Summary
Vi beskriver forsamlingen, drift, og rengjøring av en flyt apparater utformet bilde fungal biofilm formasjonen i sanntid under flyt. Vi gir og diskutere kvantitative algoritmer som skal brukes på ervervet bildene.
Abstract
I orofaryngeal candidiasis, må medlemmer av slekten Candida overholde og vokse på muntlig slimhinnen mens under effekter av salivary flyt. Mens modeller for vekst under flyt er utviklet, mange av disse systemene er dyre, eller tillater ikke tenkelig mens cellene er under flyt. Vi har utviklet en roman apparater som tillater oss å image vekst og utvikling av Candida albicans celler under flyt og i sanntid. Her detalj vi protokollen for samling og bruk av flyt apparatet og kvantifiseringen som genereres. Vi er kunne kvantifisere priser som cellene koble til og koble fra lysbildet, samt å finne et mål av biomasse på lysbildet over tid. Dette systemet er både økonomisk og allsidig, arbeider med mange typer lys mikroskoper, inkludert rimelige Borstemmaskin mikroskoper, og er i stand til forlenget imaging ganger sammenlignet med andre flyt systemer. Samlet er dette en lav gjennomstrømming system som kan gi svært detaljert sanntidsinformasjon om biofilm veksten av sopp arter under flyt.
Introduction
Candida albicans (C. albicans) er en opportunistisk fungal patogen mennesker som kan infisere mange vev typer, inkludert muntlige mucosal flater, forårsaker orofaryngeal candidiasis og resulterer i en lavere livskvalitet for berørte personer1. Biofilm formasjon er et viktig karakteristisk for patogenesen av C. albicansog flere studier er gjort på dannelsen og funksjon av C. albicans biofilm2,3,4, 5, hvorav mange har blitt utført ved hjelp av statisk (ingen flyt) i vitro modeller. C. albicans må imidlertid følge og vokse i nærvær av salivary flyt i munnhulen. Mange strøm systemer er utviklet for å gi live-celle tenkelig6,7,8,9,10. Disse forskjellige strømnings systemene er designet for ulike formål, og derfor har systemet forskjellige styrker og svakheter. Vi fant at mange av systemene passer for C. albicans var dyrt, nødvendige komplekse fabrikert deler, eller kunne ikke fotografert under flyt og måtte stoppes før bildebehandling. Derfor utviklet vi en roman flyt apparater å studere C. albicans biofilm formasjon under flyt11. Under utformingen av vår flyt apparater fulgte vi disse store betraktninger. Først ønsket vi å kunne kvantifisere flere aspekter av biofilm vekst og utvikling i sanntid uten å bruke fluorescerende celler (tillater oss å studere mutant stammer og uforandret kliniske isolater lett). Andre vi ønsket alle deler å bli kommersielt anvendelig med liten eller ingen modifikasjoner (dvs., ingen egendefinerte fabrikasjon), slik at andre mer enkelt gjenopprette systemet og muliggjør enkle reparasjoner. Tredje vi ønsket også å tillate for utvidet imaging tid rimelig høy flow priser. Til slutt, vi ville, etter en periode av celler vedlegges underlaget under flyt, kunne overvåke biofilm vekst over lengre tid uten å innføre nye celler.
Disse betraktningene førte oss til å utvikle to-kolbe resirkulerende flyt systemet illustrert i figur 1. De to flasker tillate oss å dele eksperimentet i to faser, en vedlegg-fase som trekker fra celle-seeded vedlegg kolbe og en vekstfase som bruker celle-frie medier for å fortsette biofilm veksten uten tilsetning av nye celler. Dette systemet er utviklet for å fungere med en inkubasjon kammer til mikroskopet, med lysbildet og slangen før (2 til 5, figur 1) å være plassert inne inkubator, og alle andre komponenter plassert i en stor sekundære container utenfor det mikroskop. I tillegg brukes en kokeplate rørestang med en vedlagt temperatur probe til å vedlikeholde fungal cellene i vedlegg flasken på 37 ° C. Som det er resirkulering, dette systemet er i stand til kontinuerlig imaging under flyt (kan være over 36 h avhengig forhold), og kan brukes på de fleste standard mikroskoper, inkludert stående eller omvendt Borstemmaskin mikroskop. Her diskuterer vi forsamlingen, drift, og rengjøring av flyt apparater, samt som gir noen grunnleggende ImageJ kvantitative algoritmer å analysere videoene etter et eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. samle flyt apparatet
- Konfigurere deler oppført i Tabell av materialer i henhold til skjemaet i figur 1 med hensyn beskrives nedenfor.
