Summary
البروتوكول هو موضح هنا تمكن الباحثون على وجه التحديد تعديل كابسيدس إتش في مواقع مختارة بالكيمياء البسيطة. إتش محمية متجهات الجسيمات ويمكن أن تتولد ناقلات نقل الجين المستهدف، ويمكن دراسة التفاعلات ناقل المضيف.
Abstract
إتش الناقلة أدوات قوية فيروثيرابي التطعيم وأونكوليتيك الوراثية. ومع ذلك، هم عرضه للتفاعلات غير مرغوب فيها ناقل مضيف متعددة، لا سيما بعد الولادة في فيفو . والتغلب على توافق في آراء بأن القيود المفروضة من تفاعلات غير مرغوب فيها ناقل المضيف يمكن فقط إذا كان يتم إجراء تعديلات محددة من سطح ناقلات الأمراض. وتشمل هذه التعديلات التدريع من الجسيمات من تفاعلات غير مرغوب فيها، والاستهداف بالأخذ بالجديد يغاندس. هدف البروتوكول المعروضة هنا تمكين القارئ من إنشاء محمية والمستهدف إذا رغبت، ناقلات نقل الجين البشري إتش أو فيروسات أونكوليتيك. البروتوكول سوف تمكن الباحثين من تعديل سطح إتش متجه كابسيدس بالمرفقات الكيميائية المحددة للبوليمرات الاصطناعية والكربوهيدرات والدهون، أو أخرى مويتيس بيولوجية أو كيميائية. فهو يصف التكنولوجيا المتطورة من التعديلات مجتمعة قفيصه الجينية والكيميائية، التي تظهر لتسهيل التفاهم والتغلب على الحواجز في فيفو تسليم ناقلات إتش. ويرد وصف مفصل وعلقت من الخطوات الحاسمة لإجراء تفاعلات كيميائية محددة مع الفيروسات النشطة بيولوجيا أو ناقلات المستمدة من الفيروس. التكنولوجيا المبينة في البروتوكول يستند إلى إدخال الوراثية سيستين (وبطبيعة الحال غائبا) المخلفات في الحلقات المعرضة للمذيبات من ناقلات المستمدة من إتش. توفر هذه المخلفات سيستين من مفاعليه كيميائية محددة التي يمكن، بعد إنتاج الناقلات التتر عالية، يمكن استغلالها لاقتران الكيميائية التساهمية محددة وكفاءة عالية من الجزيئات من مجموعة متنوعة واسعة من فئات المضمون إلى الموجه جسيمات. الأهم من ذلك، يمكن بسهولة تكييف هذا البروتوكول القيام بمجموعة متنوعة واسعة من مختلف التعديلات الكيميائية (غير ثيول المستندة) من إتش متجه كابسيدس. وأخيراً، أن من المرجح أن ناقلات نقل الجينات المستندة إلى الفيروسات غير المغلفة أخرى من إتش يمكن تعديلها على أساس هذا البروتوكول.
Introduction
غدية (Ad)، أعضاء في أسرة أدينوفيريداي، هي غير يلفها فيروسات الحمض النووي من أنواع أكثر من 70 حتى الآن تم تحديدها (http://hadvwg.gmu.edu). اعتماداً على خصائص هيماجلوتينيشن وبنية الجينوم وتسلسل النتائج، يمكن تقسيم أنواع الإعلانات 70 إلى سبعة أنواع (البشرية غدية من ألف إلى زاي)1،2. الإعلانية المجين البشري هو 38 كيلو بايت في الحجم ومغلفة نوكليوكابسيد إيكوساهيدرال3. نظراً لما وفرة، هيكسون البروتين قفيصه، بينتون حكم عليه إلى قاعدة، والألياف هي جميعها المشار إليها كبروتينات قفيصه الرئيسية. ويشكل البروتين قفيصه هيكسون الأكثر وفرة وأكبر 20 قفيصه الأوجه، يتألف كل منهما من 12 هيكسون هوموتريميرس4،5. يتكون من بينتاميرس قاعدة بينتون حكم عليه إلى بينتون حكم عليه إلى، يقع على كل حافة icosahedral (الرأس)، ويمثل القاعدة لارتفاع الذروة التي بنيت الغليكوزيلاتي الألياف أرتب5،6. إدخال خلية الإعلان الأصلي يتكون أساسا من خطوتين رئيسيتين. أولاً، بمقبض الألياف ربط مستقبلات الأولية. في أنواع الإعلانات من الأنواع أ، ج، هاء وواو، هذا هو مستقبلات كوكساكي واتش (السيارات). يجمع هذا التفاعل virion القرب المكاني من سطح الخلية، مما ييسر التفاعل بين إينتيجرينس الخلوية وإدارات-عزر في بينتون حكم عليه إلى قاعدة والاستجابات الخلوية وبالتالي حمل. ثانيا، التغيرات في سيتوسكيليتون تؤدي إلى استيعاب virion والنقل إلى دخلول7. يطلق على التفكيك الجزئي في دخلول، virion إلى السيتوبلازم أوند يسافر في نهاية المطاف إلى نواة للنسخ المتماثل.
بينما يمكن أن يتم تسليم الإعلان محلياً (على سبيل المثال.، للتطعيم الجيني)، تسليم المنهجي من خلال مجرى الدم كما هو مطلوب أونكو فيروثيرابي يواجه عدة حواجز. بينما تنتشر في مجرى الدم، تواجه فيريونس حقن نظام الدفاع المناعي للمضيف، مما يؤدي إلى تحييد سريع لناقلات القائم على الفيروس وتقديم ناقلات القائم على الإعلان بالغة الكفاءة في تطبيقات النظم. وعلاوة على ذلك، هيباتوتروبيسم الطبيعية للإعلان يتعارض مع التسليم النظمية ويجب حلها لإعادة توجيه الإعلانات إلى الخلايا المستهدفة الجديدة بها.
Germline ترميز الأجسام المضادة IgM الطبيعية لنظام المناعة الفطرية تعترف بسرعة وربط الهياكل العالية المتكررة على السطح من8،virion9. قم بتنشيط هذه المجمعات مأمن الممرات الكلاسيكية وغير الكلاسيكية لتكملة النظام، مما يؤدي إلى تحييد سريع بوساطة تكملة لجزء كبير من فيريونس8. توسط الضامة10 طريقا ثاني أسفر عن إزالة فيريونس الإعلانية الرئيسية والمرتبطة بحادة السمية وديناميكية دموية الآثار الجانبية11،12. وفي حالة الإعلان على وجه الخصوص، كوبفر الخلايا المقيمين في الكبد ربط وفاجوسيتيكالي تناول فيريونس الإعلانية عن طريق مستقبلات الزبال محددة، وبالتالي القضاء عليها من الدم13،14،15 . وتم أيضا تحديد مستقبلات محددة الكاسح في خلايا بطانية جيبية الكبد (خلايا بورصة لندن)16، وخلايا بورصة لندن ويبدو أيضا أن تسهم ناقل القضاء17، ولكن إلى أي مدى لا يزال يحتاج إلى التوضيح. وعلاوة على ذلك، بعض أنواع الإعلانات ووسائل إيصالها المشتقة كفاءة المحتبسة بالكريات الحمراء البشرية18 التي تربط عبر السيارة أو مستقبلات تكملة CR119. من المذكرة، لا يمكن دراسة هذه الآلية عزل في النظام النموذجي الماوس كما هو الحال في التباين للبشرية الكريات الحمراء، الكريات الحمراء الماوس لا تعبر عن السيارة.
