Summary
Vi beskriver en ikke-invasiv i vivo imaging som er effektiv og kostnadseffektiv, bruker L-012, en chemiluminescent luminol-analog, visualisere og kvantifisere reaktive oksygen arter (ROS) generert i en mus excisional sår modell.
Abstract
Generering av reaktive oksygen arter (ROS) er et kjennetegn på inflammatoriske prosesser, men i overkant, oksidativt stress er mye involvert i ulike patologi som kreft, åreforkalkning og diabetes. Vi har tidligere vist at dysfunksjon av den kjernefysiske faktoren (erythroid-avledet 2)-som 2 (Nrf2) / Kelch-like erythroid cellen-avledet protein 1 (Keap1) signalering sti fører til ekstrem ROS ubalanse under kutan sårtilheling i diabetes. Siden ROS nivåer er en viktig indikator for utviklingen av sårheling, er spesifikk og nøyaktig kvantifisering teknikker verdifull. Flere i vitro analyser måle ROS i celler og vev har blitt beskrevet; men gir de bare et enkelt kumulative mål per prøve. Flere nylig, har utviklingen av protein-basert indikatorer og tenkelig modaliteter tillatt for unike spatiotemporal analyser. L-012 (C13H8ClN4NaO2) er en luminol som kan brukes både i vivo og i vitro chemiluminescent påvisning av ROS generert av NAPDH oksidase. L-012 avgir et sterkere signal enn andre fluorescerende sonder og har vist seg å være både sensitiv og pålitelig for å oppdage ROS. Tid forfalle anvendelse av L-012-tilrettelagt imaging gir verdifull informasjon om inflammatoriske prosesser samtidig redusere behovet for offer og reduserer samlede studie dyr. Her beskriver vi en protokoll utnytte L-012-tilrettelagt i vivo for å kvantifisere oksidativt stress i en modell av excisional sårheling diabetiker mus med lokalt dysfunksjonelle Nrf2/Keap1.
Introduction
Oksygen metabolitter generert gjennom inflammatoriske prosesser bidra til ulike signalnettverk cascades samt destruktive endring av cellulære komponenter1. Utnytte følsom og spesifikke teknikker for å måle ROS er avgjørende for å studere inflammatoriske prosesser og karakterisere effekten av oksidativt stress. I vivo imaging er verdifullt på grunn av sin evne til å levere dynamisk romlige og tidsmessige data i levende vev. L-012 er en syntetisk chemiluminescent sonde som er svært følsom for superoxide anioner og produserer høyere lav intensitet enn andre fluorescerende sonder i celler og vev fullblod1,2,3, 4. det har vært vellykket ansatt i vivo imaging i murine modeller å studere flere inflammatoriske sykdommer, inkludert leddgikt og kolitt5,6. Det har ennå å være ansatt i en etablert kutan sårheling modell. Måling av ROS generert er like relevant å vurdere utviklingen av sårheling under ulike forhold. Den sensitivitet og noninvasive natur denne metoden gjør det en lovende teknikk for å studere sårheling over murine modeller.
Nrf2 er en viktig drivkraft av antioksidant respons og en transcriptional faktor med spesifisitet for antioksidant svar element (er) felles for regionene arrangøren av flere antioksidant enzymer8. I fravær av oksidativt stress, er Nrf2 sequestered i cytoplasma av Keap1, som senere fører til sin ubiquitination og fornedrelse. Ubalanse i Nrf2/Keap1 veien har vært innblandet i upassende redoks homeostasis og forsinket sårheling i innstillingen for økt oksidativt stress9. Vi har tidligere vist at undertrykkelse av Keap1 stimulerer økt Nrf2 aktivitet og fremmer redning av patologisk kutan sårheling i diabetiker sår9.
Her beskriver vi en protokoll som benytter L-012-assistert bioluminescens for å måle ROS nivåer i en excisional kutan sår helbredelse modell, som er avgjørende for å markere tilknytningen mellom ROS og sår helbredelse. Denne teknikken viser sanntid endringer i oksidativt byrden sår og umiddelbar periferi. Videre, denne metoden tillater rask vurdering av tiltak og mekanismer som påvirker redoks håndtering. Her bruker vi en modell av Keap1 knockdown for restaurering av redoks homeostase evaluere anvendelsen av vår strategi. Fordi våre teknikken er ikke-invasiv og sår er uforstyrret, benyttes samme dyret for videre bekreftende analyser basert på histology eller celle lysates.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av New York University School of Medicine. Alle mus er plassert bak en barriere og alle ansatte bærer riktig personlig verneutstyr.
