Summary
El protocolo aquí descrito permite a los investigadores modificar específicamente cápsida de adenovirus en sitios seleccionados por simple química. Blindado adenovirus vectores partículas pueden generarse vectores de transferencia génica versión y vector host interacciones pueden ser estudiadas.
Abstract
Vectores de adenovirus son herramientas potentes para genética vacuna y oncolíticos viroterapia. Sin embargo, son propensos a múltiples interacciones host vectores indeseados, especialmente después de la entrega en vivo . Es un consenso que las limitaciones impuestas por las interacciones indeseadas vector-host sólo pueden superarse si se realizan modificaciones definidas de la superficie del vector. Estas modificaciones incluyen protección de las partículas de las interacciones no deseadas y dirigidas a la introducción de nuevos ligandos. El objetivo del protocolo presentado aquí es que el lector generar blindado y, si lo desea, reorientarse vectores de transferencia génica humana adenovirus o virus oncolíticos. El protocolo permitirá a los investigadores modificar la superficie de la cápsida de vector de adenovirus por fijación química específica de polímeros sintéticos, carbohidratos, lípidos y otras moléculas biológicas o químicas. Describe la tecnología de vanguardia de modificaciones de la cápside genética y química combinada, que se han demostrado para facilitar la comprensión y superación de barreras para la entrega en vivo de los vectores de adenovirus. Se proporciona una descripción detallada y comentada de los pasos cruciales para llevar a cabo las reacciones químicas específicas con virus biológicamente activos o vectores derivados de virus. La tecnología descrita en el protocolo se basa en la introducción genética de cisteína (naturalmente ausente) residuos en lazos expuestos al solvente de vectores derivados de adenovirus. Estos residuos de cisteína proporcionan una reactividad química específica que puede, después de la producción de los vectores a altos títulos, ser explotada para el acoplamiento químico covalente altamente específico y eficiente de moléculas de una amplia variedad de clases de la sustancia al vector partículas. Lo importante, este protocolo se puede adaptar fácilmente para llevar a cabo una amplia variedad de diferentes modificaciones químicas (no basado en tiol) de cápsida de vector de adenovirus. Por último, es probable vectores de transferencia del gene de basada en virus no-envueltos que adenovirus pueden ser modificado de la base de este protocolo.
Introduction
Adenovirus (Ad), miembros de la familia Adenoviridae, son virus no-envueltos de ADN de los tipos más de 70 hasta ahora han sido identificados (http://hadvwg.gmu.edu). Según hemaglutination propiedades, estructura del genoma y resultados de la secuenciación, los tipos de 70 D.c. pueden dividirse en siete especies (adenovirus humano A G)1,2. El genoma humano de Ad es de 38 kb en tamaño y encapsulado por una nucleocápside icosaédrica3. Debido a su abundancia, el capsid proteína hexon, base del penton y fibra se todos conocen como proteínas de la cápsida principales. El más abundante y más grande capsid proteína hexon forma 20 facetas de cápside, cada uno con 12 del hexon homotrimers4,5. Penton, situado en cada borde icosaédrica (vértice), consiste en pentámeros de una base del penton y representa la base para el punto de vértice que está construido de fibra de glicosilada trimers5,6. La entrada de células nativa de Ad se compone básicamente de dos pasos principales. En primer lugar, la perilla de la fibra se une al receptor primario. Tipos de anuncios de las especies A, C, E y F, es el receptor coxsackie y adenovirus (coche). Esta interacción trae el virión en proximidad espacial de la superficie celular, facilitando así las interacciones entre las integrinas celulares y RGD motivo en la base del penton y consecuentemente inducir respuestas celulares. En segundo lugar, cambios en el citoesqueleto de llevan a la internalización del virión y transporte al endosome7. Sobre desmontaje parcial en el endosome, el virión se libera al citoplasma y en última instancia viaja al núcleo para la replicación.
Mientras que el anuncio puede entregarse localmente (ej., para la vacunación genética), entrega sistémica por el torrente sanguíneo como para onco-viroterapia enfrenta a varios obstáculos. Mientras circulan en el torrente sanguíneo, viriones inyectados encontrarán el sistema de defensa del sistema inmunitario del hospedador hacia la neutralización rápida de los vectores basados en virus y representación vectores basados en Ad extremadamente ineficiente en aplicaciones sistémicas. Además, la natural hepatotropismo de Ad interfiere con entrega sistémica y debe resolverse en redirigir anuncio sus nuevas células blanco.
