Summary
Descrevemos a montagem, operação, e limpeza de um aparelho de fluxo projetado para formação de biofilmes fúngicas de imagem em tempo real enquanto sob fluxo. Também fornecemos e discutir algoritmos quantitativos para ser usado nas imagens adquiridas.
Abstract
Na candidíase orofaríngea, membros do gênero Candida devem aderir e crescer na superfície da mucosa oral, enquanto sob os efeitos do fluxo salivar. Enquanto foram desenvolvidos modelos para o crescimento sob fluxo, muitos destes sistemas são caros, ou não permita que enquanto as células estão sob fluxo de imagem. Nós desenvolvemos uma novela aparelho que permite o crescimento e desenvolvimento das células de Candida albicans em fluxo e em tempo real da imagem. Aqui, detalhamos o protocolo para a montagem e a utilização deste aparelho de fluxo, bem como a quantificação dos dados que são gerados. Somos capazes de quantificar as taxas que as células anexar e desanexar do slide, bem como a determinar uma medida da biomassa no slide ao longo do tempo. Este sistema é econômico e versátil, trabalhando com vários tipos de microscópios de luz, incluindo microscópios de bancada barata, e é capaz de estendido vezes comparados a outros sistemas de fluxo de imagem. Globalmente, este é um sistema de baixa taxa de transferência que pode fornecer informações em tempo real altamente detalhadas sobre o crescimento de biofilmes de espécies de fungos sob fluxo.
Introduction
Candida albicans (C. albicans) é um patógeno oportunista fúngico dos seres humanos que podem infectar vários tipos de tecido, incluindo as superfícies da mucosa orais, causando candidíase orofaríngea e resultando em uma baixa qualidade de vida para os indivíduos afetados1. Formação de biofilme é uma característica importante para a patogênese da c. albicans, e numerosos estudos foram feitos sobre a formação e a função de c. albicans biofilms2,3,4, 5, muitas das quais têm sido realizadas usando estática (sem fluxo) em vitro modelos. No entanto, c. albicans deve aderir e crescer na presença de fluxo salivar na cavidade oral. Numerosos sistemas de fluxo foram desenvolvidos para permitir viver-pilha de imagem6,7,8,9,10. Estes sistemas de fluxo diferentes foram projetados para diferentes fins, e, portanto, cada sistema possui diferentes pontos fortes e pontos fracos. Nós achamos que muitos do fluxo de sistemas adequados para c. albicans foram caros, complexo exigido fabricado peças, ou não poderia ser fotografado durante o fluxo e teve que ser interrompido antes da imagem latente. Portanto, desenvolvemos um aparelho novo fluxo para estudar a formação de biofilmes de c. albicans sob fluxo11. Durante o design do nosso aparelho de fluxo, seguimos estas considerações principais. Primeiro, queríamos ser capaz de quantificar os múltiplos aspectos do crescimento do biofilme e desenvolvimento em tempo real, sem exigir o uso de células fluorescentes (permitindo-nos para estudo de cepas mutantes e isolados clínicos não modificados facilmente). Em segundo lugar, queríamos que todas as partes para ser comercialmente disponíveis com pouca ou nenhuma modificação (i. e., sem fabricação personalizada), permitindo que outros para mais facilmente recriar nosso sistema e permitindo a fácil reparação. Em terceiro lugar, queríamos também permitem extensa imagem vezes em taxas de fluxo razoavelmente alta. Por fim, queríamos, após um período de células anexar ao substrato sob fluxo, poder acompanhar o crescimento do biofilme durante um tempo prolongado sem a introdução de novas células.
Estas considerações nos levaram a desenvolver o sistema de recirculação fluxo dois-balão ilustrado na Figura 1. Os dois balões nos permitem dividir a experiência em duas fases, uma fase de fixação que retira o recipiente acessório celular-semeado e uma fase de crescimento que usa mídia sem célula para continuar o crescimento do biofilme sem a adição de novas células. Este sistema é projetado para trabalhar com uma câmara de incubação para o microscópio, com o slide e o tubo de precedê-lo (2 a 5, Figura 1), sendo colocado dentro da incubadora, e todos os outros componentes colocados em um grande recipiente secundário fora do microscópio. Além disso, um agitador de placa de aquecimento com uma sonda de temperatura anexado é usado para manter as células fúngicas no recipiente de apego a 37 ° C. Como ele é de recirculação, este sistema é capaz de imagem contínua durante o fluxo (pode ser mais de 36 h, dependendo de condições) e pode ser usado em microscópios mais padrão, incluindo microscópios de bancada vertical ou invertida. Aqui, vamos discutir a montagem, operação, e limpeza do aparato de fluxo, bem como fornecer alguns algoritmos de ImageJ base quantitativos para analisar os vídeos depois de uma experiência.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. montar o aparelho de fluxo
- Configure as partes constantes da Tabela de materiais , de acordo com o esquema na Figura 1 , com as considerações discutidas abaixo.
