Summary
Describimos una invasiva en vivo imagen protocolo que es sencilla y económica, utilizando L-012, un análogo de quimioluminiscente luminol, para visualizar y cuantificar las especies de oxígeno reactivo (ROS) generadas en un modelo de ratón por escisión de la herida.
Abstract
La generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) es un rasgo distintivo de los procesos inflamatorios, pero en exceso, el estrés oxidativo está ampliamente implicado en diversas patologías como cáncer, aterosclerosis y diabetes. Previamente hemos demostrado que la disfunción del factor Nuclear (derivados del eritroide 2)-como 2 (Nrf2) / eritroide Kelch-como célula proteína derivada Keap 11señalización vía conduce al desequilibrio extremo de ROS durante cutáneo cicatrización en la diabetes. Puesto que los niveles ROS son un importante indicador de la progresión de la cicatrización de heridas, técnicas de cuantificación específicas y precisas son valiosas. Diversos estudios en vitro para medir ROS en las células y los tejidos han sido descritas; sin embargo, sólo proporcionan una medición acumulativa individual por muestra. Más recientemente, han permitido el desarrollo de indicadores basados en la proteína y de modalidades de imágenes únicos análisis espaciotemporal. L-012 (C13H8ClN4NaO2) es un derivado luminol que puede utilizar para tanto en vivo como en vitro quimioluminiscente detección de ROS generados por la oxidasa NAPDH. L-012 emite una señal más fuerte que otras sondas fluorescentes y se ha demostrado para ser sensible y confiable para la detección de ROS. La aplicabilidad de lapso de tiempo de L-012-facilitó la proyección de imagen proporciona información valiosa sobre los procesos inflamatorios mientras reduce la necesidad de sacrificio y en general reduciendo el número de animales de estudio. Aquí, describimos un protocolo utilizando L-012-facilitado en vivo la proyección de imagen para cuantificar el estrés oxidativo en un modelo de cicatrización de la herida excisional con ratones diabéticos de Nrf2/Keap1 localmente disfuncional.
Introduction
Metabolitos de oxígeno generados por procesos inflamatorios contribuyen a varias cascadas de señales así como alteraciones destructivas de componentes celulares1. Utilización de técnicas sensibles y específicas para medir ROS es crítica para el estudio de procesos inflamatorios y caracterización de los efectos del estrés oxidativo. Proyección de imagen in vivo es valioso debido a su capacidad para proporcionar datos dinámicos espaciales y temporales en tejido vivo. L-012 es una sintético sonda quimioluminiscente que es altamente sensible para los aniones superóxido y produce una mayor intensidad de luz que otras sondas fluorescentes en las células, tejidos y sangre entera1,2,3, 4. se ha empleado con éxito para obtener imágenes en vivo en modelos murinos para estudiar varias enfermedades inflamatorias, como artritis y colitis5,6. Aún no se ha empleado en una herida cutánea establecida modelo de curación. Medición de ROS generados es igualmente pertinente para evaluar la progresión de la cicatrización en condiciones diferentes. La sensibilidad y el carácter no invasivo de este método es una técnica prometedora para el estudio de la cicatrización de heridas a través de modelos murinos.
Nrf2 es un importante factor de la respuesta antioxidante y un factor transcripcional con especificidad para el elemento de respuesta antioxidante (es) común a las regiones promotoras de varios antioxidantes enzimas8. En ausencia de estrés oxidativo, el Nrf2 es secuestrado en el citoplasma por Keap1, que posteriormente causa su ubiquitinación y degradación. Desequilibrio de la vía Nrf2/Keap1 se ha implicado en la homeostasis redox inadecuado y retraso de la cicatrización de heridas en el ajuste del aumento del estrés oxidativo9. Previamente hemos demostrado que la supresión de Keap1 estimula la actividad creciente de Nrf2 y promueve el rescate de herida cutánea patológica curación en diabético hiere a9.