1. dag 0: Forberedelse av Murine modell av Excisional sårheling
- Bedøve diabetiker (Leprdb/db) mus, alderen 8-12 uker, med inhalasjon-anestesimiddel 2% isoflurane. Bekreft at hver musen har vært riktig anesthetized ved hjelp av fot pad knipe testen. Bakteriefri ocular smøremiddel gjelde hvert øye å hindre irritasjon fra tørrhet. Forskere bør følge deres institusjonelle veterinary stab retningslinjer når anesthetizing dyr med isoflurane.
- Veie mus og registrere kroppsvekten av hver musen. Bekreft statusen diabetiker dyr ved blodsukker av hvert dyr med en glucosemåler.
- Desinfiser fremgangsmåter for arbeidsområdet og anestesi utstyr. Fjerne dorsal hår av mus med et hår trimmer, etterfulgt av bruk av hår fjerning lotion å tørke bort overmålet håret. Bruk alkohol wipes for å rengjøre den utsatte huden, to ganger, og la det tørke.
- Opprett to 10 mm full-tykkelse sår utvide gjennom panniculus carnosus bruker sterilt 10 mm biopsi slag etter en veletablert excisional sårheling teknikk7,8. Sterile hansken brukes for alle overlevelse kirurgi. Autoclave alle kirurgiske instrumenter i poser før kirurgi og åpen kirurgiske feltet.
- Skinne sårene åpne en 0,5 mm tykk silikon ark med 10 mm sirkulære åpninger og sikre stents i stedet bruke avbrutt 4-0 silke suturer.
- Etter kirurgi, fjerne dyr fra anestesi og plasser på varmeputen for å lette riktig. Av notatet, hvis dyr kroppstemperatur synker under inngrepet, kan dyret flyttes til oppvarming pad tidligere å minimere kropp heten forlis under narkose. Overvåke dyrene før de er våken og mobil.
- En gang fullt gjenopprettet, retur dyr til individuelle bur, med mat og vann (sikre mat er på gulvet i buret for postoperativ berikelse). Gi makulert papirhåndklær flere hekke materiale i 2 uker. Ikke huset dyr som har gjennomgått kirurgi med andre dyr, å forhindre uheldige interaksjoner og endringer i sår helbredelse status.
- For postoperativ smertelindring, injisere mus subcutaneously med buprenorfin på 0,1 mg/kg kroppsvekt to ganger om dagen, starter umiddelbart etter prosedyren for 3 dager.
2. dag 1: Klargjøring av Keap1 siRNA
Merk: Forbered alle behandlinger innenfor en biosafety kabinett.
- Forberede siRNA fortynning ved å kombinere 37,5 µL av redusert serum medium med 12.5 µL av 20 µM Keap1 siRNA (siKeap1) (250 pmol) i en 1,5 mL microcentrifuge rør på is.
- Forberede liposome fortynning ved å kombinere 25 µL av redusert serum medium med 25 µL av liposome blanding i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Legge til 50 µL av siRNA fortynning 50 µL liposome fortynning dropwise (1:1-volum) og bland forsiktig.
- Inkuber i 20 minutter ved romtemperatur.
- Legg 50 µL av 2% methylcellulose gel i vann og bland forsiktig av pipettering opp og ned.
- Behandle hvert dyr med enten en tull siNS (kontroll) eller siKeap1 (eksperimentell). Bruke gel til toppen av såret. Pakk dyr overkropp med gjennomsiktige filmen dressing å holde gel på plass, holde beina gratis å opprettholde mobilitet.
3. dag 3: Utarbeidelse av L-012 løsning
Merk: Forberede reagenser i en biosafety kabinett.
- I en 1,5 mL microcentrifuge tube, Forbered L-012 i 1 X PBS i en konsentrasjon på 0,5 mg/100 mL.
- Manuelt vortex microcentrifuge røret. L-012 løses ikke helt i PBS, men det bør være jevnt suspendert i væsken. Av notatet, ikke forsøk å oppløse L-012 i vann for å unngå urovekkende fysiologiske elektrolytt balanse etter injeksjon.
- Overføre løsningen til en 1 mL sprøyte bruker en 27 G nål.
Merk: Husk å beskytte L-012 løsningen fra lys.
4. dag 3: I Vivo Imaging av diabetiker sår
- Bedøve mus med inhalasjon-anestesimiddel 2% isoflurane. Forskere bør følge deres institusjonelle veterinary stab retningslinjer når anesthetizing dyr med isoflurane. Bekreft at hver musen har vært riktig anesthetized ved hjelp av fot pad knipe testen. Bakteriefri ocular smøremiddel gjelde hvert øye å hindre irritasjon fra tørrhet.