Nota: Para sua conveniência, o fluxo de aparelhos é dividido em dois lados, o lado verde (tudo contra a corrente do slide para os frascos de mídia) e a laranja do lado (tudo a jusante do slide para os frascos de mídia).- Certifique-se de que todos os aparelhos de fluxo é ar comprimido para evitar vazamentos, com a única excepção dos frascos mídia (Figura 1, 1). Para fazer isso, aplique fita encanadores a qualquer segmentação masculino antes da montagem, exceto o amortecedor de pulsação (PD) e frasco de filtro de 2 µm (FB), que não necessitam de fita encanadores como as gaxetas de borracha mantém-los hermeticamente.
- Aplicar o ouvido grampos em cada encaixe de arame farpado que está sob pressão positiva durante a operação normal (ou seja, a jusante da bomba).
- Uso de cor codificada fitas de laboratório para rotular os locais da válvula com um A ou G (para fixação e crescimento, respectivamente), a localização da bomba, os locais de conexão de slide e a conexão de filtro de 0,2 µm.
- Determine o comprimento da tubulação deve ser usado com base na distância entre o sistema de fluxo e microscópio, mantendo em mente que todo o aparato de fluxo a jusante da bomba para os frascos (maioria do lado laranja) deve ser a contenção secundária. Adicionar aproximadamente 1 m de tubo extra a montante do slide (e de preferência o borbulhador) para colocar dentro da câmara de incubação do microscópio, como isso garante que todos os meios, atingindo o slide será na temperatura correta.
- Lugar do borbulhador tão perto quanto razoavelmente possível para o slide, de preferência dentro da câmara de incubação durante um experimento (bolhas de forma muitas vezes ao longo da parede do tubo); no entanto, tenha em mente que deve ser conectado a um vácuo de operar.
- Certifique-se de que a tubulação entre o FB e a 0,2 µm filtro descartável é cerca de 0,5 m de comprimento.
- Adicionar uma barra de agitação magnética a aproximadamente 2 cm para cada balão de mídia.
- Obter alguma forma de braçadeiras de tubo para atuar como válvulas shut-off (hemostatos podem ser usados).
- Para facilidade de uso, mantenha o aparelho de fluxo em uma cesta autoclaváveis. Pode ser útil ter uma segunda cesta menor em um maior para permitir a fácil separação do lado verde e o lado laranja.
- Para o balão de fixação, usando uma broca de 4 mm, furo um extra na rolha de borracha para acomodar a sonda térmica (tome cuidado para não passar por outro buraco). Para obter a tubulação através das portas, empurre o tubo com pinças; uma vez, prenda a tubagem para segurá-la no lugar e em seguida puxe a pinça de volta.
Nota: Se não é possível adicionar o buraco extra para a rolha de borracha, uma garrafa de boca larga parafuso com uma tampa de rosca de quatro portas pode funcionar no lugar a rolha de borracha e balão.
- Uma vez que o sistema de fluxo foi totalmente montado, feche as válvulas de dois frascos de crescimento do lado verde e laranja. Use água com o tubo do frasco de apego e um cilindro graduado para calibrar a bomba peristáltica de acordo com as instruções do fabricante.
2. realizar um experimento
- O dia antes do experimento, começar a pre-aquecimento da câmara de incubação de microscópio para 37 ° C e preparar uma cultura durante a noite de uma cepa fúngica (fluorescência não é obrigatório).
- Recolher a bomba e componentes de uso único e coloque em uma estéril biossegurança do armário.
- Remover o borbulhador e a temperatura sonda do aparelho fluxo e colocá-los no gabinete de segurança biológica.
- Desembaraçar e organizar o tubo, se necessário.
- Autoclave os aparelhos de fluxo, incluindo as barras de agitação, por 30 min garantir a esterilidade; Quando terminar, transfira para a gabinete de biossegurança.