Merk: For bekvemmelighet flyten apparat er delt inn i to sider, den grønne siden (alt oppover på lysbildet til media flasker) og oransje side (alt nedstrøms lysbildet til media flasker).- Kontroller at alle flyt apparatet er lufttett å hindre lekkasjer, med unntak av media flasker (figur 1, 1). Dette gjelde rørleggere tape noen mannlige tråder før du monterer unntatt pulsering avdemping (PD) og 2 µm filter flaske (FB), som ikke krever rørleggere tape gummi pakninger holder dem lufttett.
- Bruk øret klemmer på hver piggete utrustning som er under positivt trykk under normal drift (dvs., nedstrøms pumpen).
- Bruk fargekodet lab lydbånd etiketten ventil steder med en A eller G (for vedlegg og vekst, henholdsvis), hvor pumpen, lysbilde tilkobling plasseringene og 0,2 µm filter tilkoblingen.
- Bestemme lengden på rør brukes basert på avstanden mellom flyt systemet og mikroskop, husk at alle flyt apparatet nedstrøms av pumpen til flasker (flertallet av oransje side) skal være i det sekundær containment. Legge til ca 1 m ekstra rør oppstrøms av lysbildet (og fortrinnsvis boble fellen) å plassere i mikroskopet inkubasjon kammeret, som dette sikrer at alle medier når lysbildet blir ved korrekt temperatur.
- Sted boble fellen så nær som mulig i lysbildet, helst inne i inkubasjon kammeret under et eksperiment (bobler ofte skjemaet langs veggen slange); imidlertid huske på at det må være koblet til et vakuum å operere.
- Kontroller at slangen mellom FB og 0,2 µm disponibel filteret er ca 0,5 m lang.
- Legge til en ca 2 cm magnetic røre for å hver media kolbe.
- Få noen form for rør klemmer som flaskeventiler (hemostats kan brukes).
- For brukervennlighet, holde flyten apparatet i en autoclavable kurv. Det kan være nyttig å ha en andre mindre kurv i en større en å tillate lett separasjon av den grønne siden og oransje side.
- For vedlegg kolbe, med en 4 mm borekronen, bore en ekstra hull i gummipropp å imøtekomme termisk sonde (ta vare ikke å gå gjennom et hull). For å få slangen gjennom portene, skyv slangen med pinsett; en gang, klemme slangen for å holde det på plass, og deretter trekke ut pinsett igjen.
Merk: Hvis det ikke er mulig å legge til ekstra hull på gummipropp, en bred munn skruen flaske med skrukork Firedelt kan arbeide i stedet for kolbe og gummi stopperen.
- Når flyten systemet har vært ferdig montert, Lukk ventilene av både grønne og oransje vekst flasker. Bruk vann med vedlegg kolbe slangen og en uteksaminert sylinder kalibrere peristaltiske pumpen i henhold til produsentens instruksjoner.
2. Utfør et eksperiment
- Dagen før eksperimentet begynner forvarming mikroskop inkubasjon kammeret 37 ° c, og forberede en overnatting kultur fungal belastning (fluorescens er ikke nødvendig).
- Samle enkelt bruke komponenter og pumpe, og plasser i en steril biosafety kabinett.
- Fjern boble fellen og temperatur sonde og flyt apparater og plassere disse i biosikkerhet kabinettet.
- Detangle og organisere forbindelsesslangen, om nødvendig.
- Autoclave flyt apparater, inkludert rør barer, i 30 min å sikre steriliteten; Når ferdig, overføre til biosikkerhet kabinett.
- Fest boble fellen, temperatur probe og alle voksen komponenter (unntatt lysbildet) avbildet i figur 1.