- Fjern gjennomsiktig film dressing fra mus uten å forstyrre sår.
- Plass musene i tenkelig kammer i sine respektive bestillinger. For å opprettholde riktig O2 nivå i kammeret, sette tenkelig system tilsig og induksjon kammer O2 nivåer til 1,0 L/min.
- Bilde mus for bioluminescens og fotografi ved baseline før injeksjon av L-012 sammensatte.
- Tørk magen med alkohol wipes og la det tørke. Utføre en intraperitoneal injeksjon av L-012 løsningen på 5 mg per 200 g kroppsvekt bruker en 27-gauge nål. For eksempel skal en mus veier 20 g motta 0,5 mg av L-012.
- Umiddelbart etter L-012 injeksjon, plassere musene tilbake i sine respektive steder i tenkelig kammeret. Bilde musene i løpet av 60 minutter, i 1 minutt på 4 minutters intervaller. Definere 10 mm såret som regionen rundt for å bestemme nivået av ROS.
- Etter kirurgi, fjerne dyr fra anestesi og plasser på varmeputen for å lette riktig. Overvåke dyrene før de er våken og mobil.
- En gang fullt gjenopprettet, retur dyr til individuelle bur, opprettholde samme postoperativ berikelse miljø tidligere beskrevet i 1.6. Ikke huset dyr som har gjennomgått kirurgi med andre dyr, å forhindre uheldige interaksjoner og endringer i sår helbredelse status.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre dager etter å skape bilaterale sår etter en etablert excisional såret modell (figur 1A), er diabetiker mus plassert i tenkelig kammeret. En første fotografi og et mål på bioluminescens tas før injeksjon av L-012 å ta hensyn til bakgrunn signal (figur 1B). Intraperitoneal injeksjon med L-012 løsning, musene omplasseres i kammeret og bioluminesens er visualisert i områder av såret der ROS oppdages (figur 1 c). Når du har valgt den riktige bildebehandling og analyse Fortsett innstillingene som beskrevet i figur 2, med bildebehandling. Bioluminescens registreres i 1 minutt på 5 minutters intervaller i løpet av 60 minutter (Figur 3). Dette viser bioluminescens metning i regionen rundt over tid. I vår dyremodell, ble optimal tenkelig tid å nå komplett L-012 metning identifisert som 50 min, etter som ingen merkbar forskjell i bioluminescens ble verdsatt. Denne gangen vil variere avhengig av dyret modell benyttes, og skal være uavhengig bestemt og optimalisert for varierende såret modeller avhengig av størrelse, dyr type, behandling, etc.
Et område av interesse (ROI) for å kvantifisere bioluminescens begrenset til diabetiker såret området trekkes på overleggsbildet (Figur 4). Disse ROIs defineres på samme måte for alle sår inkludert før L-012 injeksjon (figur 4A) og etter L-012 injeksjon i tull siRNA-behandlet (figur 4B) og Keap1 siRNA-behandlet mus (figur 4C). Bioluminescens ble beregnet ved å dele de totale antall lysintensiteten av området. Tabell 1 viser beregningene grafisk i Figur 4 d. Tull siRNA-behandlet diabetiker sårene hadde 45,775 11,649 bioluminescens/cm2, mens Keap1 undertrykkelse resulterte i 19,405 5,939 bioluminescens/cm2 (mener SD). En Student t-test viste en betydelig redusert bioluminescens (p = 0.042) i den Keap1 siRNA-behandlet sår i forhold til tøv siRNA-behandlet sår, samkjøre med lavere oksidativ byrden med høyere Nrf2 aktivitet (figur 4 D). Å bekrefte at den relative nivået av ROS visualisert ved L-012 på siNS og siKeap1 relatere til andre etablerte måte å måle betennelse, vi analyserte 10 dagers sår vev deler. H & E flekker viste redusert cellular infiltrasjon i siKeap1-behandlet sår i motsetning siNS-behandlet seg, som angir redusert inflammatorisk morfologi (figur 5A). Immunoreactivity av F4/80, merketråd protein macrophage (rød fluorescens) på såret vev deler avslørt redusert makrofager i siKeap1 behandlet sår i forhold til siNS-behandlet sår (figur 5B). Dette viser videre at ROS nivåene visualisert ved L-012 er nøyaktige og correlate med andre etablerte ROS måling modeller. Kritisk, bruke denne teknikken ikke nødvendig å ofre dyr vev deler er nødvendig for t & E og immunofluorescence flekker.