الإعلانات المضادة أجسام مضادة محددة إنشاؤها بواسطة الجهاز المناعي التكيفي بعد التعرض للإعلانات أما بسبب الإصابات السابقة مع الإعلان أو بعد الولادة الأولى في تطبيقات النظم رفع حاجزاً آخر للاستخدام الفعال لناقلات الإعلانية، وأنها ينبغي أن تكون التهرب في تقديم النظامية بكفاءة.
وأخيراً، هيباتوتروبيسم قوية من بعض أنواع الإعلانات (بما في ذلك Ad5) شدة يعوق تطبيق الإعلان في العلاج المنهجي. انتحاء هذا الناتج في توصيل تتمثل سبب تقارب عالية من virion الإعلانية للدم تخثر عامل X (إكس)، بوساطة بالتفاعل بين العملات الأجنبية مع الإعلان هيكسون البروتين20،،من2122. FX الجسور virion إلى كبريتات الهيبارين جليكانس (هسبجس) على سطح خلايا الكبد20،23،،من2425. ويبدو عاملاً حاسما لهذا التفاعل أن قدر معين من الكبرتة ن ويا من هسبجس في24من خلايا الكبد، الذي يختلف عن هسبجس في أنواع الخلايا الأخرى. وبالإضافة إلى هذا المسار بوساطة الفوركس، تشير الدراسات التي أجريت مؤخرا لم يتم بعد تحديد مسارات أخرى تلك النتيجة في توصيل الإعلانية لخلايا الكبد26،،من2728.
في الآونة الأخيرة، ثبت أن العملات الأجنبية لا تشارك فقط في توصيل تتمثل في الإعلان، ولكن أيضا ملزمة، virion الدروع الجسيمات فيروس ضد الأبطال ب نظام مكمل26. ولذلك، سيخلق الحد توصيل تتمثل بمنع FX ملزمة، الآثار الجانبية غير المرغوب فيها لزيادة الإعلان الأبطال عبر نظام المناعة الفطرية.
ولمعرفة عميقة بالتفاعلات المعقدة بين الكائنات المضيفة ومتجهات الضروري على تطوير ناقلات أكثر كفاءة للتطبيقات النظامية التي تجاوز العقبات التي فرضتها الكائن المضيف.
إحدى الاستراتيجيات التي استخدمت أصلاً للبروتينات العلاجية تم تكييف لناقلات الإعلان جزئيا على الأقل التغلب على الحواجز الموصوفة أعلاه. ويمكن تخفيض أنتيجينيسيتي والاستمناع لمركبات البروتين العلاجي باقتران للبولي إثيلين غليكول (شماعة)29،30. ومن ثم، اقتران التساهمية البوليمرات مثل الوتد أو بولي [N-(2-هيدروكسيبروبيل) ميثاكريلاميد] (فبما) إلى قفيصه سطح الدروع الموجه من تفاعلات غير مرغوب فيها ناقل المضيف. وبشكل عام، البوليمر اقتران أهداف اليورو-أمين مجموعات من بقايا الجانب يسين أن تكون موزعة بشكل عشوائي على السطح قفيصه. ناقل الجزيئات في الحل، نظراً لطبيعة ماء للبوليمرات المرفقة، يحيط بها قذيفة مياه مستقرة أن يقلل من خطر الاعتراف الخلايا المناعية أو تدهور الانزيمية. وعلاوة على ذلك، عرضت ناقلات سي الإعلانية للتهرب من الأبطال بمكافحة هيكسون الأجسام المضادة في المختبر وفي الفئران قبل تحصينهم في فيفو31. على النقيض من التعديلات الوراثية قفيصه، يتم اقتران الكيميائية للبوليمرات بعد الإنتاج والتنقية، مما يتيح ليس فقط لاستخدام الخلايا المنتجة التقليدية وإنتاج مخزونات ناقلات عيار عالية، ولكن أيضا لتزامن تعديل الآلاف من الأحماض الأمينية على سطح قفيصه. ومع ذلك، يوجه أمين التدريع تحدث بشكل عشوائي في جميع أنحاء سطح قفيصه كله، أدى إلى ارتفاع التغاير وعدم السماح بتعديل كابسوميرس محددة. وعلاوة على ذلك، يضعف مويتيس البوليمر الكبيرة المطلوبة للآثار المفيدة فيروس بيواكتيفيتي32.
للتغلب على هذه القيود، كريبيل وآخرون. 33 عرض مفهوم جنتي-الكيميائية لمكافحة ناقلات الطاقة المتجددة-وإلغاء الاستهداف. وأدخلت سيستينيس وراثيا في قفيصه الفيروس في المواقع المعرضة للمذيبات مثل الألياف مرحبا-حلقة33والبروتين التاسع34و35،هيكسون36. على الرغم من أن يمكن أن تنتج نواقل الإعلانية لا تحدث بشكل طبيعي، سيستين الحاملة في التتر عالية في الخلايا منتج طبيعي. الأهم من ذلك، يسمح إدراج سيستينيس في بعض كابسوميرس، وفي مواقع مختلفة داخل كابسومير واحد لإجراء تعديلات محددة للغاية من مويتيس ثيول المجموعة المتفاعلة. لقد ثبت هذا النهج جينيتي والكيميائية للتغلب على العديد من العقبات في تصميم ناقل الإعلانية. مزيج بيجيلاتيون المستندة إلى أمين للاستهداف واقتران المستندة إلى ثيول الترانسفيرين إلى مقبض الألياف قد ثبت حلقة مرحبا بنجاح استهداف ناقلات الإعلانية ل الخلايا التي تفتقر إلى سيارات33تعديل. منذ هيكسون تشارك في التفاعلات الأكثر غير مرغوب فيها (تحييد الأجسام المضادة، عامل تخثر الدم FX)، كما تطبق استراتيجيات التعديل على أساس ثيول هيكسون. اقتران الصغيرة شماعة مويتيس إلى HVR5 هيكسون منعت الإعلانية ناقل الجزيئات ترانسدوسي الخلايا سكوف-3 حضور العملات الأجنبية، بينما زادت مويتيس شماعة كبيرة تتمثل توصيل14،35. وعرضت الإعلانية الجسيمات ناقلات تحمل طفرات في مقبض الألياف يحول دون ربط السيارة وملزمة HVR7 المثبطة للعملات الأجنبية (وتأثير إدراج سيستينيس في HVR1 بيجيليشن الخاصة بالموقف) التهرب من تحييد الأجسام المضادة وتكملة وساطة، كذلك الكاسح بوساطة مستقبلات الامتصاص دون فقدان للعدوى. من المثير للاهتمام، على الرغم من عدم وجود درع FX الطبيعية، بيجيليشن مرة أخرى تحسين توصيل من خلايا الكبد كدالة ل حجم شماعة36. ومع ذلك، اتضح أن التدريع التساهمية تؤثر على عمليات الاتجار بالبشر داخل الخلايا. تهوية وآخرون. مقارنة لا رجعة فيه مقابل دروع بيوريسبونسيفي استناداً إلى فبما، وبينت أن لا وضع المجان التدريع لا البوليمر المشارك كان لها أثر على إدخال خلية، لكن يؤثر على الجسيمات الاتجار إلى النواة. تستخدم كدرع بيوريسبونسيفي مع البوليمرات المشارك فبما مشحونة بشكل إيجابي يسمح للجسيمات الاتجار إلى النواة، الحفاظ على توصيل عالية الكفاءة للإعلان متجهات في المختبر و في فيفو37.