- Anexe o borbulhador, sonda de temperatura e todos os componentes de uso único (exceto o slide) como ilustrado na Figura 1.
- Para o filtro de 0,2 µm (Figura 1, 11), retire o êmbolo da seringa 1 mL para torná-lo como um "adaptador". Forçar a tubagem do FB para este fim e anexar o filtro de 0,2 µm para a tubulação levando ao balão de crescimento.
- Aplica vácuo graxa de silicone ao redor da barb do adaptador slide (cuidar para não pegar qualquer graxa dentro) antes de conectá-lo, como este ajuda a evitar vazamentos de ar no sistema.
- Encha o balão de fixação com 100 mL de 1% (p/v) de extrato de levedura, peptona de 2% (p/v) e 2% (p/v) glicose (YPD) e encha o balão de crescimento com 200 mL de YPD. Certifique-se de que o tubo do lado verde atinge os meios de comunicação em cada frasco.
- Certifique-se de que todas as válvulas estão abertas. Anexar o borbulhador para um vácuo e conectar a bomba à tubulação do lado verde a jusante da armadilha da bolha.
- Bombear o líquido em uma taxa de fluxo de 3,3 mL/min para completamente encher o lado verde, então dispense e descartar aproximadamente 1 a 2 mL da mídia, porque o primeiro par de mililitros geralmente contêm células mortas ou fragmentos aleatórios. Certifique-se que o lado verde do tubo é preenchido com a mídia e tem sem bolhas a jusante da armadilha da bolha antes de prosseguir.
- Preencha o slide de canal e o reservatório com YPD, tomando cuidado para não introduzir bolhas.
- Conecte o slide para o aparelho de fluxo e a bomba mais fluido para criar uma reserva de cerca de 0,5 m do lado laranja. Isso é para evitar acidentalmente ar prendendo no slide em caso de refluxo.
- Preparar o aparelho de fluxo para o transporte para o microscópio: grampo fechado a entrada e saída do borbulhador e pinça válvulas de fixação frasco fechadas do lado o verde e o laranja. Certifique-se de que as tampas de rosca para o PD e FB são apertadas como eles podem soltar durante a autoclavagem.
- Desconecte a bomba ao tubo para facilitar o transporte. Em seguida, mova todos os componentes, incluindo o misturador de chapa, em um recipiente secundário perto o microscópio.
- Prepare o aparelho de fluxo para a imagem latente.
- Fixar a sonda de temperatura para o misturador de chapa e começar a aquecer o frasco do anexo 37 ° c. Mexa a mídia a 300 rpm e manter isso durante todo o experimento.
- Montar o slide no microscópio e usar fita se necessário fixá-lo firmemente.
- Anexar o borbulhador para um vácuo (não desfazer a pinça ainda).
- Ligar a bomba ao aparelho de fluxo no local indicado na Figura 1.
- Ligue a bomba com um caudal de 3,3 mL/min, deixe-o funcionar por aproximadamente 5 a 10 s e então remova a braçadeira de entrada/saída de armadilha de bolha.
- Permitir que a bomba continuar a execução enquanto aquece o balão de fixação. Uma vez que a mídia tem divulgado em todo o sistema de fluxo, verificar para a operação normal.
- Verifique os encaixes para ar vazando no montante da bomba (alguma formação de bolhas é normal), o fluido vazar a jusante.
- Verificar que o balão de mídia de crescimento, PD e FB são todos os meios de gotejamento do tubo de entrada (se não, isso poderia indicar um filtro entupido, ou uma pinça de orelha desapertada).
- Usando o microscópio, verifique se há células anexadas ou rolamento do slide de canal. Um número excessivo de células pode indicar contaminação durante a configuração, ou que a membrana de politetrafluoretileno (PTFE) da bolha da armadilha deve ser substituído.
- Uma vez que a câmara de balão e incubação de fixação estão ambos a 37 ° C, adicione chega durante a noite de cultura das células fúngicas no balão de fixação para chegar a 1 x 106 células/mL.
Nota: O volume para adicionar em µ l pode ser calculado usando esta fórmula:
- Espere 15 min para permitir que as células para se aclimatar.
- Abra ambas as válvulas de balão de fixação lado verde e laranja ao fechar as duas válvulas de balão de crescimento para iniciar o fluxo de células.