Figur 1: eksperimentelle set-up for bildebehandling. (A) diabetiker mus er såret ved hjelp av en etablert excisional såret modell. (B) en planlagt overlapping av fotografi med bioluminescens pre-L-012 injeksjon. (C) etter intraperitoneal injeksjon med L-012, ROS er visualisert. Luminescence skala for B og C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Innstillinger for bilde og analyse i i vitro imaging system-programmet. (A) Velg "Imaging Wizard" på kontrollpanelet oppkjøp (rød pil). (B) "Bioluminescens tenkelig" er valgt tenkelig modus. (C) "åpne filter" er valgt som måleverdien teknikken. (D) Imaging emne valgt er "mus" og "tid serien studie" alternativet er valgt. Totalt antall segmenter og tidsforsinkelsen mellom segmenter registreres. (E) Velg "erverve Sequence" fortsette med bildebehandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: longitudinelle studier av i vivo ROS imaging. Diabetiker mus er fotografert for minutter etter intraperitoneal injeksjon med L-012 på 5 minutters intervaller i løpet av 60 min. røde sirkler: Avkastningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: kvantifisere bioluminescens. Bilder med bioluminescens overlapping av diabetiker sår (A) før L-012 injeksjon, (B) med sår behandlet med synder etter L-012 injeksjon, og (C) med sår behandlet med siKeap1 etter L-012 injeksjon. (D) kvantifisering av gjennomsnittlig bioluminescens delt areal på ROIs for synder og siKeap1 behandlet sår. Gule sirkler: Avkastningen. Dataene er representert som mean±standard avvik; p < 0,05, n = 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: ROS korrelasjoner med immunohistochemical flekker. (A) H & E flekker diabetiker såret vev deler 10 dager viste redusert mobilnettet infiltrere som bevis for redusert inflammatorisk morfologi i siKeap1 behandlet sår i forhold til siNS -behandlet sår. (B) F4/80 immunofluorescence (rød) viste redusert antall makrofager i siKeap1 behandlet sår deler 10 dager i forhold til deres siNS -behandlet kolleger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| AVKASTNING | si | Totalt antall | AVG teller | STDAV teller | Området [cm ²] | Teller/areal | Gjennomsnittlig antall/område |
| ROI 1 | NS | 9.38E + 03 | 1.14E + 02 | 3.85E + 01 | 2.48E-01 | 3.78E + 04 | 4.58E + 04 |
| AVKASTNING 2 | NS | 4.68E + 03 | 5.37E + 01 | 3.13E + 01 | 2.63E-01 | 1.78E + 04 | |
| ROI 3 | NS | 1.72E + 04 | 2.18E + 02 | 1.54E + 02 | 2.39E-01 | 7.20E + 04 | |
| ROI 4 | NS | 1.24E + 04 | 1.68E + 02 | 8.41E + 01 | 2.24E-01 | 5.55E + 04 | |
| ROI 5 | Keap1 | 3.21E + 03 | 3.41E + 01 | 2.76E + 01 | 2.84E-01 | 1.13E + 04 | 1.94E + 04 |
| ROI 6 | Keap1 | 2.56E + 03 | 2.88E + 01 | 1.06E + 01 | 2.69E-01 | 9.52E + 03 | |
| ROI 7 | Keap1 | 4.92E + 03 | 6.48E + 01 | 5.03E + 01 | 2.30E-01 | 2.14E + 04 | |
| ROI 8 | Keap1 | 8.34E + 03 | 1.07E + 02 | 5.25E + 01 | 2.36E-01 | 3.54E + 04 |
Tabell 1: kvantifisere bioluminescens for definert ROIs. Bioluminescens måles for hver avkastning og standardisert i forhold til arealet. Beregninger for gjennomsnitt, standardavvik og standardfeil beregnes tilsvarende. ROI 1, 2, 3 og 4 representerer avkastning sår av biologiske gjentar forlatelse behandlet diabetiker sår og Avkastningen 5, 6, 7 og 8 representerer ROIs fra biologiske gjentakelser av siKeap1 behandlet diabetiker sår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanlige teknikker for måling av ROS har vært begrenset av komplekse protokoller som krever vev utvinning eller tilsvarende invasiv teknikker. De siste årene, har målinger av oksidativt stress blitt rapportert på grunnlag av nyskapende tenkelig modaliteter, og dermed muliggjør spatiotemporal vurderinger9,10,11. L-012 har flere fordeler som en chemiluminescent sonde i forhold til luminol, lucigenin og MCLA1,4. Sammensatt er giftig, lett absorbert, og har mye sterkere bioluminescens sammenlignet med luminol eller lignende sonder12. Kritisk, L-012 kan trygt gis flere ganger i kontinuum for langsgående analyse uten bivirkninger eller skade dyr modeller6. Denne strategien krever begrenset spesiell opplæring, og nødvendig utstyr er tilgjengelig i de fleste forskningslaboratorier, gjør det en allment tilgjengelig protokoll.