- Fjerne stempelet fra 1 mL sprøyte å gjøre det som en "adapter" 0,2 µm filteret (figur 1, 11). Tvinge slangen FB i dette og feste 0,2 µm filteret til slangen førte til vekst kolbe.
- Bruke silikon vakuum fett rundt barb av lysbildet kortet (ta vare ikke å få noen fett på innsiden) før det, som denne hjelper forhindre luftlekkasjer i systemet.
- Fyll vedlegg kolbe med 100 mL 1% (w/v) gjærekstrakt, 2% (w/v) pepton og 2% (w/v) glukose (YPD), og fylle vekst kolbe med 200 mL av YPD. Kontroller at grønne siden slangen når media i hver kolbe.
- Sikre at alle ventiler er åpen. Fest boble fellen til et vakuum, og koble pumpen til grønne siden slangen nedstrøms boble fellen.
- Pumpe væske på en strømningshastighet på 3,3 mL/min helt fylle den grønne siden, dispensere og forkaste ca 1-2 mL av media fordi de første par ml inneholder ofte døde celler eller tilfeldig rusk. Kontroller at den grønne siden av slangen er fylt med medier, og har noen bobler nedstrøms av boble felle før du fortsetter.
- Fyll kanal lysbildet og reservoaret med YPD, ta vare ikke for å introdusere bobler.
- Koble lysbildet til flyt apparater og pumpe mer væske for å opprette en buffer på ca 0,5 m i den oransje siden. Dette er å forhindre tilfeldigvis fangst luft i lysbildet ved tilbakestrømming.
- Klargjøre flyt apparatet for transport til mikroskopet: klemme lukket innløp og utløp av boble felle og klemme grønt og oransje side vedlegg kolbe ventiler lukket. Kontroller at skrulokk for PD og FB er tett som de kan løsne under autoklavering.
- Koble pumpen fra slangen å gjøre transporten enklere. Deretter Flytt alle komponenter, inkludert kokeplate rørestang, i en sekundær beholder nær mikroskopet.
- Klargjøre flyt apparatet for bildebehandling.
- Knytte temperaturmåleren til kokeplate rørestang og begynne oppvarming vedlegg kolbe til 37 ° C. Rør media på 300 rpm og vedlikeholde dette for hele eksperimentet.
- Montere lysbildet på mikroskopet, og bruke tape om nødvendig å strengt sikre den.
- Fest boble fellen til et vakuum (ikke angre klemmen ennå).
- Koble pumpen til flyt apparatet på stedet angitt på figur 1.
- Starte pumpen på en strømningshastighet på 3,3 mL/min, la den kjøre ca 5-10 s, og deretter fjerner boble felle inn-/ utløp klemmen.
- La pumpen for å fortsette å kjøre mens vedlegg flasken varmes opp. Når media har sirkulert i hele flyt systemet, sjekk for normal drift.
- Sjekk beslag luft lekker i oppstrøms av pumpen (noen boble-formasjonen er normalt) eller væske lekker ut nedstrøms.
- Kontroller at den vekst medier kolbe, PD og FB er alle dryppende medier fra innløpet røret (hvis ikke, kan dette bety et tett filter eller en overtightened øret klemme).
- Bruk mikroskopet, kontrollere festet eller rullende celler på kanalen lysbildet. Mange celler kan tyde forurensning under oppsett, eller at polytetrafluoroethylene (PTFE) membranen av boble felle må skiftes.
- Når vedlegg kolbe og inkubasjon kammeret er både på 37 ° C, legge nok natten kultur fungal cellene til vedlegg kolbe å nå 1 x 106 celler/mL.
Merk: Volumet til i µL kan beregnes ved hjelp av denne formelen:
- Vente 15 minutter å at cellene å acclimate.
- Åpne begge grønne og oransje vedlegg kolbe ventiler under lukking begge vekst kolbe ventiler for å starte strømmen av celler.