- Espere por aproximadamente 5 minutos permitir que as células alcançar o slide e permitir a focalização inicial do microscópio (este tempo pode precisar ser ajustada dependendo do comprimento do tubo de lado verde). Durante este tempo, ajuste o microscópio para os mesmos parâmetros de imagem utilizados em experiências anteriores. Se esta é a primeira execução, siga estes passos:
- Alternar para um objectivo de ar de baixa ampliação.
- Encontrar e se concentrar em um anexo ou brotamento pequenas células.
- Configurar o condensador para iluminação de Köhler e, em seguida, alternar para campo escuro.
- Defina o tempo de exposição a 300 ms.
- Ajuste a intensidade de iluminação até uma pequena célula é dim ainda claramente visível no contexto (um sinal à relação de fundo de aproximadamente 7 a 8 para uma célula filha de brotamento é um valor razoável). Marca/nota a intensidade de iluminação para experiências futuras.
- Configure o software para adquirir uma imagem a cada 2 min mais 2 h.
- Começa a aquisição de imagens para a fase de penhora. Verifique depois de aproximadamente 5 e 10 min para garantir que o foco foi mantido. Se não, tente ajustar o foco imediatamente após a próxima imagem é adquirida.
- Imediatamente depois de terminar a fase de fixação, salve o arquivo e abra as duas válvulas de balão de crescimento lado verde e laranja ao fechar as duas válvulas de balão acessório. Tome cuidado para não bater o palco se todas as válvulas estão no interior da câmara de incubação.
- Desconecte a sonda do termómetro de agitador a placa de aquecimento.
- Retirar o frasco de fixação do agitador a chapa e coloque o frasco de crescimento em seu lugar.
- Configure o software para adquirir uma imagem a cada 15 min mais 22 h e começar a aquisição de imagens para a fase de crescimento. Re-focagem não deve ser necessário, mas é altamente recomendado para verificar o aparelho de fluxo depois de algumas horas.
- Verifique os encaixes para ar vazando no montante da bomba (novamente, alguma formação de bolhas é normal), o fluido vazar a jusante
- Verificar que o balão de mídia de crescimento, PD e FB são todos pingando mídia (se não, isso poderia indicar um filtro entupido, uma braçadeira de orelha desapertada ou uma obstrução em um arame farpado apropriado, se as células sendo usadas flocular).
- Verificar o nível do líquido no FB. Se a mídia está se aproximando do topo do frasco (mais de 1,5 cm acima da parte superior do filtro), aperte os dois screwcaps (não soltá-las, como este balão está sob pressão). Se eles não vão apertar mais, continuar o experimento (embora isto pode resultar em perda de) e substituir as gaxetas de borracha no PD e FB após a próxima limpeza.
- Quando terminou a aquisição de fase de crescimento, salve o arquivo e abra as válvulas de balão de fixação lado verde e laranja que podem fazer um barulho, como a pressão libera o lado laranja. Puxe o tubo do lado verde proveniente de dois frascos de mídia até que estejam pelo menos vários centímetros acima da mídia. Funcionar a bomba a uma velocidade elevada (aproximadamente 100 mL/min ou mantenha pressionado o botão de avanço rápido da bomba) para remover todos os meios da tubulação, o que torna a limpeza muito mais fácil. Quando esvaziado, desligue o aparelho de fluxo da bomba e removê-lo do microscópio.
3. Limpe o aparelho de fluxo
- Remover todos os componentes não-autoclavável (componentes de utilização única, borbulhador e sonda de temperatura), e autoclave aparato de 30 min. descarte de fluxo usado componentes de uso único, sonda limpa com etanol a 70% e reserve borbulhador.
- Concluída a autoclavagem, descartar a mídia e enxaguar e reserve frascos de mídia. Em seguida, re-conecte o borbulhador, conectar um slide de canal ibidi deve ser usado para limpeza (reutilizáveis) e conectar o sistema de fluxo para a bomba no local mostrado na Figura 1.
- O grampo fechado a válvula balão crescimento laranja.
- Coloque aproximadamente 200 mL de água sanitária não diluída num copo de precipitação. Coloque as rolhas de borracha a lixívia e então começar a bomba em uma alta velocidade circular água sanitária em todo o aparato de fluxo (exceto todos os filtros). Uma vez preenchido com água sanitária, pare a bomba porque deixar a bomba em alta velocidade pode usar e quebrar o tubo.