Aquí se describe un protocolo que utiliza bioluminiscencia L-012-asistido para medir los niveles de ROS en un modelo de curación herida cutánea por escisión, que es fundamental para destacar la asociación entre el ROS y la cicatrización de la proyección de imagen. Esta técnica muestra en tiempo real cambios en carga oxidativa dentro de las heridas y periferia inmediata. Además, este método permite una evaluación rápida de las intervenciones y mecanismos manejo de redox afectan. Aquí utilizamos un modelo de Keap1 caída para la restauración de la homeostasis redox para evaluar la aplicabilidad de nuestra estrategia. Ya que nuestra técnica es no invasiva y las heridas son inalteradas, el mismo animal puede utilizarse para mayores análisis confirmatorios a partir de lisados de histología o celular.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de la New York University School of Medicine. Todos los ratones se encuentran detrás de una barrera y todo el personal use equipo de protección personal.
1. día 0: Preparación de un modelo murino de cicatrización de la herida Excisional
- Anestesiar ratones diabéticos de (Leprdb/db), de 8 – 12 semanas, con inhalatorios isoflurano 2%. Confirmar que cada ratón ha sido adecuadamente anestesiado mediante la prueba de pie almohadilla pizca. Aplicar lubricante ocular estéril para cada ojo para evitar la irritación por sequedad. Los investigadores deben seguir las directrices de su personal veterinario institucional cuando anestesiar animales con isoflurano.
- Los ratones de pesar y registrar el peso de cada ratón. Confirme el estado diabético de animales mediante el registro de la glucosa en la sangre de cada animal mediante un glucómetro.
- Desinfectar equipo procedimiento de anestesia y espacio de trabajo. Eliminar el vello dorsal de los ratones con un cortapelos, seguido de la aplicación de loción de eliminación del pelo para limpiar el exceso de pelo lejos. Use toallitas de alcohol para limpiar la piel expuesta, dos veces y deje que se seque.
- Crear dos heridas de espesor total de 10 mm que se extiende a través del panniculus carnosus utilizando punzones de biopsia estéril 10 mm según un bien establecido por escisión de cicatrización técnica7,8. Utilizar guantes estériles para todas las cirugías de sobrevivencia. Autoclave de los instrumentos quirúrgicos en bolsas antes de la cirugía y abierto sólo en el campo quirúrgico.
- Las heridas abiertas utilizando una hoja de silicona espesor 0,5 mm con recortes circulares de 10 mm y fije los stents en lugar de la tablilla interrumpe las suturas de seda 4-0.
- Después de la cirugía, quitar animales de anestesia y colocar el cojín para facilitar la recuperación adecuada de calefacción. De la nota, si disminuye la temperatura corporal de animales durante el procedimiento, el animal puede moverse a la almohada antes para reducir al mínimo pérdida de calor corporal bajo anestesia. Monitorear los animales hasta que se despierta y móviles.
- Una vez recuperado, volver los animales a jaulas individuales, con alimentos y agua (Asegúrese de que es algo de comida en el piso de la jaula para el enriquecimiento de postoperatorio). Proveer toallas de papel triturado material de nidificación como adicional durante 2 semanas. No casa de animales que han sido sometidos a cirugía con otros animales, para evitar las interacciones adversas y cambios en el estado de cicatrización de la herida.
- Para el alivio del dolor postoperatorio, inyectar ratones por vía subcutánea con buprenorfina en 0,1 mg/kg de peso corporal dos veces al día, empezando inmediatamente después del procedimiento, durante 3 días.
2. día 1: Preparación de Keap1 siRNA
Nota: Preparar todos los tratamientos dentro de un gabinete de bioseguridad.
- Preparar la dilución de siRNA combinando 37.5 μl de medio de suero reducido con 12,5 μl de 20 μm Keap1 siRNA (siKeap1) (250 pmol) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL en hielo.