- Vent ca 5 min å tillate celler til lysbildet, og tillater første fokusering av mikroskopet (denne gangen må kanskje justeres avhengig av lengden på den grønne siden rør). Samtidig kan du justere mikroskopet samme tenkelig parametere forrige forsøk. Hvis dette er første kjøring, følger du disse trinnene:
- Bytt til en lav forstørrelse luft målsetting.
- Finne og fokusere på et tilknyttet celle eller en liten spirende celle.
- Konfigurere kondensatoren for Köhler belysning, deretter bytte til darkfield.
- Angi eksponeringstid til 300 ms.
- Juster belyse intensiteten til en liten celle er svak ennå synlig mot bakgrunnen (et signal til bakgrunnen forholdet mellom ca 7-8 for en spirende datter celle er en fornuftig verdi). Merk/merke belyse intensiteten for senere eksperimenter.
- Konfigurere programvaren for å få et bilde hvert 2 min over 2 timer.
- Starte bildeopptak for vedlegg fase. Sjekk tilbake etter ca 5 og 10 min å sikre at fokus har vært opprettholdt. Hvis ikke, prøver å justere fokusere umiddelbart etter neste bildet er kjøpt.
- Umiddelbart etter vedlegg fasen er ferdig, lagre filen, og åpne deretter begge grønne og oransje vekst kolbe ventiler under lukking begge vedlegg kolbe ventiler. Ta vare ikke for å støte scenen hvis ventiler er inne i inkubasjon kammeret.
- Koble termometer sonden fra kokeplate rørestang.
- Fjern vedlegg kolbe fra kokeplate rørestang og plasser vekst flasken i stedet.
- Konfigurere programvaren for å skaffe et bilde hvert 15 min over 22 h og begynne bildeopptak for vekstfase. Re-fokusere ikke bør være nødvendig, men det anbefales å sjekke flyt apparatet etter noen timer.
- Sjekk beslag luft lekker i oppstrøms av pumpen (igjen noen boble-formasjonen er normalt) eller væske lekker ut nedstrøms
- Sjekk at den vekst medier kolbe, PD og FB er alle dripping media (hvis ikke, kan dette bety et tett filter, en overtightened øret klemme eller tette på en piggete passende hvis cellene som brukes flocculate).
- Sjekk væskenivå i FB. Hvis media nærmer seg toppen av flasken (over 1,5 cm over toppen av filteret), stram både velsmakende (ikke løsne dem, så denne kolbe er under press). Hvis de ikke vil stramme videre, fortsetter eksperimentet (selv om dette kan resultere i en lekkasje), og erstatte gummi pakninger på PD og FB etter neste rengjøring.
- Når vekst fase oppkjøpet er ferdig, lagre filen, og åpne deretter grønn og oransje vedlegg kolbe ventilene som kan gjøre en støy som trykket utgivelser på oransje side. Dra opp på den grønne siden rør kommer fra både media flasker til de er minst flere centimeter over media. Kjøre pumpen med høy hastighet (ca 100 mL/min eller hold nede Spol fremover-knappen på pumpen) for å fjerne alle medier fra slangen, som gjør rengjøringen enklere. Når tømt, koble flyt apparatet fra pumpen og fjerne den fra mikroskopet.
3. Rengjør apparatet flyt
- Fjern alle ikke-autoclavable-komponenter (engangsbruk komponenter, boble felle og temperatur probe), og autoklav flyt apparatet i 30 min. kast brukt engangs komponenter, ren sonde med 70% etanol, og avsette boble felle.
- Etter autoklavering er ferdig, forkaste media, og skyll og avsette media flasker. Deretter koble boble fellen, koble et ibidi kanal lysbilde skal brukes for rengjøring (gjenbrukbare) og koble det med systemet på pumpen på stedet vist i figur 1.
- Klemme lukket oransje side vekst kolbe ventilen.
- Plass ca 200 mL ufortynnet blekemiddel i et beaker. Plasser den gummi stoppers i blekemiddel, og start deretter pumpen med høy hastighet til å sirkulere blekemiddel gjennom flyt apparatet (bortsett fra alle filtre). Når fylt med blekemiddel, stopp pumpen fordi la pumpen på med høy hastighet kan slitasje og bryte slangen.