- Após o branqueamento por 15 min, segure as rolhas de borracha acima do copo e ligue a bomba novamente para remover a água sanitária do aparato de fluxo.
- Repita as etapas de 3.4 e 3.5 duas vezes com excesso de água em vez de lixívia para lavar o sistema de fluxo. Durante esse tempo, limpe-os apenas com água porque outros agentes de limpeza irão corroer ou entupir os filtros.
- Coloque a tubulação que normalmente iria ligar para o filtro de mídia de 0,2 µm (proveniente do µm 2 FB) para a água do copo com as rolhas de borracha da etapa 3.6.
- Desconecte o tubo conectado na entrada do filtro embutido 20 µm, que pode geralmente ser separado com facilidade, apesar do gancho de orelha.
- Use um frasco de filtro de vácuo e uma longa seção de tubo através de uma rolha de 3 furos a reposição para criar um sistema de vácuo que pode se conectar ao aparelho de fluxo.
- Conectar este sistema de vácuo para a entrada da entrada de filtro de 20 µm e começar o vácuo; Isto puxará água através dos filtros na direção inversa, removendo as células mortas.
- Puxe pelo menos 200 mL de água através de filtros e, em seguida, remover o tubo da água para esvaziar as linhas de filtro de água.
- Desligue o sistema de aspiração do filtro de 20 µm, e reconecte o filtro à sua tubulação normal.
4. quantificar os vídeos
Nota: Todos os arquivos precisam ser convertidas para o formato de arquivo (TIF) de imagem de marca para trabalhar. Além disso, para comparar entre experiências, é fundamental que todas as imagens são tiradas com o microscópio mesmo e parâmetros de imagem, como discutido acima.
- Baixe e instale o ImageJ, se já não estiver instalado.
- Baixe o arquivo de macro suplementar e coloque-o na pasta ImageJ\macros.
- Ajuste a macro fornecida:
- Abra uma pilha de imagem de uma experiência anterior no ImageJ e selecione um ponto de tempo com células presentes.
- Selecione do menu através de "imagem | Tipo | 8-bit".
- Selecione do menu através de "imagem | Ajustar | "Limiar de. Marque a caixa "fundo escuro" . Defina o menu suspenso do lado direito para o vermelho.
- Ajuste o valor inferior até que todas as células estão cobertas de vermelho com o mínimo de ruído em excesso (algumas manchas de células não é okey e serão processado para fora pela macro). Anote este valor inferior.
- Feche a janela do limiar e a imagem aberta.
- Selecione do menu através de "Plugins | As macros | Editar". Quando solicitado a abrir um arquivo: "mover para cima o nível de uma pasta", então selecione a pasta de macros e abra o arquivo de macro fluxo quantificação de biofilme.
- Altere o valor 15 em todas as instâncias de "setThreshold (15, 255);" para o valor determinado na etapa 4.3.4. Salve o arquivo e feche esta janela.
- Selecione no menu através de "Plugins | As macros | Instalar"e selecione o arquivo de quantificação de biofilme de fluxo.
- Agora, sob a "Plugins | Macros" menu, seis novas opções para vários quantificações vídeo aparecem. Executar a análise completa e selecione os arquivos de vídeo anexo e crescimento quando solicitado para realizar análises disponíveis todos os dados adquiridos e gerar automaticamente arquivos de saída.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Imagens representativas de um normal durante a noite o lapso de tempo experimento usando o selvagem-tipo c. albicans células a 37 ° C podem ser vistas na Figura 2 e 1 de vídeo suplementar. As imagens foram aprimorado para melhorar a visibilidade de contraste. Realizou-se a quantificação dos dados originais e gráficos representativos podem ser vistos na Figura 2B. Para gerar os gráficos, os dados do primeiro foram normalizados para a área de imagem (ou seja, dividido pelo total de área de imagem), e o destacamento foi ainda mais normalizado para a biomassa, como descrito acima. Além disso, o apego e desapego mostram os valores acumulados ao longo do tempo, em vez dos valores individuais do quadro gerados pela macro de quantificação de fluxo biofilme. Uma vez que os gráficos têm alcançado nesta fase, comparações estatísticas podem ser realizadas através de análises de regressão.
