בודדים, שמירה על הסביבה העשרה שלאחר הניתוח באותו שתואר קודם לכן ב- 1.6. לא בית חיות אשר עברו ניתוח עם חיות אחרות, כדי למנוע אינטראקציות שליליות ושינויים פצע את מצב ריפוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שלושה ימים לאחר יצירת פצעים דו צדדיים על פי מודל הפצע excisional הוקמה (איור 1 א'), בעכברים סוכרתיים ממוקמים בבית הבליעה הדמיה. תצלום הראשונית ואת מידת ביולומינסנציה נלקחים לפני הזרקה של L-012 על רקע אות (איור 1B). בעקבות הזרקת בקרום הבטן עם הפתרון L-012, העכברים הם לטאבים בבית הבליעה, ביולומינסנציה הוא מדמיין באזורים של הפצע היכן מזוהה ROS (איור 1C). לאחר בחירת הדמיה הנכון ניתוח ההגדרות כמתואר באיור2 ' ', להמשיך עם הדמיה. ביולומינסנציה מתועד במשך דקה אחת במרווחים של 5 דקות במשך 60 דקות (איור 3). זה מדגים את הרוויה ביולומינסנציה של האזור עניין לאורך זמן. במודל בעלי חיים שלנו, זמן הדמיה אופטימלית להגיע רוויה L-012 מלאה היה נחוש בדעתו להיות 50 דקות, אחרי אשר אין הבדל בולט ביולומינסנציה מוערכת. הפעם ישתנו בהתאם החיה דגם מנוצל, צריך להיות נחוש באופן עצמאי אופטימיזציה עבור משתנה הפצע מודלים בהתאם לגודל, סוג בעלי חיים, טיפול, וכו '
אזור בעל עניין (ROI) לצורך לכימות ביולומינסנציה מוגבלת לאזור פצע סוכרתי מצויר בתמונה שכבת-על (איור 4). ROIs אלה מוגדרים באופן דומה עבור כל הפצעים כולל לפני הזרקת L-012 (איור 4A), ואחרי הזרקת L-012 שטויות שטופלו siRNA (איור 4B) אותועכברים שטופלו siRNA 1 (איור 4C). ביולומינסנציה מחושב על ידי חלוקת הסעיפים הכולל של עוצמת האור על-ידי האזור. טבלה 1 מציגה את החישובים בצורה גרפית בתוך 4D איור. שטויות שטופלו siRNA סכרת הפצעים היו 45,775 11,649 ביולומינסנציה/cm2, בעוד דיכוי אותו1, גרמו 19,405 5,939 ביולומינסנציה/cm2 (כלומר SD). מבחן t של סטודנט הפגינו ביולומינסנציה ירד משמעותית (p = 0.042) ב- Keap1 שטופלו siRNA פצע לעומת השטויות שטופלו siRNA פצע, מתאם עם עומס חמצוני התחתון עם Nrf2 גבוהה יותר פעילות (איור 4 D). כדי לאשר כי רמות היחסי של ROS דמיינו ידי L-012 סיאס , סיKeap1 לתאם עם אמצעים אחרים הוקמה של מדידת דלקת, ניתחנו את 10 יום פצע רקמות מקטעים. כתמי H & E הראה מופחתת הסתננות תאית סיKeap1-טיפול פצעים בניגוד סיאס-אלה שטופלו, המציין מופחתת דלקתיות מורפולוגיה (איור 5A). Immunoreactivity של F4/80, סמן מקרופאג חלבון, (פלואורסצנטי אדום) על מקטעי רקמת הפצע חשף מופחתת מקרופאגים סיאותו1 התייחס פצעים לעומת סיאס-טיפול פצעים (איור 5B). בהמשך מדגים כי רמות ROS דמיינו ידי L-012 הן correlate עם אחרים ויצר מודלים למדידה ROS ומדויקים. אנושות, החלת טכניקה זו לא דרש להקריב את החיות למקטעי רקמות כמו נדרש עבור H & E ו- immunofluorescence מכתים.