Codificado del germline natural IgM anticuerpos del sistema inmune innato rápidamente reconocen y enlazar las estructuras altamente repetitivas en la superficie del virión8,9. Estos complejos inmunes luego activan las vías clásicas y no clásica del sistema del complemento, conduciendo a neutralización rápida mediada por el complemento de una gran parte de los viriones8. Una segunda vía dando lugar a mayor eliminación de virions Ad es mediada por macrófagos10 y asociada con aguda tóxica y hemodinámicos efectos secundarios11,12. En el caso de anuncio en particular, Kupffer células residentes en el hígado se unen a y phagocytically toman el anuncio viriones a través de limpiador específico receptores de tal modo eliminándolos de la sangre13,14,15 . También se han identificado receptores scavenger específicos en las células endoteliales sinusoidales hígado (células LSE)16, y LSE células también parecen contribuir al vector eliminación17, sino en qué medida necesita aclaración. Además, algunos tipos de anuncios y sus vectores derivadas son eficientemente secuestrados por eritrocitos humanos18 al que se unen mediante coche o el receptor del complemento CR119. De nota, este mecanismo de secuestro no puede ser estudiado en el sistema de modelo de ratón como en contraste con los eritrocitos humanos, eritrocitos de ratón no expresan el coche.
Anticuerpos específicos anti-anuncios generados por el sistema inmune adaptativo después de la exposición al anuncio debido a infecciones anteriores con Ad o después de la primera entrega en aplicaciones sistémicas levantar una barrera adicional al uso eficaz de los vectores de Ad, y deben ser evadidos en entrega sistémica eficiente.
Por último, el fuerte hepatotropismo de algunos tipos de anuncios (incluyendo Ad5) seriamente dificulta la aplicación de Ad en la terapia sistémica. Este tropismo resultando en la transducción de hepatocitos es debido a la alta afinidad del virión Ad para el factor de la coagulación de sangre X (FX), mediada por la interacción de la FX con el anuncio del hexon proteína20,21,22. FX puentes el virión a glicanos de sulfato de heparina (HSPGs) en la superficie de hepatocitos20,23,24,25. Un factor crucial para esta interacción parece ser la medida específica de N - y O-sulfatación de HSPGs en24de las células del hígado, que es distinto de HSPGs en otros tipos celulares. Además de esta vía mediada por FX, estudios recientes sugieren otras vías aún no identificaron que resultan en la transducción de anuncio de hepatocitos26,27,28.
Recientemente, se ha demostrado que FX no sólo participa en la transducción de hepatocitos de Ad, pero también por enlace, el virión protege la partícula de virus contra la neutralización por el sistema de complemento26. Reducción de transducción del hepatocito por prevención de atascamiento de FX, por lo tanto, crearía el efecto secundario indeseado de aumentar Ad neutralización por el sistema inmune innato.
Un conocimiento profundo de las complejas interacciones entre los vectores y los organismos de acogida por lo tanto es necesario desarrollar vectores más eficientes para aplicaciones sistémicas que eluden las trabas impuestas por el organismo del anfitrión.
Una estrategia que ha utilizado originalmente para proteínas terapéuticas ha sido adaptada para vectores de anuncio por lo menos parcialmente superar las barreras descritas arriba. Antigenicidad y la inmunogenicidad de la proteína terapéutica compuestos podrían reducirse por acoplamiento al polietilenglicol (PEG)29,30. Por lo tanto, el acoplamiento covalente de polímeros tales como PEG o poli [N-(2-hidroxipropil) methacrylamid] (pHPMA) a la cápside superficie protege el vector de las interacciones host vector no deseados. Comúnmente, acoplamiento de polímero está dirigido a grupos ε-amino de residuos de lado de lisina que se distribuyen al azar en la superficie de la cápside. Las partículas vectoriales en la solución, debido a la naturaleza hidrofílica de los polímeros adjuntos, rodeadas de una concha de agua estable que reduce el riesgo de reconocimiento de células inmunitarias o degradación enzimática. Por otra parte, vectores pegilado Ad fueron demostrados para evadir la neutralización por anticuerpos anti hexon en vitro y en ratones previamente inmunizados en vivo31. En contraste con modificaciones genéticas de la cápside, acoplamiento químico de polímeros se realiza después de la producción y purificación, lo que permite no sólo para el uso de células productora convencional y la producción de las poblaciones de vectores de alto título, sino también para simultánea modificación de miles de aminoácidos en la superficie de la cápside. Sin embargo, dirigido por amina blindaje se produce al azar a lo largo de la superficie de la cápside entero, dando por resultado alta heterogeneidades y no permitiendo modificación de capsómeros específicos. Además, las moléculas de polímero grande para efectos beneficiosos afectan virus bioactividad32.
