Summary
Vi beskriver en icke-invasiv i vivo imaging protokoll som är rationellt och kostnadseffektivt utnyttja L-012, en kemiluminiscent urin-analog, för att visualisera och kvantifiera reaktiva syreradikaler (ROS) som genereras i en excisional sår musmodell.
Abstract
Generering av reaktiva syreradikaler (ROS) är ett kännetecken för inflammatoriska processer, men i överskott, oxidativ stress är ofta inblandad i olika sjukdomar såsom cancer, åderförkalkning och diabetes. Vi har tidigare visat att dysfunktion av Nuclear factor (erytroid-derived 2)-som 2 (Nrf2) / Kelch-liknande erytroid cell-derived protein 1 (Keap1) signalering väg leder till extrem ROS obalans under kutan sårläkning vid diabetes. Eftersom ROS nivåer är en viktig indikator på utvecklingen av sårläkning, är specifika och exakt kvantifiering tekniker värdefulla. Flera in vitro- analyser att mäta ROS i celler och vävnader har beskrivits; de ger dock bara en enda kumulativ mätning per prov. Mer nyligen, tillåtit utvecklingen av protein-baserade indikatorer och avbildningsmetoder för unika spatiotemporal analyser. L-012 (C13H8ClN4NaO2) är ett urin-derivat som kan användas för både in vivo och in vitro- Kemiluminiscens upptäckt av ROS som genereras av NAPDH oxidas. L-012 avger starkare signal än övriga fluorescerande sonder och har visat sig vara både känslig och tillförlitlig för att påvisa ROS. Time lapse tillämpligheten av L-012-stödda imaging ger värdefull information om inflammatoriska processer samtidigt minska behovet av offer och övergripande minskning av antalet studie djur. Här beskriver vi ett protokoll utnyttja L-012-underlättas i vivo imaging för att kvantifiera oxidativ stress i en modell av excisional sårläkning med diabetiska möss med lokalt dysfunktionella Nrf2/Keap1.
Introduction
Syre metaboliter genereras genom inflammatoriska processer bidrar till olika signalering cascades samt destruktiva ändring av cellulära komponenter1. Utnyttja känsliga och specifika metoder för att mäta ROS är kritisk för att studera inflammatoriska processer och karaktärisera effekterna av oxidativ stress. In vivo imaging är värdefull på grund av dess förmåga att ge dynamiska rumsliga och tidsmässiga data i levande vävnad. L-012 är en syntetisk Kemiluminiscens sond som är mycket känsliga för superoxid anjoner och producerar en högre ljusintensitet än övriga fluorescerande sonder i celler, vävnader och helblod1,2,3, 4. det har lyckat använts för i vivo imaging i murina modeller att studera flera inflammatoriska sjukdomar, inklusive artrit och kolit5,6. Det har ännu inte vara anställd i ett etablerat kutana sår läkning modell. Mätning av ROS som genereras är lika relevanta för att bedöma utvecklingen av sårläkning under olika förhållanden. Känslighet och icke-invasiv art av denna metod gör det en lovande teknik för att studera sårläkning över murina modeller.
Nrf2 är en viktig drivkraft för antioxidant svaret och en transkriptionell faktor med specificitet för antioxidant svar elementet (är) gemensamma till arrangören regioner i flera antioxidant enzymer8. I avsaknad av oxidativ stress, är Nrf2 binds i cytoplasman av Keap1, som senare orsakar dess ubikvitinering och nedbrytning. Obalans av Nrf2/Keap1 väg har varit inblandad i olämpligt redox homeostas och fördröjd sårläkning i fastställandet av ökad oxidativ stress9. Vi har tidigare visat att undertryckandet av Keap1 stimulerar ökad Nrf2 aktivitet och främjar räddning av patologiska kutan sårläkning i diabetiker sår9.
Här beskriver vi ett protokoll som använder L-012-assisted Mareld imaging för att mäta ROS i en excisional kutana sår helande modell, som är kritiska för att belysa sambandet mellan ROS och sårläkning. Denna teknik visar realtid förändringar i oxidativ börda inom sår och omedelbar periferi. Dessutom tillåter denna metod för snabb bedömning av insatser och mekanismer som påverkar redox hantering. Här använder vi en modell av Keap1 knockdown för restaurering av redox homeostas för att utvärdera tillämpligheten av vår strategi. Eftersom vår teknik är icke-invasiv och sår är ostört, kan samma djur användas för ytterligare bekräftande analyser utifrån histologi eller cell lysates.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén av New York University School of Medicine. Alla möss ligger bakom en barriär och all personal bära lämplig personlig skyddsutrustning.