Figura 1 : Esquemático do aparato recirculação de fluxo bifásico. Conexão de linhas pretas indicam a tubulação e setas indicam a direção do fluxo durante a operação normal. (A), A visão esquemática geral do sistema de fluxo é ilustrado. Para sua conveniência, o sistema de fluxo é dividido em um lado verde (a montante do slide) e um lado laranja (a jusante do slide). Números em negrito correspondem às partes constantes da tabela de materiais. Rótulos para válvulas basta marcam o local dos grampos de tubo ou hemostatos ser colocados durante as experiências. Filtro de ordem é a seguinte: 8 – 20 µm embutido filtro, filtro de inline 9 – 10 µm, 10 – 2 µm filtro garrafa (FB) e 11 – 0,22 µm filtro descartável de uso único. Esquema não está à escala. (B), A close-up vista sobre a rolha de borracha para o balão de fixação, ilustrando os quatro componentes que passam através dos portos: o meio de comunicação, o filtro de ar de 0,2 µm que permite a troca gasosa, a sonda de temperatura (requer perfurar um furo extra), e retorno de mídia. (C), A close-up vista sobre o amortecedor de pulsação (PD) e o FB, bem como a montagem de tampa de rosca usado para cada porta. Estes frascos precisam ser hermética para função. O tubo de saída para o PD deve alcançar mais profunda do que a tubulação de entrada para o bom funcionamento de uma garrafa. O retângulo cinzento no FB representa o filtro de aço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Candida albicans selvagem-tipo pilhas crescidas sob fluxo em 37 ° C. (A) representante darkfield imagens de microscopia do microcolonies que se formam sob fluxo a 37 ° C em pontos de tempo indicado. Barra de escala = 100 µm. (B) imagem representativa quantificação os dados. A biomassa total dentro da região de imagem (determinado pela análise de densitometria), a taxa cumulativa de acessório de celular e o desprendimento de biomassa porcentagem (taxa de desprendimento normalizado para a biomassa) ao longo do tempo são mostrados para cada tensão. Dados são meios de n ≥ 3 experimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo suplementar 1. Candida albicans selvagem-tipo pilhas crescidas sob fluxo em 37 ° C. Este lapso de tempo darkfield microscopia vídeo mostra a fixação do WT células ao substrato durante a fase de fixação (tempo indicado no canto superior esquerdo; imagens adquiridas a cada 2 min), seguido pelo crescimento subsequente e desenvolvimento durante o fase de crescimento (começa às 2h; imagens adquiridas a cada 15 min). Mídia de célula-semeado (1 x 106) foram utilizadas durante a fase de penhora, enquanto mídia sem célula foram utilizadas durante a fase de crescimento. Fluxo é da direita para a esquerda. Barra de escala = 50 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Conforme descrito acima usar o sistema de fluxo permite a geração de quantitativos vídeos Time-Lapse de biofilme fungal crescimento e desenvolvimento. Para permitir comparações entre experiências é de fundamental importância para garantir que os parâmetros de imagem são mantidos os mesmos. Isto inclui assegurar que o microscópio é configurado para iluminação de Köhler para cada experimento (muitos guias estão disponíveis on-line para este processo). Além de parâmetros de imagem, existem alguns passos importantes para manter em mente ao trabalhar com o aparelho de fluxo. Em primeiro lugar, é importante assegurar que o borbulhador é mantida sob vácuo durante o fluxo de fluido, como a não observância levará a ar sendo puxado através do borbulhador. Da mesma forma, quando o borbulhador não é sob vácuo (ou seja, ao transportar o aparelho de fluxo) a entrada e a saída devem permanecer preso fechada; caso contrário o ar irá vazar em através da membrana PTFE. Esta braçadeira não precisa ser removido até o borbulhador é novamente colocado sob vácuo. Por último, é muito importante controlar o seu aparelho de fluxo para potenciais entupimentos ou vazamentos. A maneira mais eficiente para verificar se há obstruções no seu sistema é verificar que existem meios pingando das enseadas de balão de fixação ou crescimento, o PD e o FB. Os meios de comunicação a partir desses devem estar pingando a preços relativamente semelhantes se tudo está funcionando sem problemas. Se houver um entupimento, você geralmente pode determinar a localização como a tubulação apenas a montante da obstrução será mais rígida.
Uma vez que os dados tenham sido obtidos, nós fornecemos várias macros de ImageJ para dosar os vídeos. Essas macros determinam vários parâmetros do crescimento do biofilme e desenvolvimento, incluindo uma medida da biomassa e a taxa com que as células anexar e desanexar da superfície ou biofilme. Descrições das macros fornecidas são fornecidas abaixo.