وخلاصة القول، تشير هذه البيانات إلى أن، حتى في ظل الافتراض بأن جميع المتجهات-المضيف-التفاعلات كانت معروفة ونظرت، التعديلات السطحية قفيصه المفرطة ضرورية للتغلب على العقبات المرتبطة بتسليم ناقلات الأمراض الجهازية.
ونقدم هنا بروتوكولا لإجراء التعديلات الكيميائية الخاصة بالموقع من إتش كابسيدس ناقل التدريع و/أو إعادة توجيه جزيئات النواقل إتش وفيروسات أونكوليتيك على أساس إتش. ويرد في الشكل 1مفهوم هذه التكنولوجيا. وهو يسمح التدريع بعض المناطق قفيصه من تفاعلات غير مرغوب فيها بمرفق التساهمية البوليمرات الاصطناعية. في الوقت نفسه، كما يوفر وسيلة لإرفاق يغاندس والجمع بين التدريع والاستهداف. استخدام الكيمياء البسيطة، سوف تكون قادرة على تعديل تساهمي إتش متجه السطح مع مجموعة متنوعة من الجزيئات بما في ذلك الببتيدات/البروتينات والكربوهيدرات والدهون، والجزيئات الصغيرة الأخرى المجربون. وعلاوة على ذلك، ينص البروتوكول على مفهوم عام لتعديل المواد الكيميائية النشطة بيولوجيا ناقلات المستمدة من الفيروسات تحت صيانة السلامة البيولوجية والنشاط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: في ما يلي، بروتوكول بيجيليشن جنتي-الكيميائية الإعلان ناقل يتم وصف بالتفصيل. لتمكين اقتران محددة من مجموعة الوتد، متجه Ad5 كان مقدما وراثيا تعديل بواسطة إدخال بقايا سيستين في البروتين هيكسون في الحلقة هايبرفاريابل 5 كما هو موضح في منشور سابق36، وشماعة ماليميدي المنشط مجمع كاقتران مركب.
1. إعداد المخازن المؤقتة لتنقية متجه بالتدرجات خطوة CsCL
- إعداد 400 مل إتش المخزن المؤقت (Ad-المخزن المؤقت) عن طريق إضافة 50 مم حبيس (4.76 ز/400 مل) و 150 مم كلوريد الصوديوم (ز 3.504/400 مل) إلى الماء المقطر مزدوجة (ddH2س). 350 مل من هذا المخزن المؤقت مطلوب لإعداد الخيارات الإعلانية-المخزن المؤقت الثلاثة التالية.
- البديل ألف: ضبط 150 مل من الإعلان-المخزن المؤقت على درجة الحموضة 7.6 مع هيدروكسيد الصوديوم.
- البديل باء: إضافة تركيز نهائي 10 مم تسيب [tris(2-carboxyethyl)phosphine)، ز 0.143] إلى 50 مل وضبطه على درجة الحموضة 7.2 مع HCl.
- الخيار جيم: إضافة تركيز نهائي من 0.5 مم تسيب (0.022 g) إلى 150 مل وضبطه على درجة الحموضة 7.2 مع HCl.
- إعداد المخازن المؤقتة في ddH2س والمرتبة التحليلية من المواد الكيميائية. استخدام 100 مل من الخيار ألف والخيار جيم لتجهيز المخازن المؤقتة CsCl (انظر الخطوات 1.2 و 1.3؛ 50 مل لكل منهما) اللازمة للتدرجات خطوة CsCl (راجع الخطوات 3.2.6. و3-2-18).
- إعداد المخزن المؤقت التدرج خطوة CsCl (ρCsCl = 1.41 غرام/سم3) في المخزن المؤقت الإعلانية
ملاحظة: ستكون هناك حاجة هذا المخزن المؤقت في أشكال مختلفة اثنين:- وزن مختبرين اثنين من الضبط 27.42 ز CsCl إلى أنابيب 50 مل.
- ΡCsCl = 1.41/تسيب المخزن المؤقت: حل CsCl في 40 مل البديل ج من الإعلان-المخزن المؤقت.
- ΡCsCl = 1.41 المخزن المؤقت: حل CsCl في 40 مل البديل ألف للإعلان-المخزن المؤقت.
- تحقق، وإذا لزم الأمر، ضبط درجة الحموضة مع HCl. التعبئة حتى بالضبط 50 مل مع المتغير buffer الإعلانية المقابلة. لتحقيق أفضل النتائج الانفصال، بالضبط CsCl التركيز ودرجة الحموضة الحاسمة.
- فحص الكثافة (CsCl المحتوى) التي تزن 1 مل (1.41 ز) لكل المخزن المؤقت للتدرج.
- إعداد المخزن المؤقت التدرج خطوة CsCl (ρCsCl = 1.27 غ/سم3) في المخزن المؤقت الإعلانية
ملاحظة: هناك حاجة إلى هذا المخزن المؤقت في أشكال مختلفة اثنين:- وزن مختبرين اثنين من الضبط 18.46 ز CsCl في أنابيب 50 مل.
- ΡCsCl = 1.27/تسيب المخزن المؤقت: حل CsCl في 40 مل البديل ج من الإعلان-المخزن المؤقت.
- ΡCsCl = 1.27 المخزن المؤقت: حل CsCl في 40 مل البديل ألف للإعلان-المخزن المؤقت.
- تحقق، وإذا لزم الأمر، تعديل درجة الحموضة مع HCl. وأخيراً، ملء حتى بالضبط 50 مل مع البديل إعلانية-المخزن المؤقت المطابق. لتحقيق أفضل النتائج الانفصال، بالضبط CsCl التركيز ودرجة الحموضة الحاسمة.
- فحص الكثافة (CsCl المحتوى) التي تزن 1 مل (1.27 g) لكل المخزن المؤقت للتدرج.
- تعقيم كافة المخازن المؤقتة (المخازن المؤقتة الإعلانية ومخازن التدرج خطوة CsCl) عن طريق الترشيح (باستخدام حجم المسام مش 0.45 ميكرومتر) في زجاجات معقمة.
- وبعد التعقيم، لمنع أكسدة تسيب، تشبع وتراكب المخازن المؤقتة التي تحتوي على تسيب مع الأرجون بالرش في المخازن مع غاز الأرجون لحوالي 30 ثانية. الحرص على إلا تستخدم الأجهزة العقيمة (مثلاً.، العقيمة "الماصة؛" نصائح) عند تطبيق غاز الأرجون، واستخدام زجاجات كبيرة بما يكفي للسماح بجلد الأرجون.
ملاحظة: كافة المخازن المؤقتة ينبغي إعداد جديدة ومحمية من الضوء ويمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لعدة أيام (لا سيما CsCl خطوة التدرج المخازن المؤقتة التي ينبغي أن يوضع فقط لبضعة أيام).