1. dag 0: Beredning av murina modell av Excisional sårläkning
- Söva diabetiker (Leprdb/db) möss, åldern 8 – 12 veckor, med inhalational 2% isofluran. Bekräfta att varje mus har varit ordentligt sövda med foten pad nypa testet. Gäller sterila okulär smörjmedel för varje öga för att förhindra irritation från torrhet. Forskare bör följa deras institutionella veterinärpersonal riktlinjer när anesthetizing djur med isofluran.
- Väga möss och registrera varje mus kroppsvikt. Bekräfta diabetiker status för djur genom inspelning blodsockret på varje djur som använder en Glukometer.
- Desinficera processuella arbetsyta och anestesi utrustning. Ta bort dorsala hår av mössen använder en hår trimmer, följt av tillämpning av hår borttagning lotion att torka bort överflödigt hår. Använd desinfektionsservetter för att rengöra utsatta huden, två gånger och låt torka.
- Skapa två 10 mm fullhudsskador sår sträcker sig genom den panniculus carnosus med steril 10 mm biopsi slag enligt en väletablerad excisional sårläkning teknik7,8. Använd sterila handskar för alla överlevnad kirurgi. Autoklav alla kirurgiska instrument i påsar innan kirurgi och öppna endast i operationsområdet.
- Splint såren öppna med en 0,5 mm tjockt silikon ark med 10 mm cirkulär utskärningar och säkra stent i plats med avbrutna 4-0 silk suturer.
- Följande operation, ta bort djuren från anestesi och placera på värmedyna för att underlätta korrekt återvinning. Notera, om djurens kroppstemperatur minskar under förfarandet, kan djuret flyttas till värmedyna tidigare att minimera kroppen värmeförluster under narkos. Övervaka djuren tills de är vaken och mobil.
- När helt återställd, returnera djur till enskilda burar, som innehåller mat och vatten (se till att viss mat är på golvet i buren för postoperativ berikning). Ge riven hushållspapper som ytterligare häckande material i 2 veckor. Inte hus djur som genomgått kirurgi med andra djur, att förhindra skadliga interaktioner och ändringar i såret helande status.
- För postoperativ smärtlindring, injicera möss subkutant med buprenorfin vid 0,1 mg/kg kroppsvikt två gånger om dagen, börjar omedelbart efter förfarandet, för 3 dagar.
2. dag 1: Förberedelse av Keap1 siRNA
Obs: Förbereda alla behandlingar inuti en biosäkerhet skåp.
- Förbereda siRNA utspädning genom att kombinera 37,5 µL av minskade serum medium med 12,5 µL 20 µM Keap1 siRNA (siKeap1) (250 pmol) i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör på is.
- Förbereda Liposom utspädning genom att kombinera 25 µL av minskade serum medium med 25 µL för Liposom mix i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Tillsätt 50 µL siRNA utspädning i 50 µL Liposom utspädning droppvis (1:1 volym), och blanda försiktigt.
- Inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 50 μl av 2% metylcellulosa gel i vatten och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner.
- Behandla varje djur med antingen en nonsens siNS (kontroll) eller siKeap1 (experimentell). Applicera gelen till toppen av såret. Wrap djurets överkropp med genomskinlig film dressing att hålla gel på plats, att hålla armar och ben fritt att upprätthålla rörlighet.
3. dag 3: Beredning av L-012 lösning
Obs: Förbereda alla reagenser i en biosäkerhet skåp.
- I ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, förbereda L-012 i 1 X PBS vid en koncentration av 0,5 mg/100 mL.
- Manuellt vortex mikrocentrifug röret. L-012 löser helt sig inte i PBS, men den bör skjutas upp jämnt i vätskan. Notera, försök inte att upplösa L-012 i vatten för att undvika störande fysiologiska elektrolytbalans efter injektion.
- Över lösningen till en 1 mL spruta med en 27 G nål.
Obs: Tänk på att skydda den L-012 lösningen från ljus.
4. dag 3: In Vivo Imaging av diabetiska sår
- Söva möss med inhalational 2% isofluran. Forskare bör följa deras institutionella veterinärpersonal riktlinjer när anesthetizing djur med isofluran. Bekräfta att varje mus har varit ordentligt sövda med foten pad nypa testet. Gäller sterila okulär smörjmedel för varje öga för att förhindra irritation från torrhet.