- Preparar liposomas dilución mediante la combinación de 25 μl de medio de suero reducido con 25 μl de mezcla de liposomas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Añadir 50 μl de la dilución de siRNA a 50 μl liposomas dilución gota a gota (volumen 1:1) y mezclar suavemente.
- Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir 50 μl de gel de metilcelulosa al 2% en agua y suavemente mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
- Tratar a cada animal con un si absurdoNS (control) o siKeap1 (experimental). Aplicar el gel en la parte superior de la herida. Envolver el torso del animal con apósito de película transparente para mantener gel en su lugar, mantener las extremidades para mantener movilidad gratis.
3. día 3: Preparación de solución de L-012
Nota: Preparar todos los reactivos en un gabinete de bioseguridad.
- En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, preparar L-012 de 1 X PBS a una concentración de 0,5 mg/100 mL.
- Vórtice manualmente el tubo de microcentrífuga. El L-012 no se disuelve completamente en el PBS, sin embargo debe ser uniformemente suspendido en el líquido. De la nota, no trate de disolver L-012 en agua para evitar la inquietante equilibrio de electrólito fisiológica después de la inyección.
- Transferir la solución en una jeringa de 1 mL con una aguja de 27 G.
Nota: Asegúrese de proteger la solución de L-012 de la luz.
4. día 3: En Vivo la proyección de imagen de las heridas diabéticas
- Anestesiar ratones con inhalatorios isoflurano 2%. Los investigadores deben seguir las directrices de su personal veterinario institucional cuando anestesiar animales con isoflurano. Confirmar que cada ratón ha sido adecuadamente anestesiado mediante la prueba de pie almohadilla pizca. Aplicar lubricante ocular estéril para cada ojo para evitar la irritación por sequedad.
- Suavemente Retire el apósito de película transparente de los ratones sin molestar a las heridas.
- Coloque el ratón en la cámara de imágenes en sus respectivos órdenes. Para mantener los niveles adecuados de la2 O en la cámara, establezca la entrada de sistema de proyección de imagen y los niveles de inducción cámara O2 a 1.0 L/min.
- Imagen de los ratones de bioluminiscencia y fotografía al inicio antes de la inyección del compuesto L-012.
- Limpie el abdomen con toallitas de alcohol y dejar para secar. Realizar una inyección intraperitoneal de solución L-012 en 5 mg por peso 200 g, utilizando una aguja calibre 27. Por ejemplo, un ratón de 20 g de peso debe recibir 0,5 mg de L-012.
- Inmediatamente después de la inyección de L-012, volver a colocar los ratones en sus respectivos lugares en la cámara de proyección de imagen. Imagen de los ratones en el transcurso de 60 minutos, durante 1 minuto a intervalos de 4 minutos. La herida de 10 mm se define como la región de interés para determinar el nivel de ROS.
- Después de la cirugía, quitar animales de anestesia y colocar el cojín para facilitar la recuperación adecuada de calefacción. Monitorear los animales hasta que se despierta y móviles.
- Una vez recuperado, volver los animales a jaulas individuales, manteniendo el mismo ambiente de enriquecimiento postoperatorias descrito en 1.6. No casa de animales que han sido sometidos a cirugía con otros animales, para evitar las interacciones adversas y cambios en el estado de cicatrización de la herida.
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Representative Results
Tres días después de crear heridas bilaterales según un modelo establecido herida excisional (figura 1A), ratones diabéticos se colocan en la cámara de proyección de imagen. Una fotografía inicial y una medida de la bioluminiscencia se toman antes de la inyección de L-012 para tener en cuenta para la señal de fondo (figura 1B). Después de la inyección intraperitoneal con la solución de L-012, los ratones se reposicionó en la cámara y bioluminiscencia se visualiza en las áreas de la herida donde se detecta ROS (figura 1). Después de seleccionar la imagen correcta y la configuración de análisis como se indica en la figura 2, continuar con la proyección de imagen. Bioluminescence se registra durante 1 minuto a intervalos de 5 minutos en el transcurso de 60 minutos (figura 3). Esto demuestra la saturación de la bioluminiscencia de la región de interés con el tiempo. En nuestro modelo animal, el tiempo imagen óptimo para alcanzar la saturación completa del L-012 fue determinado para ser 50 min, después de lo cual no fue apreciada ninguna diferencia notable en la bioluminiscencia. Esta vez será diferente según el animal modelo utilizado y debe ser independientemente determinado y optimizado para los diversos modelos de la herida según tamaño, tipo de animales, tratamiento, etc.