2-اقتران مويتيس: تخزين وإعداد
ملاحظة: مويتيس المستخدمة لاقتران إلى سيستينيس بحاجة إلى تحمل جماعات ثيول المتفاعلة. مركبات ماليميدي المنشط ستشكل سندات ثيوثير مستقرة مع سيستينيس أدخلت وراثيا. وبدلاً من ذلك، اورثو-بيريديلديسولفيدي (أوبس)--يمكن أن تستخدم مركبات منشطة، التي تشكل بيوريسبونسيفي ثنائي كبريتيد الجسور بين جزيئات النواقل واقتران مجموعة. 750 مالبيج المجففة بالتبريد، فضلا عن معظم الكواشف اقتران أخرى حساسة للتحلل المائي ويجب تخزين جافة في شكل المساحيق المجففة بالتبريد في-80 درجة مئوية.
- لمنع تراكم التكثيف المياه عند ذوبان الجليد قنينة، تخزين قارورة في أنابيب أكبر (مثلاً.، أنابيب 50 مل) مليئة بوسادة خرز هلام السليكا. تخزين هذه الأنابيب في حاوية أكبر كافية أيضا مليئة بوسادة حبة هلام السليكا.
- قبل أحكام إغلاق كل أنبوب والحاوية، تبادل الهواء مع غاز الأرجون. يمكن تحقيق هذا عن طريق وضع الأنابيب مفتوحة والحاويات إلى مجفف، متبوعاً بإزالة واستبدال الهواء بغاز الأرجون. ولما أثقل من الهواء غاز الأرجون، الأنابيب والحاويات تمتلئ غاز الأرجون ويمكن الآن وضع إلى بعضها البعض، مع كل غطاء مغلقة بأحكام.
- تخزين الحاويات في-80 درجة مئوية.
- عند ذوبان الجليد، وضع الحاويات على السليكا الخرز في مجفف ببطء الحارة منها ما يصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم فتح الحاوية.
- عند القيام برد فعل اقتران، حل طازجة مقدار اقتران الركيزة اللازمة في المذيب المناسب. الحرص على عدم إضافة أكثر من 10% من اقتران حل لرد فعل اقتران النهائي، خاصة إذا كان يتم استخدام DMF أو [دمس] المذيب للركيزة اقتران.
3-التضخيم وتنقية وتعديل المواد الكيميائية من ناقلات الإعلانية:
- تضخيم ناقلات الإعلانية
ملاحظة: يجب إجراء الخطوات التالية استخدام خزانة سلامة وفقا لقواعد السلامة البيولوجية المحلية.- ترانسفيكت ناقل Ad ∆E1 ناقصة النسخ متماثل الذي يحتوي على residue(s) سيستئين وراثيا قدم واحدة (أو أكثر) إلى HEK 293 الخلايا كما وصفها كراتزر وكريبيل38.
- وفقا للبروتوكول38، تضخيم الموجه من رينفيكتيونس متسلسلة تصل إلى مرض محضرة نهائي 15-20 الكبيرة (15 سم) خلية ثقافة اللوحات (حوالي 1-2 × 107 خلايا/اللوحة).
ملاحظة: على النحو الأمثل، الإصابة الأخيرة ينبغي أن تكون في الوقت المناسب حيث تظهر الخلايا تأثير سيتوباثيك الكامل (CPE) في الصباح لتنقية وتعديل الأداء (انظر الشكل 2). - بعد هذه الخطوة التضخيم النهائي، يمكن أن تجمد الخلايا حراكه في المخزن المؤقت للإعلان + 10 مم تسيب (البديل باء) في-80 درجة مئوية؛ مع ذلك، ينصح للعائد الأمثل جزيئات النواقل، متابعة فورية لخلية تفسخ وناقلات وتنقية وتعديل.
- تعديل تنقية والكيميائية لناقلات الإعلانية
ملاحظة: تتم تنقية العوامل الناقلة للمرض وفقا للبروتوكول تنقية إتش الموصوفة في38ولكن في ظل ظروف غير المؤكسدة. الخلية الحصاد وتحلل، فضلا عن تعديل ناقل التنقية والمواد الكيميائية التي يمكن أن يؤديها خلال يوم واحد. الحصاد والخلايا المصابة وفقا للبروتوكول، المذكورة سابقا38.- جمع الخلايا عن طريق إلغاء اللوحات ونقل المادة طافية على أنابيب الطرد المركزي 200-500 مل.
- تدور الحل خلية لمدة 10 دقائق في 400 x ز.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 4 مل من المخزن المؤقت الإعلانية + 10 مم تسيب (الرقم الهيدروجيني 7.2) (البديل باء) ونقل إلى أنبوب 50 مل عقيمة. إذا كانت منخفضة الغلة الخلية أو حملت فقط ضعف التعليم المهني المستمر، ريسوسبيند أنه في 2 مل.
- الإنقاذ المتجهة من 3 دورات تجميد (في النتروجين السائل) وذوبان الجليد (في حمام مائي 37 درجة مئوية).
- تدور لمدة 10 دقيقة في 5,000 ز x عند 4 درجة مئوية.
- بينما سينتريفوجينج، إعداد التدرجات خطوة CsCl تساوي اثنين:
- أولاً، كمرحلة انخفاض، أضف 3 مل من 1.41 غرام/سم3 ρCsCl في المخزن المؤقت الإعلانية + 0.5 مم تسيب (الرقم الهيدروجيني 7.2، الخيار جيم) في أنابيب أولتراسينتريفوجي. وضع علامة على مستوى المرحلة الدنيا في الأنبوب قبل تحميل المرحلة العليا.
- بعناية المكدس في المرحلة العليا من 5 مل من 1.27 غ/سم 3 ρCsCl في المخزن المؤقت الإعلانية + 0.5 مم تسيب (الرقم الهيدروجيني 7.2، الخيار جيم) من بيبيتينج حجم 5 مل على طول جدران الأنبوب إلى مرحلة انخفاض ببطء شديد.
ملاحظة: منذ خلال اقتران تركيزات عالية من تسيب يمكن أن تتفاعل مع بقايا ماليميدي مالبيج-750 ويؤدي إلى اقتران انخفاض الكفاءة، وتنقية بالتدرج خطوة تحتاج إلى أن تم تنفيذه بالفعل تحت تركيز تسيب انخفاض CsCl.
- تحميل المادة طافية على التدرج CsCl [أما التساوي تقسيم المادة طافية على كل التدرجات، أو في حالة من ناقلات منخفضة غلة (انظر أعلاه)، وتحميل المادة طافية على عمود واحد فقط]، وملء كل التدرجات على قدم المساواة إلى الأعلى مع المخزن المؤقت للإعلان + 10 مم تسيب (الأس الهيدروجيني 7 .2, البديل باء).
- ضبط وزن أنابيب المعاكس إلى اختلاف وزن ز 0.0.
- Ultracentrifuge ح 2 في 176,000 س ز في 4 درجات مئوية.
- مع المشبك، إصلاح أنبوب تنبيذ فائق للوقوف، تاركاً المنطقة المحيطة بعلامة مستوى المرحلة الدنيا موجوداً. ضع مصباح gooseneck أعلاه الأنبوب. حول العلامة، على الحدود بين مراحل السفلي والعلوي، ينبغي أن تكون فرقة متميزة (فيريونس متجه) مرئية (الشكل 3 ألف-3 ج).