- Ta försiktigt bort den genomskinliga filmen dressingen från möss utan att störa sår.
- Placera möss i imaging kammaren i sina respektive order. För att bibehålla korrekt O2 nivåer i kammaren, ange imaging system inflödet och induktion kammare O2 nivåer till 1,0 L/min.
- Bild på möss för Mareld och fotografi vid studiestart före injektion av L-012 förening.
- Torka buken med spritkompresser och låt torka. Utföra en intraperitoneal injektion av L-012 lösningen 5 mg per 200 g kroppsvikt med en 27-gauge nål. Till exempel får en mus som väger 20 gram 0,5 mg L-012.
- Omedelbart efter den L-012 injektionen, placera mössen tillbaka i sina respektive platser i imaging kammaren. Bild på möss under loppet av 60 minuter, 1 minut med 4 minuters mellanrum. Definiera 10 mm såret som regionen av intresse för att bestämma nivån på ROS.
- Följande operation, ta bort djuren från anestesi och placera på värmedyna för att underlätta korrekt återvinning. Övervaka djuren tills de är vaken och mobil.
- När helt återställd, returnera djur till enskilda burar, att upprätthålla samma postoperativ berikande miljö tidigare beskrivits i 1.6. Inte hus djur som genomgått kirurgi med andra djur, att förhindra skadliga interaktioner och ändringar i såret helande status.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre dagar efter att skapa bilaterala sår enligt en etablerad excisional såret modell (figur 1A), är diabetiska möss placerade i imaging kammaren. Ett inledande fotografi och ett mått på Mareld tas före injektion av L-012 att redovisa bakgrund signal (figur 1B). Efter intraperitoneal injektion med lösningen L-012 mössen flyttas i kammaren och Mareld visualiseras i områden av såret där ROS detekteras (figur 1 c),. Efter att välja rätt imaging och inställningar som beskrivs i figur 2, fortsätta med imaging. Mareld registreras för 1 minut med 5 minuters mellanrum under loppet av 60 minuter (figur 3). Detta visar Mareld mättnaden i regionen av intresse över tid. I vår djurmodell fastställdes optimal avbildning tiden till komplett L-012 mättnad vara 50 min, varefter ingen märkbar skillnad i Mareld var uppskattat. Detta kommer att variera beroende på djurets modellen utnyttjas och bör bestämmas självständigt och optimerad för varierande såret modeller beroende på storlek, djur typ, behandling, etc.
En region av intresse (ROI) för att kvantifiera Mareld begränsad till diabetiker sårområdet ritas på vybilden (figur 4). Dessa ROIs definieras på samma sätt för alla sår inklusive före L-012 injektion (figur 4A) och efter L-012 injektion i nonsens siRNA-behandlade (figur 4B) och Keap1 siRNA-behandlade möss (figur 4 c). Mareld beräknades genom att dividera total räkningarna av ljusintensiteten genom området. Tabell 1 visar beräkningarna i diagram i figur 4 d. De nonsens siRNA-behandlade diabetiska sår hade 45,775 11,649 Mareld/cm2, medan Keap1 dämpning resulterade i 19,405 5,939 Mareld/cm2 (genomsnittlig SD). En students t-test visade en signifikant minskad Mareld (p = 0,042) i den Keap1 siRNA-behandlade sår jämfört med nonsens siRNA-behandlade sår, korrelerar med lägre oxidativ börda med högre Nrf2 aktivitet (figur 4 D). att bekräfta att den relativa nivån av ROS visualiseras av L-012 på siNS och siKeap1 korrelerar med andra etablerade metoder för att mäta inflammation, analyserade vi 10 dagars sår vävnadssnitt. H & E fläckar visade minskad cellulär infiltration i siKeap1-behandlade sår i motsats till siNS-behandlade sådana, som visar minskad inflammatorisk morfologi (figur 5A). Immunoreaktivitet F4/80, en markör för protein makrofag (röd fluorescens) på såret vävnadssnitt visade minskad makrofager i siKeap1 behandlas sår jämfört med siNS-behandlade sår (figur 5B). Detta visar vidare att ROS nivåerna visualiseras av L-012 är korrekta och korrelerar med andra etablerade ROS mätning modeller. Kritiskt, tillämpa denna teknik inte förutsätter att offra djur för vävnadssnitt som krävs för H & E och immunofluorescens färgning.