- Etter bleking i 15 min, hold den gummi stoppers over begeret og starte pumpen du vil fjerne blekemiddel og flyt apparater.
- Gjenta 3.4 og 3.5 to ganger med overflødig vann i stedet for blekemiddel å skylle det med systemet. På denne tiden, rengjør du filtrene bare med vann fordi andre rengjøringsmidler vil korroderer eller tette filtrene.
- Plass slangen som kobler til 0,2 µm media filteret (kommer fra de 2 µm FB) i beger vann med gummi-stoppere fra trinn 3.6.
- Koble slangen festet til mengden av 20 µm innebygd filter, som kan vanligvis bli trukket fra hverandre med letthet til tross for øret klemmen.
- Bruk en vakuum filter kolbe og en lang rør gjennom en ekstra 3-hull stopper for å lage et system som kan koble til flyt apparatet.
- Koble denne vakuumsystem i innløpet til 20 µm filter innløp og starte vakuum; Dette vil trekke vann gjennom filtrene i motsatt retning, fjerne døde celler.
- Dra minst 200 mL vann gjennom filtre, og deretter fjerne slangen fra vannet å tømme filter linjene vann.
- Koble vakuum systemet fra 20 µm filteret, og kobler filteret til den normale rør.
4. kvantifisering videoer
Merk: Alle filer må konverteres til koden bildet (TIF) filformatet å arbeide. I tillegg for å sammenligne mellom eksperimenter, er det avgjørende at alle bildene er tatt med samme mikroskop og tenkelig parametere, som beskrevet ovenfor.
- Dataoverføre og installere ImageJ dersom ikke allerede installert.
- Last ned makrofilen supplerende, og plasserer den i mappen ImageJ\macros.
- Juster gitt makroen:
- Åpne en bildestakk fra et tidligere eksperiment i ImageJ, og velg et tidspunkt med celler.
- Velg fra menyen via "bilde | Type | 8-bit".
- Velg fra menyen via "bilde | Justere | Terskelen". Merk av for "mørk bakgrunn" . Angi høyre rullegardinmenyen til rødt.
- Justere den nedre verdien til alle celler er dekket i rødt med minimal overmål bråk (noen ikke-celle prikker er greit og behandles ut av makroen). Noter dette lavere verdi.
- Lukk både vinduet terskel og åpne bildet.
- Velg fra menyen via "Plugins | Makroer | Rediger". Når du blir bedt om å åpne en fil: "Flytt opp ett mappenivå", deretter velge mappen makroer og åpne filen flyt biofilm kvantifisering makro.
- Endre 15 verdien i alle forekomster av "setThreshold (15, 255);" med verdien i trinn 4.3.4. Lagre filen og lukk dette vinduet.
- Velg fra menyen via "Plugins | Makroer | Installere"og velg filen flyt biofilm kvantifisering.
- Nå under "Plugins | Makroer" menyen, seks nye alternativer for forskjellige video quantifications. Kjør fullstendig analyse og velg vedlegg og vekst videofiler når bedt om å utføre alle tilgjengelige analyser på ervervet dataene og generere automatisk utdatafiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representant bilder av en normal overnatting time-lapse eksperiment ved hjelp av vill-type C. albicans cellene på 37 ° C kan ses i figur 2A og supplerende Video 1. Bildene har vært kontrast forbedret for å forbedre sikten. Kvantifisering av informasjonen ble utført, og representant grafer kan ses i figur 2B. For å generere disse grafer, data var først normalisert tenkelig området (dvs., delt på totalen imaging området) og brøkdel var videre normalisert til biomasse, som beskrevet ovenfor. I tillegg viser vedlegg og avløsning de akkumulerte verdiene over tid, i stedet for enkeltbilde verdiene generert av makroen flyt biofilm kvantifisering. Når grafene har nådd dette stadiet, kan statistiske sammenligninger utføres gjennom regresjon analyser.