איור 1: הגדרת ניסיוני עבור הדמיה- (א) בעכברים סוכרתיים פצועים באמצעות מודל הפצע excisional הוקמה. (B) א כיסוי בסיסית של תצלום עם הזרקת ביולומינסנציה טרום-L-012. (ג) בעקבות הזרקת בקרום הבטן עם L-012, הוא מדמיין ROS. הפריה חוץ גופית המידה עבור B ו- C אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הגדרות תמונה וניתוח במבחנה הדמיה בתוכנית המערכת. (א) בחר "הדמיה אשף" בלוח הבקרה רכישה (חץ אדום). (B) "הדמיה ביולומינסנציה" היא הדמיה למצב הנבחר. (ג) "פתח מסנן" נבחר את שיטת המדידה. (ד) הדמיה נושא נבחר "מאוס", נבחרה האפשרות "הזמן סדרת המחקר". המספר הכולל של מקטעים, זמן ההשהיה בין מקטעים הוא קלט. (E) בחר "לרכוש רצף" להמשיך עם הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: מחקרי האורך ויוו ROS הדמיה- בעכברים סוכרתיים נמצאים עם תמונה עבור עיגולים במרווחים במשך 60 דק אדום 1 דקה לאחר ההזרקה בקרום הבטן עם L-012 ב 5 דקות: רועי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: לכימות ביולומינסנציה. תמונות עם כיסוי ביולומינסנציה של פצעי סוכרת (א) לפני הזרקת L-012, (B) עם פצעים מטופלים עם חטאים לאחר הזרקת L-012, (ג) עם פצעים שטופלו סיאותו1 לאחר ההזרקה L-012. (D) כימות ביולומינסנציה הממוצע מחולק שטח הפנים של ROIs עבור החטאים ו- siאותופצעים שטופלו 1. צהוב עיגולים: רועי. הנתונים מיוצגים כמו סטייה mean±standard; 0.05 <p , n = 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: ROS מתאמים עם כתמי immunohistochemical. (א) H & E בכתמי סוכרת מקטעי רקמת הפצע ב 10 ימים הראה לחדור הסלולר מופחת כפי שטופלו ראיות מופחתת דלקתיות מורפולוגיה סיKeap1 של פצעים לעומת סיאס -טיפול פצעים. (B) F4/80 immunofluorescence (אדום) הראו הפחתה במספר מקרופאגים סיKeap1 לטפל בפצע סעיפים ב 10 ימים לעומת שלהם סיאס -מטופלים עמיתיהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| רועי | סי | ספירות סה | Avg ספירות | Stdev ספירות | אזור [cm ²] | ספירות/השטח הכולל | ספירות הממוצע/אזור |
| רועי 1 | NS | 9.38E + 03 | 1.14E + 02 | 3.85E + 01 | 2.48E-01 | 3.78E + 04 | 4.58E + 04 |
| רועי 2 | NS | 4.68E + 03 | 5.37E + 01 | 3.13E + 01 | 2.63E-01 | 1.78E + 04 | |
| רועי 3 | NS | 1.72E + 04 | 2.18E + 02 | 1.54E + 02 | 2.39E-01 | 7.20E + 04 | |
| רועי 4 | NS | 1.24 E + 04 | 1.68E + 02 | 8.41E + 01 | 2.24E-01 | 5.55E + 04 | |
| רועי 5 | Keap1 | 3.21E + 03 | 3.41E + 01 | 2.76E + 01 | 2.84E-01 | 1.13E + 04 | 1.94E + 04 |
| רועי 6 | Keap1 | 2.56E + 03 | 2.88E + 01 | 1.06E + 01 | 2.69E-01 | 9.52E + 03 | |
| רועי 7 | Keap1 | 4.92E + 03 | 6.48E + 01 | 5.03E + 01 | 2.30E-01 | 2.14E + 04 | |
| רועי 8 | Keap1 | 8.34E + 03 | 1.07E + 02 | 5.25E + 01 | 2.36E-01 | 3.54E + 04 |
טבלה 1: לכימות ביולומינסנציה עבור שהוגדרו ROIs. ביולומינסנציה שנמדד עבור כל רועי, סטנדרטית יחסית שטח. החישוב של ממוצע, סטיית תקן, שגיאת תקן מחושבים בהתאם. רועי 1, 2, 3, ו 4 מייצגים רועי מפצעי של חזרה הביולוגי של החטאים מטופלים פצעי סוכרת ו- ROI 5, 6, 7 ו- 8 מייצגים ROIs מ חזרה הביולוגי של siKeap1 התייחסו פצעי סוכרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקות נפוצות למדידת ROS מוגבלות פרוטוקולים מורכבים הדורשים שאיבת רקמות או בדומה לכך טכניקות פולשניות. בשנים האחרונות, מדידות של סטרס חמצוני דווחו על בסיס שיטות הדמיה חדשניות, ובכך לאפשר הערכות ייתכן9,10,11. L-012 יש מספר יתרונות כמו בדיקה chemiluminescent ביחס הלומינול, lucigenin ו- MCLA1,4. המתחם הוא רעיל, בקלות נספג, יש הרבה ביולומינסנציה חזק יותר לעומת הלומינול או הגששים דומה12. אנושות, L-012 יכול בבטחה להינתן מספר פעמים ברצף לניתוח האורך ללא תופעות לוואי או נזק לחיה מודלים6. אסטרטגיה זו דורשת הכשרה מיוחדת מוגבלת, הציוד הנדרש זמין בקלות במעבדות מחקר רוב, שהופך אותו פרוטוקול נגישים נרחב.