Para superar estas limitaciones, Kreppel et al. 33 introdujo un concepto de geneti-química de vectores re - y la focalización. Cisteínas genéticamente fueron introducidos en la cápside del virus en las posiciones expuestas al solvente como fibra HI-lazo33, proteína IX34y del hexon35,36. Aunque pueden producir vectores de Ad no natural, rodamiento de cisteína en altos títulos en las células normales del productor. Lo importante, inserción de cisteínas en algunos capsómeros y en distintas posiciones dentro de un capsómero solo permite modificaciones muy específicas de moléculas reactivas con el grupo tiol. Este enfoque geneti-química se ha demostrado para superar numerosos obstáculos en el diseño vectorial. La combinación de la pegilación base de aminas para desapuntar y acoplamiento tiol-basado de la transferrina a la perilla de fibra que HI-lazo ha sido probado con éxito Demons modificación vectores anuncio coche deficientes las células33. Dado que hexon participa en interacciones más indeseadas (neutralización de anticuerpos, factor de coagulación de sangre FX), estrategias de modificación de tiol-basado también se aplicaron a hexon. Acoplamiento de pequeñas moléculas de PEG al HVR5 del hexon prevenir partículas de vector Ad para transducir las células SKOV-3 en presencia de FX, mientras que grandes partes de PEG aumentaron hepatocito transducción14,35. Partículas de vector ad llevar mutaciones en la perilla de fibra inhibe la Unión del coche y el HVR7 inhibe Unión de FX (cisteínas rodamiento insertado en HVR1 para posición específica la pegilación) fueron demostradas para evadir la neutralización mediada por anticuerpos y complemento, así como scavenger receptor-medió la absorción sin pérdida de infectividad. Curiosamente, a pesar de la falta del escudo natural de FX, la pegilación nuevamente mejorado transducción de hepatocitos como una función de PEG tamaño36. Sin embargo, fue demostrado que blindar covalentes tienen un impacto en los procesos de tráfico intracelulares. Mero et al. en comparación con irreversible frente a escudos de bioresponsive basado en pHPMA y demostró que ni el modo de carga de protección ni de copolímero tuvo un impacto en la entrada de la célula pero afectó tráfico de partículas en el núcleo. Empleo de un escudo bioresponsive con carga positiva pHPMA copolímeros permitidos para el tráfico de partículas en el núcleo, manteniendo la eficiencia de transducción alta de anuncio vectores in vitro e in vivo37.
En Resumen, estos datos indican que, incluso bajo el supuesto de que todo vector-host-interacciones fueron conocidas y consideradas, cápside excesiva superficie modificaciones son necesarias para superar los obstáculos asociados con la entrega sistémica de vector.
Aquí proporcionamos un protocolo para realizar modificaciones químicas específicas de cápsida de vector de adenovirus para blindar o retargeting de partículas de vector de adenovirus y virus basados en adenovirus oncolíticos. El concepto de esta tecnología se describe en la figura 1. Permite la protección de ciertas regiones de la cápside de interacciones no deseadas por el accesorio covalente de polímeros sintéticos. Al mismo, también proporciona un medio para fijar ligandos y combinar protección y orientación. Usando la simple química, experimentadores podrá modificar covalentemente superficie de vectores de adenovirus con una gran variedad de moléculas incluyendo péptidos/proteínas, carbohidratos, lípidos y otras moléculas pequeñas. Además, el protocolo proporciona un concepto general para la modificación química de vectores derivados de virus biológicamente activos en el mantenimiento de su integridad biológica y la actividad.
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Protocol
Nota: en el siguiente, un protocolo para geneti-química pegilación de un anuncio de vector se describe al detalle. Para permitir el acoplamiento específico de la molécula de PEG, un vector de Ad5 previamente fue genéticamente modificado mediante la introducción de un residuo de cisteína en la proteína del hexon en el bucle de hipervariables 5 como se describe en una anterior publicación36y una PEG de maleimida-activado compuesto se utiliza como compuesto de acoplamiento.