Figur 1 : Skjematisk av tofaset resirkulerende flyt apparater. Svarte linjer indikerer rør, og pilspisser viser retningen flyt under normal drift. (A) A skjematisk oversikt av flyt er illustrert. For bekvemmelighet flyt systemet er delt inn i en grønn side (oppstrøms lysbildet) og en oransje side (nedstrøms lysbildet). Fet tallene tilsvarer deler oppført i tabell av materialet. Etiketter for ventiler bare Merk plasseringen for rør klemmer eller hemostats å bli plassert under eksperimenter. Filterrekkefølgen er som følger: 8-20 µm innebygd filter, 9 – 10 µm innebygd filter, 10-2 µm filter flaske (FB) og 11-0.22 µm single bruk disponibel filter. Skjematisk er ikke skala. (B) en nærbilde av gummipropp for vedlegg kolbe, illustrerer de fire komponentene som passerer gjennom portene: media utløp, 0,2 µm luftfilteret som lar gassutveksling, temperatur probe (krever bore et ekstra hull), og media tilbake. (C) en nærbilde av pulsering avdemping (PD) og FB, i tillegg til samlingen skrukork brukes for hver port. Disse flaskene må være lufttett funksjonen. Stikkontakt slangen for PD skal nå dypere inn i flasken enn innløp slangen for riktig funksjon. Det grå rektangelet i FB representerer stål filteret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Candida albicans vill-type celler dyrket under flyt på 37 ° C. (A) representant darkfield mikroskopi bilder av microcolonies som danner under flyt på 37 ° C på de angitte tidspunkt. Skala bar = 100 µm. (B) representant kvantifisering bildedata. Total biomasse tenkelig regionen (bestemmes av densitometry analyse), akkumulert antall celle vedlegg og prosent biomasse brøkdel (avdeling rate normalisert til biomasse) over tid vises for hver stamme. Dataene er n ≥ 3 eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra Video 1. Candida albicans vill-type celler dyrket under flyt på 37 ° C. Denne time-lapse darkfield mikroskopi videoen viser WT feste cellene til underlaget i vedlegg fasen (angitt i øverste venstre hjørne, bilder kjøpt hver 2 min), etterfulgt av påfølgende vekst og utvikling under den vekstfase (starter på 2t; bilder ervervet hvert 15 min). Celle-seeded medier (1 x 106) ble brukt i fasen for vedlegg mens celle-frie medier ble brukt under vekstfase. Flyten er fra høyre til venstre. Skala bar = 50 µm. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av flyt systemet tillater som beskrevet ovenfor generering av kvantitative time-lapse videoer av sopp biofilm vekst og utvikling. Slik at sammenligninger mellom eksperimenter er det av kritisk betydning for å sikre at parameterne tenkelig forblir de samme. Dette inkluderer å sikre at mikroskopet er konfigurert for Köhler belysning for hvert eksperiment (mange guider er tilgjengelig online for denne prosessen). Bortsett fra imaging parametere, er det noen viktige trinn du bør huske på når du arbeider med flyt apparatet. Først er det viktig å sikre at boblen fellen opprettholdes under vakuum under strømning, som gjør det vil føre til luft blir dratt inn gjennom boble fellen. Tilsvarende når boblen fellen ikke er under vakuum (dvs.ved transport flyt apparatet) må både innløp og utløp være festet stengt; ellers vil luft lekkasje i gjennom PTFE membran. Denne klammeren trenger ikke fjernes før boblen fellen er igjen plassert under vakuum. Endelig er det svært viktig å overvåke flyten apparater for potensielle tresko eller lekkasjer. Den mest effektive måten å kontrollere om tresko i systemet er å kontrollere at media drypper fra viker vedlegg eller vekst kolbe, PD og FB. Media fra disse bør være dryppende på relativt lik priser hvis alt fungerer greit. Hvis tette, kan du vanligvis finne hvor som slangen bare oppstrøms av tresko blir mer rigid.
Når dataene er anskaffet, gir vi flere ImageJ makroer for å quantitate videoene. Disse makroene bestemme flere parametere biofilm vekst og utvikling, inkludert et mål på biomasse og prisen som cellene koble til og koble fra overflaten eller biofilm. Beskrivelser av angitte makroene nedenfor.