Figur 1: Experimental set-up för imaging. (A) diabetiska möss såras använder en etablerad excisional såret modell. (B) en baslinje överlagring av fotografi med Mareld pre-L-012 injektion. (C) efter intraperitoneal injektion med L-012, ROS visualiseras. Luminiscens skala för B och C. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Bild och analys inställningar i in vitro- imaging system-program. (A) Välj ”Imaging Wizard” på förvärvet Kontrollpanelen (röd pil). (B) ”Mareld Imaging” är imaging-läget valts. (C) ”öppna filter” är valt som mätteknik. (D) Imaging ämne valt är ”mouse” och alternativet ”time series studie” är markerad. Det totala antalet segment och fördröjningstiden mellan segmenten är ingång. (E) Välj ”förvärva Sequence” att gå vidare med imaging. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: longitudinella studier i vivo ROS Imaging. Diabetiska möss är avbildas för 1 minut efter intraperitoneal injektion med L-012 på 5 minuters intervaller under loppet av 60 min. röda cirklar: ROI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: kvantifiera Mareld. Fotografier med Mareld överlagring av diabetiska sår (A) före L-012 injektion, (B) med sår behandlas med synder efter L-012 injektionen, och (C) med sår behandlas med siKeap1 efter L-012 injektion. (D) kvantifiering av genomsnittliga Mareld dividerat med ytan av ROIs för synder och siKeap1 behandlade sår. Gula cirklar: ROI. Data representeras som mean±standard avvikelse; p < 0,05, n = 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: ROS korrelationer med immunhistokemisk fläckar. (A) H & E fläckar av diabetiker sår vävnadssnitt på 10 dagar visade minskad cellulär infiltrera som bevis för minskad inflammatorisk morfologi i siKeap1 behandlas sår jämfört med siNS -behandlade sår. (B) F4/80 immunofluorescens (röd) visade minskat antal makrofager i siKeap1 behandlas såret sektioner 10 dagar jämfört med deras siNS -behandlade motsvarigheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| ROI | Si | Totalt räknar | AVG räknas | STDAV räknas | Området [cm²] | Totalt räknar/område | Genomsnittliga räknas/område |
| ROI 1 | NS | 9.38E + 03 | 1.14E + 02 | 3.85E + 01 | 2.48E-01 | 3.78E + 04 | 4.58E + 04 |
| ROI 2 | NS | 4.68E + 03 | 5.37E + 01 | 3.13E + 01 | 2.63E-01 | 1.78E + 04 | |
| ROI 3 | NS | 1.72E + 04 | 2.18E + 02 | 1.54E + 02 | 2.39E-01 | 7.20E + 04 | |
| ROI 4 | NS | 1.24E + 04 | 1.68E + 02 | 8.41E + 01 | 2.24E-01 | 5.55E + 04 | |
| ROI 5 | Keap1 | 3.21E + 03 | 3.41E + 01 | 2.76E + 01 | 2.84E-01 | 1.13E + 04 | 1.94E + 04 |
| ROI 6 | Keap1 | 2.56E + 03 | 2.88E + 01 | 1.06E + 01 | 2.69E-01 | 9.52E + 03 | |
| ROI 7 | Keap1 | 4.92E + 03 | 6.48E + 01 | 5.03E + 01 | 2.30E-01 | 2.14E + 04 | |
| ROI 8 | Keap1 | 8.34E + 03 | 1.07E + 02 | 5.25E + 01 | 2.36E-01 | 3.54E + 04 |
Tabell 1: kvantifiera Mareld för definierade ROIs. Mareld mäts för varje ROI och standardiseras i förhållande till ytan. Beräkningar för medelvärde, standardavvikelse och medelfel beräknas med detta. ROI 1, 2, 3 och 4 utgör ROI från sår av biologiska repetitioner av synder behandlas diabetiska sår och ROI 5, 6, 7 och 8 utgör ROIs från biologiska repetitioner av siKeap1 behandlade diabetiska sår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanliga tekniker för att mäta ROS har begränsats av komplexa protokoll som kräver vävnad utvinning eller liknande invasiva metoder. Under de senaste åren har mätningar av oxidativ stress rapporterats på grundval av innovativa avbildningsmetoder, vilket gör det möjligt för spatiotemporal bedömningar9,10,11. L-012 har flera fördelar som en kemiluminiscent sond i förhållande till urin, lucigenin och MCLA1,4. Föreningen är giftfri, lätt absorberas, och har mycket starkare Mareld jämfört med urin eller liknande sonder12. Kritiskt, L-012 kan säkert ges flera gånger i kontinuum för längsgående analys utan några negativa effekter eller skada djur modellerar6. Denna strategi kräver begränsad specialutbildning och utrustningen som behövs är lätt tillgänglig i de flesta forskningslaboratorier, vilket gör det till ett allmänt tillgängligt protokoll.