Análise completa realiza todas as análises, listadas abaixo e gera automaticamente os dados. Esta macro pode ser executada sem um arquivo de imagem aberta, enquanto todos os outros exigem um vídeo aberto. Quando executado, ele solicitará que o usuário abrir um arquivo anexo de pilha, então um arquivo de pilha de crescimento. Em seguida, analisar as imagens automaticamente e uma pasta de dados contendo todas as tabelas de dados, conforme descrito abaixo, na mesma pasta como o arquivo de imagem do acessório de saída. A contador acessório macro é executada somente no arquivo anexo; todas as outras análises são executadas em uma pilha concatenada dos arquivos anexos e crescimento. Os dados de saída arquivos gerados são arquivos de texto, mas devem ser importados para o excel para facilidade de uso.
A análise de intensidade soma vai analisar cada frame da janela ativa. Isso acrescenta-se todos os valores de cinza para cada pixel que estiver acima do limite inferior designado na etapa 4.3.7 e produz um valor cumulativo por quadro. Os valores gerados são proporcionais a biomassa presente dentro do quadro, até qualquer saturação de câmera que ocorre. Os dados, em seguida, devem ser normalizados para a área da região de imagem; Isto não é executado pela macro.
A análise da área de cobertura vai analisar cada frame da janela ativa para a área do quadro que é coberta por células (acima do valor de limiar inferior) como uma porcentagem.
O contador de penhora usará quadro subtração para determinar a intensidade da soma de todas as células que unem entre cada quadro. Assim, o primeiro ponto de dados é a biomassa das células que unem-se entre os quadros 1 e 2; o segundo ponto de dados é a biomassa de células de fixação entre os quadros 2 e 3, etc. Estes dados devem ser normalizados para a área da região de imagem. Para facilitar a leitura mais fácil, também é útil integrar esse valor antes de gráficos.
O contador de desprendimento funciona da mesma forma o contador de acessório, mas inverte a quadro subtração, tal que ele determina a intensidade da soma das células que destacar entre cada quadro. Estes dados também devem ser normalizados para a área da região de imagem e integrados antes da representação gráfica. Antes da integração, estes dados podem ser ainda mais normalizados para a intensidade da soma total do quadro anterior, calculado em análise a intensidade da soma . Este novo valor representa a proporção de células que se desapegar do biofilme naquele ponto do tempo, que é muitas vezes mais dados valiosos, desde que a biomassa da desanexação de células irá aumentam com o aumento da biomassa de biofilme.
Enquanto o sistema de fluxo apresentado aqui é mais complicado de construir e operar do que outros sistemas de fluxo, ele oferece várias vantagens. Muitas dessas vantagens resultam de nosso uso de uma lâmina de canal comercialmente disponível. O tratamento de cultura de tecidos disponível para estes slides é suficiente para permitir que as células de Candida a aderir à superfície. Além disso, o perfil deste slide de canal sendo semelhante a um slide tradicional lhe permite ser facilmente utilizado em uma ampla variedade de sistemas de microscópio, incluindo microscópios vertical usando luz transmitida na ampliação baixa. Usar este tipo de microscópio nos permitiu usar microscopia campo escuro, que fez a quantificação de dados muito mais fácil, que especialmente se comparado a microscopia fluorescente (como não havia nenhum fotobranqueamento e fototoxicidade baixa). Microscopia tradicional (sem seccionamento óptico), é poder conservador, significado de células de foco contribuir semelhantes números de fótons para uma imagem como em células de foco de similar tamanho12. Isto significa que, apesar de nosso único plano de imagem, o biofilme crescente 3D ainda está sendo quantificado durante todo o experimento, mesmo que as regiões superiores estão fora de foco. Esta imagem do único-avião tem a vantagem de diminuindo drasticamente os danos de fototoxicidade de células, mas não fornece qualquer informação sobre a arquitetura 3D do biofilme. No entanto, este sistema de fluxo também pode ser usado com células fluorescentes e microscópios confocal para obter esta informação13.