1. preparación de tampones para la purificación del Vector por gradientes de CsCL paso
- Preparar 400 mL de tampón de Adenovirus (Ad-buffer) agregando 50 mM HEPES (4,76 g/400 mL) y 150 mM NaCl (3,504 g/400 mL) agua destilada doble (ddH2O). 350 mL de esta solución se necesita para preparar las siguientes tres variantes Ad-buffer.
- Variante A: ajuste 150 mL de Ad-buffer a pH 7,6 con NaOH.
- Variante B: agregar una concentración final de 10 mM TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0,143 g] a 50 mL y ajustar pH a 7.2 con HCl.
- Variante C: agregar una concentración final de 0,5 mM TCEP (0,022 g) a 150 mL y ajustar pH a 7.2 con HCl.
- Preparar los buffers en ddH2O y productos químicos de grado analítico. Utilizar 100 mL de variante A y la variante C para preparar los buffers de CsCl (ver pasos 1.2 y 1.3; 50 mL de cada uno) para los gradientes de CsCl paso (ver pasos 3.2.6. y 3.2.18).
- Preparar el tampón gradiente de CsCl paso (ρCsCl = 1,41 g/cm3) en Ad-buffer
Nota: Se necesitará este buffer en dos variantes:- Pesan dos alícuotas de exactamente 27,42 g de CsCl en tubos de 50 mL.
- ΡCsCl = buffer de 1,41/TCEP: resolver CsCl en 40 mL de la variante C del tampón de Ad.
- ΡCsCl = buffer 1.41: resolver CsCl en 40 mL de la variante A de Ad-buffer.
- Comprobar y si es necesario, ajustar el pH con HCl. llenado hasta exactamente 50 mL con la variante Ad-buffer correspondiente. Para lograr los mejores resultados de separación, la concentración exacta de CsCl y pH son cruciales.
- Comprobar la densidad (contenido de CsCl) pesando 1 mL (1,41 g) de cada búfer de gradiente.
- Preparar el tampón gradiente de CsCl paso (ρCsCl = 1,27 g/cm3) en Ad-buffer
Nota: Este buffer es necesario en dos variantes:- Pesan dos alícuotas de exactamente 18,46 g de CsCl en tubos de 50 mL.
- ΡCsCl = buffer 1,27/TCEP: resolver CsCl en 40 mL de la variante C del tampón de Ad.
- ΡCsCl = buffer 1,27: resolver CsCl en 40 mL de la variante A de Ad-buffer.
- Echale un vistazo y si es necesario, ajustar el pH con HCl. Por último, llene hasta exactamente 50 mL con la variante Ad-buffer correspondiente. Para lograr los mejores resultados de separación, la concentración exacta de CsCl y pH son cruciales.
- Comprobar la densidad (contenido de CsCl) pesando 1 mL (1,27 g) de cada búfer de gradiente.
- Esterilizar todas las memorias intermedias (buffers de Ad y buffers gradiente de CsCl paso) por filtración (con tamaño de poro de 0.45 μm de malla) en botellas estériles.
- Después de la esterilización, para evitar la oxidación de TCEP, saturar y superponer los buffers que contengan TCEP con argón por aspersión los amortiguadores con gas argón para cerca de 30 s. Tenga cuidado de utilizar sólo dispositivos estériles (e.g., estériles pipeta consejos) al aplicar el gas argón y uso botellas lo suficientemente grandes como para permitir que la grasa de argón.
Nota: Todas las memorias intermedias debe ser preparadas fresco y protegido de la luz y pueden almacenarse a 4 ° C por varios días (especialmente los CsCl paso gradiente buffers que deben conservarse sólo durante unos pocos días).
2. acoplamiento fracciones: Almacenamiento y preparación
Nota: Moeities utilizados para el acoplamiento a cisteínas necesitan tener grupos reactivos de tioles. Compuestos activados maleimida formarán thioether estable vínculos con las cisteínas genéticamente introducidas. Por otra parte, ortho-pyridyldisulfide (OPS)-también pueden utilizarse compuestos activados, que forman puentes disulfuro de bioresponsive entre las partículas de vector y la molécula de acoplamiento. MalPEG liofilizada-750, así como la mayoría otros reactivos de acoplamiento son sensibles a la hidrólisis y deben guardarse secas en forma de polvo liofilizado a-80 ° C.