- جمع الناقلات بثقب الأنبوب بإبرة وتطمح الفرقة متجهة في محقن. نقل فيريونس المتجهات التي تم جمعها إلى أنبوب 15 مل.
ملاحظة: العصابات الأضعف فوق الفرقة ناقل الإعلان تحتوي على جزيئات النواقل غير مكتملة وينبغي تجنبها للطموح. خلية تحت الأنقاض وأخضر نيون البروتين (اجفب) من التعبير عن اجفب الإعلانية-ناقلات سوف تجمع في الجزء العلوي من أولتراسينتريفوجي أنبوب (انظر الشكل 3 ألف و 3 باء). هذا والخطوات التالية التي تصل إلى اقتران (الخطوة 3.2.16) ينبغي القيام بسرعة، كما الناقلة الآن معقولة لثنائي كبريتيد الترابط بسبب تركيز تسيب منخفضة. - لحساب مقدار اقتران الركيزة اللازمة لكفاءة ملزمة كاملة من الركازة إلى جميع بقايا السيستين في إعداد ناقلات، قياس OD260:
- ووفقا للبروتوكول، المذكورة كراتزر وكريبيل38ودوامه خليط من 10 ميليلتر من فيريونس المتجهات التي تم جمعها، 89 ميليلتر من المخزن المؤقت الإعلانية و 1 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10%. مسبار فارغة، دوامة 99 ميليلتر من المخزن المؤقت الإعلانية و 1 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10%.
- أن تؤذي فيريونس، احتضان سواء على 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تحديد OD260.
- حساب عيار ناقلات الأمراض الجسدية كل ميليلتر باستخدام المعادلة التالية: OD260 × معامل لتمييع × معامل الانقراض تصميماً تجريبيا الإعلانية (1.1 × 109 ناقلات الجسيمات = OD 1260 وحدة/ميليلتر). ولذلك، OD قياس260 من 1.36 ناقل المخفف 01:10، أن تقوم بحساب إلى: 1.36 x 10 x 1.1 x 109 = حوالي 1.5 ×10 10 ناقلات الجسيمات/ميليلتر.
ملاحظة: هذا عيار فقط إجراء تقدير تقريبي؛ ومع ذلك، أنها دقيقة بما يكفي للمقايسة الحسابات المبينة فيما يلي.
- اعتماداً على البروتين تعديل مقدمة من سيستين، تحديد كمية الركازة اقتران (بالغرام) لفعل اقتران كفاءة، وفقا للمعادلة العامة التالية: عيار الفيروس x حجم x عدد سيستينيس x الزائدة مجموعة x الوزن الجزيئي لمجموعة/6,022 × 1023 = غراما من اقتران الركازة.
ملاحظة: في هذه المعادلة: 1) فيروس عيار عيار/ميليلتر، يحدده OD260 كما هو موضح أعلاه، حسابات 2) وحدة التخزين لوحدة التخزين في ميليلتر ناقلات منشودا المستخدمة في رد فعل اقتران، وهو 3) عدد سيستينيس عدد البروتينات التي السيستين بقايا قدم كل ناقل الجسيمات، 4) الزيادة في مجموعة هو عامل لمجموعة الزائدة اللازمة لفعل اقتران كفاءة (50 س)، و 5) يجب إدخال الوزن الجزيئي لمجموعة دا (لا كاتشين). - حل طازجة مقدار المركب (أو المبلغ الممكن) المطلوبة في المذيب المناسب.
ملاحظة: كما كمية الركازة اقتران حاجة منخفضة ويصعب على وزن لكنها مكلفة، وزن الحد الأدنى من مجمع ممكن وحله في بتركيز مناسب للتطبيق إلى رد فعل اقتران. - نقل الحل متجه إلى أنبوب حجم مناسب (مثلاً، أنبوب 2 مل) وإضافة المبلغ المحسوب لاقتران حل الأسهم مركب إلى الموجه.
- مزيج بلطف الحل بالتناوب علوية ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- تملأ الحل متجه إلى الحجم الإجمالي 6 مل مع المخزن المؤقت الإعلانية (7.6 درجة الحموضة، الخيار ألف).
ملاحظة: يجب إجراء هذه الخطوة قبل أن يتم تطبيق الحل على التدرج خطوة لضمان الحل ناقلات الأمراض، التي لا يزال يحتوي على CsCl من التدرج خطوة أولى، بكثافة أقل 1.27 غ/مل. - في خطوة النطاقات CsCl ثانية، تنقية الموجه من مجموعة اقتران الممتص:
- إعداد التدرجات خطوة CsCl تساوي اثنين بتنفيذ الخطوات التالية لكل: المرحلة 1) أقل: 3 مل من 1.41 غرام/سم3 ρCsCl في المخزن المؤقت الإعلانية (7.6 درجة الحموضة، البديل ألف)، 2) علامة مستوى المرحلة الدنيا في الأنبوب قبل تحميل المرحلة العليا، والمرحلة 3) العلوي : 5 مل من 1.27 غ/سم3 ρCsCl في المخزن المؤقت الإعلانية (7.6 درجة الحموضة، الخيار ألف).
ملاحظة: بعد اقتران حدث، المخازن المؤقتة دون تسيب تستخدم، كما ينبغي أن يكون أي جماعات ثيول مجاناً الآن موجودة على كابسيدس متجه. - تحميل المادة طافية على التدرج CsCl وملء كل التدرجات على قدم المساواة إلى الأعلى مع المخزن المؤقت الإعلانية (7.6 درجة الحموضة، الخيار ألف).
- ضبط أوزان الأنابيب المعاكس إلى اختلاف وزن ز 0.0.
- إعداد التدرجات خطوة CsCl تساوي اثنين بتنفيذ الخطوات التالية لكل: المرحلة 1) أقل: 3 مل من 1.41 غرام/سم3 ρCsCl في المخزن المؤقت الإعلانية (7.6 درجة الحموضة، البديل ألف)، 2) علامة مستوى المرحلة الدنيا في الأنبوب قبل تحميل المرحلة العليا، والمرحلة 3) العلوي : 5 مل من 1.27 غ/سم3 ρCsCl في المخزن المؤقت الإعلانية (7.6 درجة الحموضة، الخيار ألف).
- Ultracentrifuge ح 2 في 176,000 س ز في 4 درجات مئوية.
- قبل وقت قصير من انتهاء تنبيذ فائق، حجته عمود PD-10 مرات 5 مع 5 مل من المخزن المؤقت الإعلانية (7.6 درجة الحموضة، الخيار ألف).
- وكما فعلت في الخطوة 3.2.10، إصلاح أنبوب تنبيذ فائق للوقوف على مغادرة المنطقة حول علامة مستوى المرحلة الدنيا موجوداً. ضع مصباح gooseneck أعلاه الأنبوب. عصابة متميزة (فيريونس متجه) حول الحدود بين مراحل السفلي والعلوي، مرة أخرى، ينبغي أن يكون مرئية (الشكل 3).
- جمع الناقلات بثقب الأنبوب بإبرة وتطمح الفرقة متجهة إلى حقنه، ونقل المتجه إلى أنبوب 15 مل. الحرص على جمع فيريونس كلا أنابيب التدرج معا كوحدة تخزين إجمالي 2.5 مل أو أقل. إذا كان يتم جمعها حجم أصغر، تعبئة للحصول على إجمالي 2.5 مل مع إعلان المخزن المؤقت (البديل ألف).