Una región de interés (ROI) con el fin de cuantificar la bioluminiscencia que se limita a la zona de la herida diabética es dibujada en la imagen de superposición (figura 4). Estos ROIs se definen de manera similar para todas las heridas incluso antes de la inyección de L-012 (Figura 4A) y después de la inyección de L-012 en absurdo tratados con siRNA (Figura 4B) y Keap1 ratones tratados con siRNA (figura 4). Bioluminescence se calculó dividiendo la cuenta total de intensidad de luz por la zona. La tabla 1 muestra los cálculos que se graficaron en la figura 4. Las heridas diabéticos tratados con siRNA absurdo tenían 45.775 11.649 bioluminiscencia/cm2, mientras que supresión Keap1 dio lugar a la bioluminiscencia de 19.405 5.939/cm2 (media SD). Prueba t de Student demostró una bioluminiscencia significativamente menor (p = 0,042) en el Keap1 tratados con siRNA de la herida en comparación con el absurdo tratados con siRNA herido, correlacionando con menor carga oxidativa con mayor actividad de Nrf2 (figura 4 D). para confirmar que los niveles relativos de ROS visualizado por L-012 en siNS y siKeap1 correlato con otros establecidos medios de medir la inflamación, se analizaron 10 días las secciones de tejido de la herida. H & E manchas mostraron infiltración celular en siKeap1-tratamiento heridas en contraste con siNS-los tratados, indicando reducción morfología inflamatoria (figura 5A). Immunoreactivity de F4/80, un marcador de proteína macrófago, (fluorescencia roja) en secciones de tejido de la herida revela reducido de macrófagos en siKeap1 tratados heridas con respecto a siNS-tratamiento de las heridas (figura 5B). Esto demuestra que los niveles ROS visualizados por L-012 sean exactos y correlación con otros modelos de medición establecidos de ROS. Críticamente, aplicar esta técnica no requieren sacrificar los animales para las secciones de tejido como se requiere para la H & E y tinción de inmunofluorescencia.
Figura 1: montaje Experimental para la proyección de imagen de. Resultan heridos ratones diabéticos (A) usando un modelo de la herida excisional establecido. (B) una superposición de referencia de fotografía con inyección de pre-L-012 de bioluminiscencia. (C) después de la inyección intraperitoneal con L-012, ROS se visualiza. Escala de luminiscencia para B y C. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ajustes de imagen y análisis en vitro sistema programa la proyección de imagen. (A) Seleccione "imágenes Wizard" en el Panel de Control de la adquisición (flecha roja). (B) "Imágenes de bioluminiscencia" es el modo de imagen seleccionado. (C) "filtro abierto" está seleccionado como la técnica de medición. (D) proyección de imagen de tema seleccionada es "mouse" y seleccionar la opción "estudio de serie de tiempo". El número total de segmentos y tiempo de retardo entre los segmentos de entrada. (E) seleccionar secuencia"adquirir" para proceder con la proyección de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: estudios longitudinales de en vivo ROS proyección de imagen de. Ratones diabéticos son imágenes para 1 minuto después de la inyección intraperitoneal con L-012 en 5 minutos intervalos a lo largo de 60 minutos rojo círculos: ROI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: cuantificación de bioluminescence. Fotografías con superposición de bioluminiscencia de