Fullstendig analyse utfører alle analysene nedenfor, og sender automatisk dataene. Denne makroen kan kjøres uten en åpne bildefil mens alle andre krever en åpen video. Når henrettet, ville den spørsmål til å åpne et vedlegg stakkfilen, deretter en vekst stakkfilen. Etter det vil automatisk analysere bildene og utgang en data-mappen inneholder alle datatabellene, som beskrevet nedenfor, i samme mappe som bildefilen vedlegg. Makroen vedlegg teller utføres bare på vedleggsfilen; alle andre analyser utføres på en sammensatt stabel av vedlegg og vekst. Utdata filer generert er tekstfiler, men skal importeres til excel for brukervennlighet.
Sum intensitet analysen vil analysere hver ramme av det aktive vinduet. Den legger opp alle gråverdier for hver piksel over nedre grensen angitt i trinn 4.3.7 og utganger en akkumulert verdi per bilde. Verdiene som er generert er proporsjonal med biomasse stede i rammen, til noen kamera metning som oppstår. Dataene skal deretter normaliseres til området tenkelig regionen; Dette er ikke utført av makroen.
Dekningsområde analysen vil analysere hver ramme av det aktive vinduet for området av rammen som dekkes av celler (over lavere terskelverdien) som en prosentandel.
Vedlegg counter bruker frame subtraksjon for å bestemme intensiteten summen av alle cellene som festes mellom hver ramme. Dermed er det første datapunktet biomasse av cellene som festes mellom ramme 1 og 2; den andre data er biomasse feste cellene mellom rammer 2 og 3, etc. Disse dataene skal normaliseres til området i regionen tenkelig. For bedre lesbarhet er det også nyttig å integrere denne verdien før grafisk.
Løsgjøring counter fungerer på samme måte som vedlegg teller, men reverserer frame subtraksjon, slik at den fastsetter summen intensiteten av cellene kobler mellom hver ramme. Disse dataene skal også være normalisert til området i regionen tenkelig, og integrert før grafisk. Før integrering, kan disse dataene være videre normalisert til totalsummen intensiteten av det foregående delbildet beregnet summen intensitet analysen. Denne nye verdien representerer andelen av celler som koble fra biofilm på det tidspunkt, som er ofte mer verdifulle data siden biomasse av den koble celler vil øke med økende biofilm biomasse.
Mens flyt systemet presenteres her er mer komplisert å bygge og drive enn andre flyt systemer, tilbyr det flere fordeler. Mange av disse fordelene skyldes vår bruk av et kommersielt tilgjengelige kanal lysbilde. Vev kultur behandling tilgjengelig for disse lysbildene er tilstrekkelig til at Candida celler å forholde seg til overflaten. I tillegg kan profilen til kanal lysbildet som ligner en tradisjonell lysbildet den lett brukes på en rekke mikroskop-systemer, inkludert oppreist mikroskop med lyset på lav forstørrelse. Bruke denne typen mikroskop tillatt oss å bruke darkfield mikroskopi, som gjorde kvantifisering av data enklere, spesielt i forhold til fluorescerende mikroskopi (som det var ingen photobleaching og lav Phototoksisitet). Tradisjonelle mikroskopi (uten optisk snitting) er makt konservative, mening ut av fokus celler bidrar like tall av fotoner til et bilde i fokus celler av lignende størrelse12. Dette betyr at til tross for våre enkelt flyet av imaging, i full 3D voksende biofilm er fortsatt å være kvantifisert hele eksperimentet, selv om høyere regionene er ute av fokus. Denne single-plane bildebehandling har fordelen av dramatisk senke Phototoksisitet skader celler, men gir ikke informasjon på 3D arkitekturen av biofilm. Men kan denne flow-systemet også brukes med fluorescerende celler og AC confocal mikroskop for å få denne informasjonen13.