For optimal bruk anbefaler vi at reagenser være riktig oppdatert og beskyttet mot lyset å unngå degradering. Humanisering sår gjennom stenting gir murine sår å helbrede gjennom migrasjon og re epithelialization, i motsetning til av betydelig sammentrekning. Suturer plasseres to tredjedeler av veien gjennom stent omkretsen å sikre såret kantene på plass. Innpakning mus med gjennomsiktige filmen dressing etter gel programmet sikrer at aktuelle behandlinger forblir på plass. For å hindre selvpåførte sår i mus, som kan forvirre resultater, kan bitter-smaker spray brukes på periferi og Sutur knuter å motvirke bite. L-012 har begrenset løslighet i PBS men vil form en suspensjon av repeterende pipettering av løsningen. Disse feilsøking tiltak sikre konsekvens over forskjellige sår, eliminere mellom brukeren variasjon samtidig dyr komfort. Siden denne teknikken er avhengig av intraperitoneal injeksjon av en løsning i en dyremodell, er det forstyrrende faktorer iboende å dyrene som ikke kan kontrolleres. For eksempel kan ikke lokale blodstrøm og påfølgende absorpsjon og lokalisering av L-012 til områder av interesse angis. Men kan denne variabelen gjøres ved hjelp av et dyr som sin egen interne kontroll slik at en sår kan behandles med siNS og den andre med siKeap1.
Vi rapporterer om nytten av en strategi for å studere i vivo ROS i en cutaneous sårheling modell. I vår nåværende studie, behandling av sår med Keap1 siRNA resulterte i redusert oksidativt byrden som bekrefter vår forståelse av betydningen av Nrf2 /Keap1 veien for antioksidant håndtering. Mens gir denne metoden kvantitativ analyse, er det en rekke viktige begrensninger. Mens L-012 er svært sensitive, det er ikke spesifikke for ROS og har vist seg å også reagerer på reaktivt nitrogen arter6. Videre analyse målrettet sonder og immunanalyse-baserte utfylle denne tilnærmingen gjennom forbedret spesifisitet og subcellular lokalisering av ROS korrelerer13. Den foreslåtte mekanismen for L-012-baserte bioluminescens innebærer oksidasjon av L-012 av molekylære oksygen gjennom aktiviteten til peroxidase i kombinasjon med H2O212. Dette begrenser bruk av denne teknikken for å studere antioksidant hemmere som samhandler med peroxidase. Mer detaljert analyse skal spesielt kvantifisere ROS enn superoxide anion eller reaktivt nitrogen arter metabolitter er ikke mulig med gjeldende strategi.
Gitt høy følsomheten til L-012 for å oppdage ROS forstand, er det lett tilpasses ulike kutan sårheling og andre vev modeller. Vi har vist hensiktsmessighet av denne teknikken for å vurdere redoks implikasjonene av målrettet therapeutics for diabetiker sår som RTA 408 og lipoproteoplex levering Keap1 siRNA14,15. Gitt de betydelige styrken av denne protokollen, er det enorme fremtiden potensialet i bruke lignende strategier for å studere ROS i dypere rom gjennom ex vivo tilnærminger, fokusert disseksjoner og organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen avsløringer rapporten.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til prekliniske Imaging kjernen ved NYU School of Medicine, med spesiell takk til Orlando Aristizabal og Youssef Zaim Wadghiri. Kjernen er en delt ressurs støttes delvis av Laura og Isaac Perlmutter Cancer Center støtte Grant NIH/NCI 5P30CA016087 og NIBIB biomedisinsk Technology Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Dette arbeidet ble støttet av American Diabetes Association "Sti å stoppe Diabetes" til DC [bevilgning nummer 1-16-ACE-08] og NYU anvendt forskning støtte fondet til PR
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
- Nishinaka, Y., et al. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Daiber, A., et al. Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012. Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).
- Imada, I., et al. Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012. Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).
- Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012. Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).
- Fuchs, K., et al. In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation. The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).
- Asghar, M. N., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).
- Soares, M. A., et al. Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche. Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).
- Wang, X., et al. Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).
- Kielland, A., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).
- Balke, J., et al. Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging. Small. , (2018).
- Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation. Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Rabbani, P. S., et al. Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds. Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).
- Rabbani, P. S., et al. Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing. Biomaterials. 132, 1-15 (2017).