- تحميل مل 2.5 على العمود PD متوازن. تجاهل في التدفق من خلال.
- أضف 3 مل من إعلان المخزن المؤقت (البديل ألف) على العمود وجمع-التدفق عبر (التي تحتوي على فيريونس المنقي متجه).
- إضافة الجلسرين (333 ميليلتر) الحصول على تركيز نهائي لنسبة 10% وتقسم إلى مختبرين مناسبة (مثلاً 400 ميليلتر كل)، وتشتمل قاسمة 20 ميليلتر لتحديد عيار بقياس260 OD.
- مخزن الحل متجه في-80 درجة مئوية.
- تحديد عيار ناقل بقياس OD260 من 20 ميليلتر ناقلات الحل وميليلتر 79 ميلادي-المخزن المؤقت (البديل ألف) 1 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10% كما هو موضح في الخطوة 3.2.12. فارغة، استخدم ميليلتر 79 من الإعلان-المخزن المؤقت (البديل ألف)، 10 ميليلتر من والغليسيرول 10%، و 1 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10%.
- حساب عيار متجه ك: OD260 × معامل لتمييع x 1.1 x 109 ناقلات الجسيمات/ميليلتر.
كما أعد الخطوة 3.2.27، حساب: OD260 x 5 x 1.1 x 109 ناقلات الجسيمات/ميليلتر
4-تحقق اقتران بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة:
ملاحظة: إذا تم استخدام المركبات ذات الأوزان الجزيئية العالية بما فيه الكفاية لاقتران إلى فيريونس الإعلانية، اقتران يمكن التحقق من أن جل polyacrylamide التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة). ثم ينبغي أن يؤدي اقتران ناجحة في تحول من الفرقة البروتين المقابل للبروتين virion الإعلانية المعدلة، بالمقارنة مع البروتين في virion الإعلانية غير معدلة (انظر الشكل 4).
- وفقا لعيار المحسوبة لمكافحة ناقلات (الخطوة 3.2.28)، الفصل 1-2 ×10 10 ناقلات الجسيمات من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (8 في المائة).
- وضع الهلام تلطيخ فضة هلام39 للكشف عن عصابات البروتين حتى ضعيفة:
- تجهيز المخازن المؤقتة لتلطيخ الفضة (المبالغ اللازمة ل 100 مل من المخزن المؤقت هي بين قوسين):
- إعداد المخزن المؤقت 1 بخلط مل 38 من ddH2س، 50% ميوه (50 مل ميوه 100)، 12% أكوه (12 مل 100% AcOH)، و 0.0185% هتشو (50 ميليلتر من 37% هتشو).
- إعداد المخزن المؤقت 2 بإضافة 50% EtOH (50 مل 100% EtOH) إلى 50 مل ddH2o.
- إعداد المخزن المؤقت 3 بإضافة 0.127 غرام/لتر Na2ق2س3 (ملغ 12.744) إلى 100 مل من ddH2o.
- إعداد المخزن المؤقت 4 بإضافة 2 غرام/لتر إنيو3 (0.2 g) و 0.0185% هتشو (50 ميليلتر من 37% هتشو) إلى 100 مل من ddH2o.
- إعداد المخزن المؤقت 5 عن طريق إضافة 60 غرام/لتر (6 ز)، Na2CO3 0.0185% هتشو (50 ميليلتر من 37% هتشو)، و 2.5 مغ/لتر Na2ق2س3 (0.256 ملغ) إلى ddH2س للحصول على وحدة تخزين نهائي من 100 مل.
- إعداد المخزن المؤقت 6 بخلط مل 38 من ddH2س، 50% ميوه (50 مل 100% ميوه)، و 12% أكوه (12 مل 100% أكوه).
- إعداد المخزن المؤقت 7 بخلط 60 مل ddH2س، 30% ميوه (30 مل 100% ميوه)، ومادة الغليسيرين 10% (10 مل الغليسيرين 100%).
- إعداد المخزن المؤقت 8 بخلط الغليسيرين 10% (10 مل الغليسيرين 100 ٪) مع 90 مل ddH2o.
- تجهيز المخازن المؤقتة لتلطيخ الفضة (المبالغ اللازمة ل 100 مل من المخزن المؤقت هي بين قوسين):
- القيام بتلوين الفضة
- إصلاح الهلام في المخزن المؤقت 1 لمدة 30 دقيقة.
- أغسل الهلام في المخزن المؤقت 2 لمدة 15 دقيقة.
- بريتريات الهلام في المخزن المؤقت 3 ل 1 دقيقة.
- غسل الهلام 3 مرات في ddH2س ل 20 ثانية.
- تلقيح الهلام في المخزن المؤقت 4 لمدة 20 دقيقة.
- أغسل الهلام 2 مرات في ddH2س ل 20 ثانية.
- تطوير الهلام في المخزن المؤقت 5 حتى تكون الأشرطة المرئية (10 ثانية إلى 10 دقائق).
- أغسل الهلام 2 مرات في ddH2س ل 2 دقيقة.
- وقف التنمية في المخزن المؤقت 6 لمدة 5 دقائق.
- المحافظة على الجل في المخزن المؤقت 7 لمدة 20 دقيقة.
- تخزين الهلام في المخزن المؤقت 8.
ملاحظة: اقتران الكفاءة يمكن أن يتحدد بالتقدير الكمي دينسيتوميتريك لعصابات كابسوميري المستهدفة المعدلة وغير المعدلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 2 أمثلة على تأثير سيتوباثيك (CPE) في 293 الخلايا (HEK 293) الذي يشير إلى إنتاج ناقلات ناجحة. يجب أن تظهر الخلايا مورفولوجيا (الشكل 2) 40-48 ساعة بعد التطعيم مع ناقل الفيروس. تيميبوينت الصحيح للحصاد أمر حاسم لعدم فقدان جزيئات الفيروس عن طريق تحلل الخلية ومنع أكسدة المجموعات ثيول أدخلت وراثيا. إذا تم الإفراج عن الجسيمات متجه إلى المتوسطة التي تحلل الخلية، سوف تصبح تتأكسد ثيولس وراثيا أدخلت على الفور تقريبا، وسوف يصبح من الصعب على تنقية وتعديلها كيميائيا.
ويبين الشكل 3 المثالية CsCl العصابات. والغرض من النطاقات CsCl متقطع قبل التعديل الكيميائي لإزالة الحطام الخلوية من جزيئات الفيروس. يمكن أن تجري بعد ذلك التعديل نفسه في CsCl. النطاقات الثانية بعد التعديل الكيميائي يعمل على إزالة فائض moiety اقتران (الممتص). ملاحظة، تعديل ناجح للفيروس لا يمكن رؤيتها في التدرج ويحتاج إلى مزيد من التحليل الجزيئي، مثالي من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
ويبين الشكل 4 أمثلة نموذجية للتعديلات قفيصه ناجحة. معظم مويتيس بالإضافة إلى capsomeres محددة سوف يغير سلوك capsomeres كل منهما في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تشغيل. بالمقارنة المباشرة مع عنصر تحكم غير معدلة، يمكن التحقق من نجاح اقتران، وتحليل دينسيتوميتريك يمكن أن يساعد في تحديد عموما اقتران الكفاءة (% من نطاقات تحول و unshifted كابسوميري المعدلة).