heridas diabéticas (A) antes de la inyección de L-012, (B) con las heridas tratan con pecados después de la inyección de L-012 y (C) con las heridas tratadas con siKeap1 después de la inyección de L-012. (D) cuantificación de bioluminescence promedio había dividida por la superficie de ROIs por los pecados y siKeap1 heridas tratadas. Amarillo los círculos: ROI. Los datos se representan como media±desviación; p < 0.05, n = 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: correlaciones de ROS con las manchas immunohistochemical. (A) H & E manchas de diabético las secciones de tejido de la herida en 10 días mostraron infiltrado celular reducida como pruebas de morfología inflamatoria reducida en el s.iKeap1 trataron trataron de heridas en comparación con el siNS -heridas. (B) inmunofluorescencia F4/80 (rojo) demostraron reducción del número de macrófagos en si heridaKeap1 tratados secciones en 10 días con respecto a su siNS -trataron homólogos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| RETORNO DE LA INVERSIÓN | Si | Total cuentas | Cuenta de AVG | Recuentos stdev | Área [cm²] | Cuentas/área total | Área de cuentas promedio |
| ROI 1 | NS | 9.38E + 03 | 1.14E + 02 | 3.85E + 01 | 2.48E-01 | 3.78E + 04 | 4.58E + 04 |
| RETORNO DE LA INVERSIÓN 2 | NS | 4.68E + 03 | 5.37E + 01 | 3.13E + 01 | 2.63E-01 | 1.78E + 04 | |
| RETORNO DE LA INVERSIÓN 3 | NS | 1.72E + 04 | 2.18E + 02 | 1.54E + 02 | 2.39E-01 | 7.20E + 04 | |
| RETORNO DE LA INVERSIÓN 4 | NS | 1. 24E + 04 | 1.68E + 02 | 8.41E + 01 | 2.24E-01 | 5.55E + 04 | |
| RETORNO DE LA INVERSIÓN 5 | Keap1 | 3.21E + 03 | 3.41E + 01 | 2.76E + 01 | 2.84E-01 | 1.13E + 04 | 1.94E + 04 |
| RETORNO DE LA INVERSIÓN 6 | Keap1 | 2.56E + 03 | 2.88E + 01 | 1.06E + 01 | 2.69E-01 | 9.52E + 03 | |
| RETORNO DE LA INVERSIÓN 7 | Keap1 | 4.92E + 03 | 6.48E + 01 | 5.03E + 01 | 2.30E-01 | 2.14E + 04 | |
| ROI 8 | Keap1 | 8.34E + 03 | 1.07E + 02 | 5.25E + 01 | 2.36E-01 | 3.54E + 04 |
Tabla 1: cuantificación de bioluminiscencia para define ROIs. Bioluminescence es medido para cada ROI y estandarizado en relación con la superficie. Cálculo de la media, desviación estándar y error estándar se calcula por consiguiente. ROI 1, 2, 3 y 4 representan ROI de heridas de biológicas repeticiones de pecados tratado diabéticas heridas y 5 ROI, 6, 7 y 8 representan ROIs de repeticiones biológicas de siKeap1 trata heridas diabéticas.
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Discussion
Técnicas comunes para la medición de ROS han sido limitadas por protocolos complejos que requieren la extracción de tejido o técnicas invasivas. En los últimos años, se han reportado mediciones del estrés oxidativo sobre la base de modalidades de imágenes innovadoras, permitiendo evaluaciones spatiotemporal9,10,11. L-012 tiene varias ventajas como sonda quimioluminiscente luminol, lucigenina y MCLA1,4. El compuesto no es tóxico, fácilmente absorbido, y tiene mucho más fuerte bioluminiscencia en comparación con luminol o similares sondas12. Críticamente, L-012 puede ser administrada con seguridad varias veces en continuo para el análisis longitudinal sin efectos adversos o daño al animal modelos6. Esta estrategia requiere una formación especial limitada, y el equipo necesario está disponible en la mayoría de los laboratorios de investigación, lo que es un protocolo ampliamente accesible.