- Para evitar la acumulación de condensación de agua a la descongelación de los frascos, almacenar los viales en tubos más grandes (ej., tubos de 50 mL) con un colchón de perlas de gel de sílice. Guarde estos tubos en un contenedor más grande adecuado llenado también con un amortiguador de talón de gel de silicona.
- Antes de cerrar bien cada tubo y recipiente, intercambio de aire con gas argón. Esto puede lograrse mediante la colocación de los tubos abiertos y contenedores en un desecador, seguido de quitar y reemplazar el aire con gas argón. Puesto que el gas argón es más pesado que el aire, tubos y envases se llenan con gas argón y ahora pueden colocarse en uno a, con cada tapa firmemente cerrada.
- Almacenar contenedores a-80 ° C.
- Cuando descongelar, colocar los envases en los granos de sílice en un desecador y lentamente calentarlas hasta la temperatura ambiente, luego abrir el envase.
- Cuando se realiza una reacción de acoplamiento, recién resolver la cantidad de sustrato necesario en el disolvente apropiado de acoplamiento. Tenga cuidado de no para añadir más del 10% de solución de acoplamiento a la reacción final del acoplamiento, sobre todo si DMF o DMSO se utiliza como disolvente para el substrato de acoplamiento.
3. amplificación, purificación y modificación química de vectores de Ad:
- Amplificación de vectores de Ad
Nota: Los siguientes pasos deben realizarse utilizando un gabinete de seguridad según las normas de seguridad biológica local.- Transfectar un vector de Ad replication ∆E1 deficiente que contiene uno (o varios) residue(s) cisteína genéticamente introducidas en las células de HEK 293 descrito por Kratzer y Kreppel38.
- Según el protocolo38, ampliar el vector secuenciales reinfecciones hasta una infección preparativa final de 15-20 placas de cultura de célula de grande (15 cm) (aproximadamente 1-2 x 107 células/placa).
Nota: Óptimo, la reinfección pasada debe ser programada para que las células muestran efecto completo citopático (CPE) en la mañana de purificación y modificación (ver figura 2). - Después del paso final de amplificación, las células suspendidas en tampón Ad + 10 mM TCEP (variante B) se pueden congelar a-80 ° C; sin embargo, para el rendimiento óptimo de las partículas del vector, se recomienda un seguimiento inmediato de la célula lysis y vector de purificación y modificación.
- Modificación química y purificación de los vectores de la Ad
Nota: Purificación de vectores se realiza según el protocolo de purificación de adenovirus que se describe en38pero en condiciones no oxidantes. Cosecha y lisis de la célula como vector modificación química y purificación puede realizarse dentro de un día. Cosecha y lisar las células infectadas según el protocolo descrito previamente38.- Recoger las células por raspado de las placas y transferir el sobrenadante a tubos de centrifugación de 200-500 mL.
- Girar la solución celular por 10 min a 400 x g.
- Resuspender el precipitado de células en 4 mL de tampón de Ad + 10 mM TCEP (pH 7.2) (variante B) y transfiéralo a un tubo estéril 50 mL. Si la producción de células es baja o sólo un débil CPE fue inducido, resuspender en 2 mL.
- Rescatar el vector por 3 ciclos de congelación (en nitrógeno líquido) y descongelación (en un baño de agua de 37 ° C).
- Centrifugado por 10 min a 5.000 x g a 4 ° C.
- Al mismo tiempo de centrifugación, preparar dos gradientes de paso de CsCl igual:
- En primer lugar, la fase inferior, añadir 3 mL de 1,41 g/cm3 ρCsCl en Ad-buffer + 0,5 mM TCEP (pH 7.2, variante C) en los tubos de la ultracentrífuga. Marque el nivel de la fase inferior en el tubo antes de cargar la fase superior.
- Apile cuidadosamente la fase superior de 5 mL de 1,27 g/cm3 ρCsCl en Ad-buffer + 0,5 mM TCEP (pH 7.2, variante C) transfiriendo lentamente el volumen de 5 mL a lo largo de las paredes del tubo en la fase inferior.
Nota: Desde durante el acoplamiento una alta concentración de TCEP podría reaccionar con el residuo de maleimida de malPEG-750 y conducen a la eficiencia de acoplamiento reducido, purificación por gradiente de paso debe realizarse ya en una disminución de la concentración TCEP CsCl.