Os dois únicos balão recirculando a configuração do nosso aparelho de fluxo também tem muitas vantagens. Primeiro, muitos sistemas de fluxo exigem que os slides pre-ser semeado com células, no entanto nosso uso de balão um anexo separado célula-semeado nos permite imagem e quantificar células como aderem ao slide enquanto sob fluxo, e nós sentimos que este é mais similar ao que ocorre < C0 > vivo em. Além disso, nós anteriormente ter sido capazes de ajustar o nosso microscópio para eventos de adesão de imagem e imagem de alta velocidade como eles ocorreram em tempo real, em oposição a quantificá-los após o fato,11. Em segundo lugar, tendo um balão de crescimento sem célula que recircula e pode ser mantida livre de células sobre uma duração estendida nos permitiu compreender como biofilmes crescem sob fluxo por mais de 24 h, uma duração que normalmente não pode ser realizada com sistemas não-recirculação . Ainda não determinamos o tempo limite do que pode ser conseguido com o nosso sistema de fluxo, mas podemos ter concluído com êxito experiências de 36h; no entanto, quanto mais a experiência, maior a chance de um vazamento ou filtro entupido. Inúmeros fatores podem afetar a duração do potencial de uma experiência, incluindo a taxa de crescimento das células, são como adesivo e o grau de formação de hifas, tornando-se difícil definir um limite superior sobre a duração de um experimento. No entanto, se desejar períodos muito mais longos do que pode ser alcançado com o aparelho de fluxo tal como apresentado, os filtros podem ser substituídos com uma caixa de esterilização em linha ultravioleta (UV) como foi descrito anteriormente8. Esta caixa de esterilização pode também permitir que este equipamento de fluxo a ser usado para bactérias de imagem; nossas tentativas anteriores de estirpes bacterianas imagem resultaram na rápida entupimento do filtro de 0,2 µm. Em última análise, optamos por não para adotar a esterilização UV, como a caixa é personalizada fabricada, e isso resultaria em recirculação de células mortas.
Outra vantagem deste sistema de fluxo é que é razoavelmente barata em relação a sistemas comerciais, especialmente se você precisa comprar um microscópio com isso. Em nosso laboratório, conseguimos comprar um microscópio de bancada de luz transmitida básicos e colocar o microscópio inteiro dentro de uma incubadora de convecção padrão grande. A única grande exigência é que o microscópio deve ter uma função de obturador (mecânica ou elétrica) para realizar microscopia de lapso de tempo.
Enquanto este sistema é versátil e oferece muitas vantagens, é um método de baixa taxa de transferência. Nosso aparelho de fluxo é incapaz de crescer múltiplas variedades em paralelo, ao contrário de outros sistemas de fluxo disponível. Devido à extensa preparação e tempo de limpeza, só somos capazes de realizar experimentos de duas por semana. No entanto, muitos outros sistemas de fluxo são bastante caros e podem obstruir quando Candida células são cultivadas em hifas formando condições.
Além disso, este sistema de fluxo é bastante complexo em relação aos outros e pode ser difícil de manter em funcionamento. Depois de muitas experiências, filtros começam a entupir, tubo começa a se desgastar e as peças começam a enferrujar ou afrouxar-se; exigindo assim esses componentes a ser substituído. O uso de filtros torna este sistema incompatível com as condições de crescimento de algumas cepas fúngicas; em particular, qualquer coisa que induz a floculação rapidamente vai entupir o filtro em linha de 20 µm. No entanto, com a experiência suficiente usando o sistema de fluxo, torna-se mais fácil de detectar problemas em potencial antes que eles resultam em um experimento que falhou. Uma coisa que pode ser feito para tornar a operação diária do aparato de fluxo um pouco mais simples é ter um mecânico fazer uma réplica do borbulhador habitação fora um material autoclavável (tais como alumínio ou aço inoxidável), permitindo-lhe para autoclave a bolha armadilha com o resto do aparato de fluxo, como os componentes de membrana e adaptador PTFE da armadilha da bolha são autoclaváveis.
Em conclusão, o aparelho de fluxo bifásico recirculação apresentado aqui representa um modelo único para a imagem e quantificar em vitro formação de biofilmes de fungos sob fluxo e em tempo real. Enquanto o sistema tem as suas limitações, é altamente adaptável e funciona bem com a maioria dos microscópios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de reconhecer o Dr. Wade Sigurdson para fornecer valioso contributo na concepção do aparato de fluxo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 μm inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).
- Araújo, D., Henriques, M., Silva, S. Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes. Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).
- Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).
- Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions. Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow. Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- McCall, A., Edgerton, M. Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development. Journal of fungi. 3 (1), Basel, Switzerland. 13 (2017).
- Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -C. Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models. Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).
- Tati, S., et al. Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis. PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).