Para un uso óptimo, sugerimos que los reactivos sean debidamente actualizada y protegida de la luz para evitar la degradación. Murinas heridas curar a través de migración y re-epithelialization, como por la significativa contracción permite humanizar las heridas a través de la colocación de stents. Las suturas deben colocarse dos tercios de la manera a través del perímetro de stent para garantizar los bordes de la herida en el lugar. Regalo ratones con apósito de película transparente después de la aplicación de gel asegura que los tratamientos tópicos permanecen en su lugar. Para evitar que las heridas infligidas a sí mismo en los ratones, que pueden confundir resultados, sabor amargo spray puede aplicarse a las periferia y sutura nudos para desalentar morder. L-012 ha limitado solubilidad en PBS sino que forma una suspensión mediante pipeteo repetitivo de la solución. Estas medidas de aseguran la coherencia en las diferentes heridas, eliminando la variabilidad inter-usuario manteniendo el confort animal. Puesto que esta técnica se basa en la inyección intraperitoneal de solución en un modelo animal, hay varios factores que interfieren inherentes a los animales que no pueden ser controlados. Por ejemplo, flujo sanguíneo local y la absorción subsecuente y la localización de L-012 a las áreas de interés no pueden ser dictadas. Sin embargo, esta variable puede ser mitigada mediante el uso de un animal como su propio control interno tal que una herida puede tratarse con siNS y el otro con el siKeap1.
Divulgamos sobre la utilidad de una estrategia para el estudio en vivo de ROS en un modelo de cicatrización cutánea. En nuestro estudio presente, tratamiento de heridas con siRNA Keap1 dio lugar a la disminución carga oxidativa que confirma nuestro entendimiento de la importancia de la Nrf2 / manejo víaKeap1 para antioxidante. Si bien este método permite el análisis cuantitativo, hay una serie de limitaciones importantes. Mientras que L-012 es altamente sensible, no es específico para ROS y se ha demostrado que también reacciona a especies de nitrógeno reactivo6. Posterior análisis con sondas específicas y métodos de inmunoensayo complementar este enfoque con mayor especificidad y localización subcelular de ROS correlativos13. El mecanismo propuesto para L 012 basado en bioluminiscencia consiste en la oxidación de L-012 por el oxígeno molecular a través de la actividad de la peroxidasa en combinación con H2O212. Esto limita el uso de esta técnica para el estudio de inhibidores de la enzima antioxidante que interactúan con la peroxidasa. Pretende un análisis más detallado específicamente cuantificar ROS distintos de anión superóxido o metabolitos de las especies de nitrógeno reactivo no es posible con la estrategia actual.
Dada la alta sensibilidad del L-012 para la detección de ROS ampliamente, es fácilmente adaptable para varias cicatrización de la herida cutánea y otros modelos de tejido. Hemos demostrado la conveniencia de esta técnica para evaluar las implicaciones de redox de la terapéutica dirigida a las heridas diabéticas como RTA 408 y la entrega de lipoproteoplex de Keap1 siRNA14,15. Teniendo en cuenta los puntos fuertes importantes de este protocolo, hay enorme potencial futuro en la aplicación de estrategias similares para el estudio de ROS dentro de compartimentos más profundos mediante métodos ex vivo , disecciones centradas y organitas.
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Disclosures
No tenemos ninguna divulgación que informe.
Acknowledgments
Agradecemos a la base de la proyección de imagen preclínica en la Facultad de medicina de NYU, con agradecimiento especial a Orlando Aristizabal y Youssef Zaim Wadghiri. La base es un recurso compartido parcialmente apoyado por el 5P30CA016087 Laura y Isaac Perlmutter cáncer centro apoyo beca NIH/NCI y NIBIB biomédica tecnología recursos centro subvención NIH P41 EB017183. Este trabajo fue apoyado por la American Diabetes Association "Vía para detener la Diabetes" el NYU aplicado investigación fondo de apoyo a P.R. y D.C. [número 1-16-ACE-08]
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
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