رقم 1: تمكين التعديلات قفيصه الجينية والكيميائية مجتمعة من إتش متجه كابسيدس التساهمية مرفق التدريع البوليمرات واستهداف يغاندس. يتم إدخال المخلفات سيستين وراثيا في الحلقات قفيصه مختارة، ويتعرض المذيبات من إتش متجهة كابسيدس لتجهيز الجسيمات متجه بمفاعليه الكيميائية الجديدة. الناقلات يمكن أن تنتج باستخدام الخلايا المنتجة التقليدية والبروتوكولات. بعد الإنتاج، بقايا سيستين أدخلت وراثيا هي على وجه التحديد وتساهمي تعديل مع اقتران ثيول المتفاعلة مويتيس (يغاندس، التدريع البوليمرات، الكربوهيدرات، جزيئات صغيرة، والأصباغ الفلورية، إلخ.). لاقتران، يمكن استخدام مركبات ماليميدي المنشط (التي تشكل سندات ثيويثير مستقرة مع سطح الجسيمات متجه) أو مشتقات بيريديلديسولفيدي (التي تشكل جسور ثنائي كبريتيد بيوريسبونسيفي). بعد اقتران، يتم تنقية الناقلات ب CsCl متقطع النطاقات لإزالة اقتران فائض الممتص مويتيس. شماعة، البولي إثيلين غليكول (التدريع البوليمر)؛ L، يغاندس (المستمدة من مجموعة متنوعة واسعة من فئات مادة)؛ -ش، وظيفة ثيول من مخلفات سيستين أدخلت وراثيا. باستخدام هذه التكنولوجيا، عدد محدد من الجزيئات يمكن أن تساهمي بالإضافة إلى كابسيدس ناقل، وتحديد دقيق لموقع اقتران ممكناً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تأثير سيتوباثيك أثناء إنتاج النواقل. يمكن استخدام خلايا المنتجة التقليدية (هنا، الخلايا 293-HEK) لإنتاج ناقلات المعدلة وراثيا قبل تعديل المواد الكيميائية. ويشير إلى مظهر CPE تيميبوينت أفضل لحصاد الخلايا. (أ) الخلايا ساعتين بعد الإصابة، (ب) خلايا 24 ساعة بعد الإصابة، والخلايا (ج) 40 ساعة بعد الإصابة قبل الحصاد. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: نتائج مثالية للتدرجات CsCl. التدرجات CsCl قبل (أ، ب) وبعد التعديل (ج) المواد الكيميائية. (A) هي النطاقات متجه إتش قبل الانقطاع CsCl الكثافة الطرد المركزي التدرج. المرحلة العليا يظهر الأخضر منذ الموجه أظهرت كاسيت الدببة hCMV المروج يحركها التعبير عن اجفب. هي النطاقات virion متجه كعصابة واحدة، بيضاء في الثلث السفلي من الأنبوب. شريطين أصغر (أعلاه) تنبع من الجزيئات غير مكتملة، الذي ينبغي أن يتم جمع. (ب) الإعراب عن اجفب إعلانية سيستين الحاملة ناقل قبل تعديل المواد الكيميائية. (ج) مكافحة ناقلات نفسه بعد التعديل. سيتم جمع الفرقة في الثلث السفلي من الأنبوب وتنقيته من عمود ديسالتينج. علامة القلم في ب وج تسميات من الكثافة هما الحدود ويسمح بتحديد موقع الفرقة المتجهات التي سيتم جمعها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الملون سيفير الحزب الديمقراطي الصربي صفحة لتقييم كفاءة اقتران. علامة ميغاواط في حارة 1. ناقل مع سيستينيس أدخلت capsomeres بينتون حكم عليه إلى قاعدة، وتركت هيكسون غير معدلة (لين 2) أو تعديله مع تنشيط ماليميدي شماعة (البولي إيثيلين جليكول) مع وزن الجزيئي من كاتشين 5 (لين 3). هيكسون وبينتون حكم عليه إلى قاعدة المعرض تحول خلال صفحة الحزب الديمقراطي الصربي، مما يشير إلى نجاح تعديل > 90% من مونومرات في قفيصه. وتركت ناقل مع بقايا سيستين في هيكسون معدلة (لين 4)، وتعديل مع كاتشين 5 شماعة (ممر 5)، أو مع كاتشين 20 شماعة (لين 6). تجدر الإشارة إلى أن التحول الأكبر في الفرقة هيكسون يرجع الوزن الجزيئي أعلى من 20 كاتشين الوتد، بالمقارنة مع كاتشين 5 شماعة (لين 5). الهلام يوضح الدقة والكفاءة للاقتران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عادة كفاءة يمكن بواسطتها تعديل سيستينيس أدخلت وراثيا كيميائيا 80-99 في المائة، ومتغيرات معينة تؤثر على هذه الفعالية. أولاً، أنها بالغة من عدم خضوع سيستينيس وراثيا أدخلت أكسدة سابق لأوانه. رغم كونها محمية جيدا في البيئة مما يقلل من الخلايا المنتجة، وملزمة لتوفير بيئة غير مؤكسد بعد الإفراج عن ناقلات الجزيئات من الخلايا المنتجة وأثناء تعديل المواد الكيميائية. وتحقيقا لهذه الغاية، الحد من الكواشف يمكن استخدامه في تركيزات من 0.1-10 مم، ومن الضروري استخدام الكواشف تقليل لا تحتوي على مجموعات ثيول، الذي سيكون رد فعل سهولة مع مركبات ماليميدي المنشط. ثانيا، عند استخدام مركبات ماليميدي المنشط، الرقم الهيدروجيني أثناء رد فعل اقتران ينبغي أن لا تتجاوز 7.35، منذ الرقم الهيدروجيني من أكبر مما يمكن إنقاص 7.4 خصوصية رد فعل. ثالثا، ينبغي استخدام خالية من أمين المخازن المؤقتة (مثلاً، هيبيس، برنامج تلفزيوني) على أي حال، لرد الفعل. من المذكرة، يمكن تنقية الجزيئات ناقلات تحمل سيستين ب CsCl مزدوجة النطاقات كوصف، ثم المخزنة في الجلسرين HEPES/10% قبل تعديل المواد الكيميائية. في هذه الحالة، 0.1-1 مم تسيب ينبغي أن يستخدم كاشف الحد، أو يفضل، يجب تخزين الناقلات في جو من أرجون. يمكن استخدام الجرار بلاستيكية مملوءة الأرغون مع أغطية لهذا الغرض. بالإضافة إلى ذلك، تتأثر كفاءة التعديل القطر هيدرودينامية من المجمع بالإضافة إلى كابسيدس والموقع الذي يقترن. العديد من كابسوميريس التي يمكن أن تستخدم كأهداف لتعديل جنتي-كيميائية محددة موجودة في قفيصه أرتب (الألياف، هيكسون) أو بينتاميرس (بينتون حكم عليه إلى قاعدة). ولذلك، اعتماداً على موقع سيستين أدخلت وراثيا، قد تعوق جزيء moiety بالإضافة إلى مركب واحد ستيريكالي اقتران آخر جزيء لمركب المجاورة. وينبغي أن يعتبر هذا عند اختيار مواقع مثالية للتعديلات قفيصه جينيتي والكيميائية.