De unike to kolbe resirkulering oppsett av vår flyt apparater også har mange fordeler. Først mange flyt systemer krever at lysbildene bli pre seeded med celler, men vår bruk av en separat celle-seeded vedlegg kolbe tillater oss å image og kvantifisere celler som de overholder lysbildet mens under flyt, og vi føler at dette er mer lik hva skjer < C0 > i vivo. I tillegg har tidligere vi justere vår mikroskop for høyhastighets bildebehandling og bilde vedheft hendelser som de oppstod i sanntid, i motsetning til kvantifisere dem etter det faktum11. Andre har en celle-fri vekst kolbe som recirculates og opprettholdes celle-ledig over en lengre varighet tillatt oss å forstå hvordan biofilm vokser under flyt over 24 h, en varighet som vanligvis ikke kan utføres med ikke-resirkulering systemer . Vi har ikke ennå bestemt øvre tidsgrensen for hva som kan oppnås med flyt systemet, men vi har fullført 36 h eksperimenter; men jo lenger eksperimentet, jo større er sjansen for en lekkasje eller tett filter. Mange faktorer kan påvirke potensielle varighet et eksperiment, inkludert veksten av cellene, hvordan lim de er, og graden av hyfer formasjon, gjør det vanskelig å definere en øvre grense på varigheten av et eksperiment. Men hvis mye lengre varighet er ønskelig enn kan oppnås med flyt apparatet som presenteres, kan filtrene erstattes med en innebygd ultrafiolett (UV) sterilisering boks som har vært beskrevet tidligere8. Avmerkingsboksen sterilisering kan også tillate flyt apparatet for bildet bakterier; våre tidligere forsøk på å bilde bakteriell stammer resulterte i rask tilstopping 0,2 µm filter. Til slutt, valgte vi ikke for å vedta UV sterilisering, som boksen er tilpasset fabrikkert, og dette vil resultere i resirkulering døde celler.
En annen fordel med denne flow-systemet er at det er rimelig billig i forhold til kommersielle systemer, spesielt hvis du trenger å kjøpe et mikroskop med den. I vår lab kunne vi kjøper et grunnleggende overføres lett Borstemmaskin mikroskop og plassere hele mikroskopet inne en stor standard konveksjon inkubator. Det eneste kravet er at mikroskopet skal ha en nedleggelse funksjon (mekanisk eller elektrisk) for å utføre time-lapse mikroskopi.
Mens dette systemet er allsidig og gir mange fordeler, er det en metode for lav overføringshastighet. Vår flyt apparater er ikke vokse flere stammer i parallell, i motsetning til andre systemer tilgjengelig gjennomstrømning. På grunn av omfattende forberedelse og rengjøring tid er vi bare utføre to eksperimenter i uken. Men mange andre flyt systemer er ganske dyrt, og kan tette når Candida celler dyrkes under hyfer danner forhold.
I tillegg denne flow-systemet er ganske komplekse forhold til andre, og kan være vanskelig å holde i drift. Etter mange eksperimenter, filtre begynner å tette rør begynner å bære tynn og deler starte ruster eller bli løs. dermed krever disse komponentene byttes. Bruk av filtre gjør dette systemet kompatibelt med vekst betingelser av noen fungal stammer; spesielt vil noe som induserer flocculation raskt tette 20 µm innebygde filteret. Imidlertid har tilstrekkelig erfaring fra flyt systemet, blir det lettere å oppdage potensielle problemer før de fører mislyktes forsøket. En ting som kan gjøres for å gjøre den daglige driften av apparatet flyt litt enklere er å ha en maskinist lage en replika av boble felle bolig av en autoclavable materiale (som aluminium eller stål), slik at du kan autoklav boblen overlappe med resten av flyt apparater, som PTFE membran og adapter komponentene av boble felle er autoclavable.
Avslutningsvis representerer tofaset resirkulerende flyt apparatet presenteres her en unik modell bilde og kvantifisere i vitro biofilm dannelsen av sopp under flyt og i sanntid. Mens systemet har sine begrensninger, det er meget tilpasningsdyktig og fungerer godt med de fleste mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Dr. Wade Sigurdson for å gi verdifulle innspill i utformingen av flyt apparatet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 μm inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).
- Araújo, D., Henriques, M., Silva, S. Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes. Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).
- Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).
- Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions. Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow. Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- McCall, A., Edgerton, M. Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development. Journal of fungi. 3 (1), Basel, Switzerland. 13 (2017).
- Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -C. Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models. Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).
- Tati, S., et al. Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis. PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).