לשימוש מיטבי, אנו ממליצים כי ריאגנטים להיות מעודכן כראוי ומוגן בפני אור כדי למנוע השפלה. אנושית המפתחת פצעי סטנט מאפשר פצעים מאתר לרפא דרך ההעברה, epithelialization מחדש, בניגוד על ידי התכווצות משמעותית. התפרים יוצבו שני שליש הדרך דרך למתחם סטנט כדי לאבטח את קצוות הפצע במקום. גלישת עכברים עם סרט שקוף לבוש לאחר יישום ג'ל מבטיחה כי טיפולים אקטואלי להישאר במקום. כדי למנוע הפציעה שנגרמה בעכברים, אשר עשויים לבלבל את התוצאות, טעימת המר תרסיס ניתן להחיל את הקשרים הפריפריה, תפרים כדי להרתיע לנשוך. L-012 הגביל מסיסות ב- PBS אבל יהיה טופס השעיה על-ידי pipetting חוזרות של הפתרון. אלה לפתרון בעיות אמצעים להבטיח אחידות ברחבי לפציעות שונות, ביטול משתמש בין השתנות תוך שמירה על נוחות בעלי חיים. כיוון טכניקה זו מסתמך על הזרקה בקרום הבטן של פתרון לתוך במודל חיה, ישנם מספר גורמים מפריעות הטמון בבעלי חיים אשר אי אפשר לשלוט. לדוגמה, זרימת הדם המקומית, הקליטה עוקבות ולוקליזציה של L-012 אל אזורי עניין לא הכתיב. עם זאת, משתנה זה יכול אפשרות לפתור באמצעות חיה כמו בקרה פנימית משלו כך אחד פצע יכולים להיות מטופלים עם סיאס והשני עם סיKeap1.
אנחנו מדווחים על השירות של אסטרטגיה לחקר ויוו ROS פצע עורית ריפוי מודל. במחקר הנוכחי שלנו, הטיפול של פצעים עם Keap1 siRNA הביא ירד הנטל חמצוני אשר מאשרת את ההבנה שלנו את חשיבות Nrf2 / טיפולKeap1 נתיב נוגד חמצון. בעוד ששיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי, יש מספר מגבלות חשובות. בעוד L-012 היא רגישה מאוד, היא אינה ספציפית עבור ROS, הוכח להגיב גם חנקן ונבדקים מינים6. ניתוח נוסף עם הגששים יישוב ושיטות מבוססות על חומרים משלימים גישה זו דרך ירידה לפרטים משופרת ולוקליזציה subcellular של ROS ה"מפה13. המנגנון המוצע ביולומינסנציה L-012 מבוססי כרוך החמצון של L-012 על ידי חמצן מולקולרי בפעולתם של peroxidase בשילוב עם H-2O-2-12. זה מגביל את השימוש בטכניקה זו ללמוד מעכבי אנזימים נוגדי חמצון המקיימים אינטראקציה עם peroxidase. ניתוח מפורט יותר נועדה במיוחד לכמת ROS חוץ סופראוקסיד אניון או חנקן ונבדקים מינים מטבוליטים אינה אפשרית עם האסטרטגיה הנוכחית.
לאור הרגישות הגבוהה של L-012 לגילוי ROS בהרחבה, זה ברצון וישימה ריפוי הפצע עורית שונים ודגמים אחרים רקמות. הראו את האינטרס של טכניקה זו לשם הערכת ההשלכות חמצון-חיזור של יישוב הרפוי לפצעים סוכרת כגון RTA 408 והעברת Keap1 siRNA14,15lipoproteoplex. בהתחשב החוזק משמעותית של פרוטוקול זה, קיים פוטנציאל עתידי עצום ביישום אסטרטגיות דומות עבור הלומדים ROS בתוך תאים עמוק דרך גישות vivo לשעבר , ניתוח ממוקד ו- organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לנו אין גילויים לדווח.
Acknowledgments
אנחנו אסירי תודה עד היסוד פרה הדמיה בית הספר NYU לרפואה, עם תודה אורלנדו אריסטיסאל יוסוף Zaim Wadghiri מיוחדת הליבה הוא משאב משותף נתמכת באופן חלקי על ידי לורה, יצחק פרלמוטר סרטן מרכז תמיכה גרנט NIH/NCI 5P30CA016087 NIBIB ביו טכנולוגיה משאב מרכז גרנט NIH P41 EB017183. עבודה זו נתמך על ידי האגודה האמריקנית לסוכרת "מסלול כדי סוכרת להפסיק" בבירה [גרנט מספר 1-16-אייס-08], NYU להחיל מחקר תמיכה לקרן יחסי ציבור
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
- Nishinaka, Y., et al. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Daiber, A., et al. Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012. Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).
- Imada, I., et al. Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012. Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).
- Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012. Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).
- Fuchs, K., et al. In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation. The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).
- Asghar, M. N., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).
- Soares, M. A., et al. Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche. Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).
- Wang, X., et al. Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).
- Kielland, A., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).
- Balke, J., et al. Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging. Small. , (2018).
- Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation. Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Rabbani, P. S., et al. Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds. Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).
- Rabbani, P. S., et al. Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing. Biomaterials. 132, 1-15 (2017).