لتسهيل استكشاف الأخطاء وإصلاحها، قد تنشأ بعض المشاكل عند اتباع البروتوكول وصف. الموجه الأولى، وانخفاض الغلة (أدناه ناقل 10,000 جزيئات كل خلية منتج) ينتج من العدوى دون المستوى الأمثل من الخلايا المنتجة. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تستخدم موي 100-300 لعدوى الخلايا المنتجة. يرجى ملاحظة أن كل المبالغ ناقلات عالية جداً ومنخفضة جداً للعدوى توليد الغلة دون الحد الأمثل. ومثالي لمرور المنتج خلايا في اليوم قبل الإصابة. يمكن أن تظهر العصابات الثانية، ملطخ بالتدرجات CsCl. السبب الأكثر شيوعاً للحصول على مظهر ملطخ العصابات في التدرجات CsCl هو الرقم الهيدروجيني من الحلول CsCl هو حمضية جداً. الكاشف الحد تسيب حمضية جداً، ويجب الحرص على ضبط الأس الهيدروجيني قبل تحميل ناقلات على التدرج، حيث تتفكك ناقلات إتش سهولة في بيئة حامضية. اقتران الثالثة، وانخفاض الكفاءة (< 80% من اقتران) هي الأكثر شيوعاً نتيجة الاستعدادات ناقلات النجسة و/أو أكسدة سابق لأوانه لجماعات ثيول على سطح ناقلات. ويمكن الكشف عن الشوائب بصفحة الحزب الديمقراطي الصربي وتلطيخ الفضة. في حالة حدوث شوائب كبيرة، يجب إعادة تشغيل إنتاج ناقلات الأمراض. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون سبب اقتران منخفض الكفاءة الحرة غير متجه ثيولس في رد الفعل. ولذلك فإنه ينصح عدم استخدام ß-mercaptoethanol أو ديثيوثريتول كتخفيف الكواشف، لأن كلاهما يحتوي على جماعات ثيول مجاناً. من المذكرة، لتحديد مواقع مذيب للوصول إدخال المخلفات سيستين التي يمكن تعديلها سهولة، ينبغي أن تستخدم هياكل الكريستال؛ خلاف ذلك، سيستينيس قد لا يكون موجوداً للشريك اقتران. ويمكن تجنب أكسدة ثيولس على سطح ناقلات سابق لأوانه بصرامة استخدام الأرجون و/أو تسيب.
وأخيراً، حسابات المقايسة غير صحيحة يمكن أن يؤدي أيضا إلى اقتران منخفض الكفاءة. والمقصود المثال التالي توضيح الصيغة العامة الواردة أعلاه، وتسهيل العمليات الحسابية المقايسة. في المثال، يتم إدخال سيستين واحد في كابسوميري هيكسون. عيار الجسيمات متجه بعد CsCl أول خطوة تنقية التدرج يتحدد 1.5 ×10 10 ناقلات جزيئات كل ميليلتر، واقتران مجموعة، يستخدم مالبيج-750. يحتوي على كل ناقل قفيصه 720 هيكسون البروتينات (أرتب 240)، حيث عيار سيستينيس كل ميليلتر ولذلك المبالغ إلى 720 × 1.5 × 1010 = 1.08 × 1013 سيستينيس/ميليلتر. من أجل تعديل 1.5 مل جزيئات النواقل، مجموعة 1.62 × 10 يجب أن رد فعل سيستينيس16 مع مجموعة اقتران. للوصول إلى كفاءة اقتران، ينصح 50 x الزائدة المولى لاقتران مركب إلى إجمالي المخلفات سيستين: 1.62 × 1016 × 50 = 8.1 x 10 جزيئات17 من مالبيج-750 مطلوب لكفاءة الزوجين إلى 1.5 × 1016 سيستينيس من 1.5 مل حل المتجهات تنقيته بالتدرج CsCl الخطوة الأولى. مالبيج--750 يسلك وزن الجزيئي من 750 دا؛ ومن ثم، تزن 6.022 × 1023 جزيئات من مالبيج-750 750 غرام. ولذلك، لاقتران كفاءة من 1.62 × 1016 سيستين المخلفات في 1.5 مل من محلول ناقلات مع فائض 50 x مالبيج-750، 8.1 × 1017 جزيئات من مالبيج-750 = (750 x 8.1 × 1017)/(6,022 × 1023) = 1 × 10-3 g = 1 ملغ مالبيج-750 مطلوبة.
طريقة عرض يكمل وتجاوز أسلوب متجه بيجيليشن. ناقل التقليدية، وموجهة من أمين بيجيلاتيون لا يسمح بالمرفقات الخاصة بالموقع لحجب أو استهداف مويتيس، بينما يمكن استخدام التكنولوجيا اقتران جينيتي والكيميائية المقدمة هنا للتحديد إرفاق مويتيس ناقلات إتش السطوح في مواقف محددة وفي نسخة محددة بالأرقام. لذلك، ومناسبة لكل التدريع واستهداف جزيئات النواقل إتش.
ملاحظة، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول بيجيلاتيون توجه أمين تقليدية من ناقلات الإعلانية المذكورة أعلاه. وفي هذه الحالة، يمكن إهماله الكاشف الحد تسيب من المخازن المؤقتة. لحسابات المقايسة، يمكن اعتبار عدد المجموعات أمين موجوداً للجسيمات التي تكون 18,000، وتجاوزات المولى نموذجية لاقتران أمين المتفاعلة مويتيس إضعاف 20-100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
References
- Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).
- Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
- Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, New York, N.Y. 570-573 (1953).
- van Oostrum, J., Burnett, R. M. Molecular composition of the adenovirus type 2 virion. Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).
- Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).
- Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell. 67, 145-154 (1991).
- Meier, O., et al. Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake. Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Qiu, Q., et al. Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors. Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).
- Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice. Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).
- Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver. Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).
- Schiedner, G., et al. A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells. Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).
- Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement. Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).
- Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors. Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).
- Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction. Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).
- Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands. Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).
- Ganesan, L. P., et al. Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium. PLoS Pathogen. 7, e1002281 (2011).
- Cichon, G., et al. Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note. Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).
- Carlisle, R. C., et al. Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1. Blood. 113, 1909-1918 (2009).
- Waddington, S. N., et al. Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer. Cell. 132, 397-409 (2008).
- Kalyuzhniy, O., et al. Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).
- Vigant, F., et al. Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).
- Jonsson, M. I., et al. Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells. Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).
- Bradshaw, A. C., et al. Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X. PLoS Pathogen. 6, e1001142 (2010).
- Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes. Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Prill, J. -M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Zaiss, A. K., et al. Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo. Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).
- Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. The uses and properties of PEG-linked proteins. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).
- Parveen, S., Sahoo, S. K. Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs. Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).
- O'Riordan, C. R., et al. PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).
- Subr, V., et al. Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components. Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).
- Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).
- Corjon, S., et al. Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).
- Prill, J. -M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Krutzke, L., et al. Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity. Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).
- Prill, J. -M., et al. Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo. PloS One. 9, e82716 (2014).
- Kratzer, R. F., Kreppel, F. Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 377-388 (2017).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).