För optimal användning föreslår vi att reagenser vara ordentligt uppdaterade och skyddade från ljus för att undvika nedbrytning. Humanisera sår genom stentning möjliggör murina sår att läka genom migration och återepitelisation, i motsats till genom betydande sammandragning. Suturer placeras två tredjedelar av vägen genom stent omkretsen att säkra såret kanter på plats. Inslagning möss med genomskinlig film dressing efter gel ansökan säkerställer att utvärtes behandlingar kvar. För att förhindra självförvållade sår hos mössen som kan blanda ihop resultaten, får bitter smak spray tillämpas på periferin och sutur knutar att avskräcka bita. L-012 har begränsad löslighet i PBS men kommer att bilda en suspension av repetitiv pipettering av lösningen. Felsökningsåtgärderna åtgärder säkerställa samstämmigheten mellan olika sår, eliminera mellan användaren variabilitet djur hybridbränsle. Eftersom denna teknik är beroende av en intraperitoneal injektion av en lösning i en djurmodell, finns det flera andra störande faktorer inneboende till de djur som inte kan kontrolleras. Exempelvis dikteras lokala blodflödet och efterföljande absorption och lokalisering av L-012 till områden av intresse inte. Denna variabel kan dock mildras med hjälp av ett djur som sin egen interna kontroll så att ett sår kan behandlas med siNS och den andra med siKeap1.
Vi rapporterar om nyttan av en strategi för in-vivo studier av ROS i en kutan sårläkning modell. I våra aktuella studien, behandling av sår med Keap1 siRNA resulterade i minskad oxidativ börda som bekräftar vår förståelse av betydelsen av Nrf2 /Keap1 väg för antioxidant hantering. Även denna metod möjliggör kvantitativ analys, finns det ett antal viktiga begränsningar. Medan L-012 är mycket känslig, det är inte specifikt för ROS och har visat att också reagera på reaktiva kväve arter6. Ytterligare analys med riktade sonder och immunoassay-baserade metoder kompletterar detta tillvägagångssätt genom förbättrad specificitet och subcellulär lokalisering av ROS korrelerar13. Den föreslagna mekanismen för L-012-baserade Mareld innebär oxidation av L-012 av molekylärt syre genom aktiviteten av peroxidas i kombination med H2O212. Detta begränsar användningen av denna teknik för att studera antioxidant enzymhämmare som samverkar med peroxidas. Mer detaljerad analys avsedd att specifikt kvantifiera ROS än superoxid anjon eller reaktiva kväve arter metaboliter går inte med den nuvarande strategin.
Tanke på L-012 hög känslighet för att upptäcka ROS i stort, är det lätt anpassningsbar för olika kutan sårläkning och andra vävnad modeller. Vi har visat lämpligheten av denna teknik för att bedöma redox följderna av riktade therapeutics till diabetiska sår såsom RTA 408 och lipoproteoplex leverans av Keap1 siRNA14,15. Med tanke på de betydande styrkorna i detta protokoll, finns det enorma framtida potential vid tillämpningen av liknande strategier för att studera ROS inom djupare fack genom ex vivo metoder, fokuserad dissektioner och organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inga upplysningar till rapport.
Acknowledgments
Vi är tacksamma till preklinisk Imaging kärnan vid NYU School of Medicine, med särskilt tack till Orlando Aristizabal och Youssef Zaim Wadghiri. Kärnan är en delad resurs som delvis stöds av Laura och Isaac Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087 och NIBIB biomedicinsk teknik Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Detta arbete stöds av American Diabetes Association ”Pathway att stoppa Diabetes” till D.C. [bidrag nummer 1-16-ACE-08] och NYU tillämpad forskning stödfonden till P.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
- Nishinaka, Y., et al. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Daiber, A., et al. Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012. Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).
- Imada, I., et al. Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012. Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).
- Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012. Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).
- Fuchs, K., et al. In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation. The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).
- Asghar, M. N., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).
- Soares, M. A., et al. Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche. Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).
- Wang, X., et al. Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).
- Kielland, A., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).
- Balke, J., et al. Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging. Small. , (2018).
- Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation. Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Rabbani, P. S., et al. Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds. Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).
- Rabbani, P. S., et al. Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing. Biomaterials. 132, 1-15 (2017).