- Cargar el sobrenadante en el gradiente de CsCl [ya sea igualmente dividir el sobrenadante sobre ambos gradientes o, en el caso de un rendimiento bajo del vector (véase arriba), el sobrenadante en solamente una columna de carga] y ambos gradientes igualmente a la parte superior con buffer Ad + 10 mM TCEP (pH 7 .2, variante B).
- Ajuste el peso de los tubos frente a una diferencia de peso 0.0 g.
- Ultracentrífuga durante 2 h a 176.000 x g a 4 ° C.
- Con una pinza, fije el tubo de la ultracentrifugación en un soporte, dejando el área alrededor de la marca de nivel inferior de fase accesibles. Coloque la lámpara cuello de cisne por encima del tubo. Alrededor de la marca, en la frontera entre las fases superiores e inferiores, una banda distinta (los viriones vector) debe ser visible (Figura 3A-3 C).
- Recoge los vectores de perforar el tubo con una aguja y aspirando la banda del vector en una jeringa. Transferencia de viriones vector recoge en un tubo de 15 mL.
Nota: Bandas más débiles por encima de la banda de vector Ad contienen partículas vectoriales incompleta y deben evitarse para la aspiración. El restos de células y la proteína fluorescente (EGFP) de Ad-vectores de expresión de EGFP se acumula en la parte superior de la ultracentrífuga verde tubo (ver Figura 3A y 3B). Este y los siguientes pasos hasta acoplamiento (paso 3.2.16) deben realizarse con rapidez, como los vectores ahora son sensibles a disulfuro debido a la baja concentración de TCEP la vinculación. - Para calcular la cantidad de sustrato de acoplamiento necesario para la eficiente completo atascamiento del substrato a todos los residuos de cisteína en la preparación de vectores, medir OD260:
- Según el protocolo descrito por Kratzer y Kreppel38, vortex una mezcla de 10 μl de los viriones de vector recogidos, 89 μl de tampón de Ad y 1 μl de SDS 10%. Como una punta de prueba en blanco, vórtice 99 μl de tampón de Ad y 1 μl de SDS 10%.
- Para desnaturalizar los viriones, incubar ambos a 56 ° C durante 10 minutos.
- Determinar el OD260.
- Calcular la concentración de vector físico por μl utilizando la siguiente ecuación: OD260 x Factor de dilución x coeficiente de extinción empíricamente determinado de Ad (1.1 x 10 partículas de vector9 = 1 OD260 unidad/μL). Por lo tanto, una medición de OD260 de 1.36 de un vector diluido 1:10, calcular para: 1.36 x 10 x 1.1 x 109 = aproximadamente 1.5 x 1010 vector partículas/μl.
Nota: Este título es sólo una estimación áspera; sin embargo, es suficientemente exacto para los cálculos estequiométricos indicados en los siguientes.
- Dependiendo de la proteína modificada por la introducción de una cisteína, determinar la cantidad de sustrato de acoplamiento (en gramos) de una reacción de acoplamiento eficiente, según la siguiente ecuación general: título de Virus x volumen x número de cisteínas x exceso de parte de x Molecular de peso de la molécula / 6.022 x 1023 = gramos de sustrato de acoplamiento.
Nota: en esta ecuación: título 1) virus es el título/μl, determinado por OD260 como se describió anteriormente, las cuentas 2) volumen para el volumen en μl de aspiraba vector utilizado en la reacción de acoplamiento, 3) el número de cisteínas es el número de proteínas en el cual la cisteína residuo fue introducido por la partícula vectorial, 4) exceso de la molécula es el factor de necesario exceso parte para una reacción de acoplamiento eficiente (50 x) y 5) el peso molecular de la molécula debe ser introducido como Da (no kDa). - Recién resolver la cantidad de compuesto (o factible) necesario en el disolvente apropiado.
Nota: La cantidad de sustrato de acoplamiento necesitada es baja y difícil de pesar pero caro, pesar la cantidad mínima posible compuesto y disolverlo en una concentración adecuada para su aplicación a la reacción de acoplamiento. - Transferir la solución del vector a un tubo de tamaño adecuado (por ejemplo, tubo de 2 mL) y añada la cantidad calculada de acoplamiento compuesto solución al vector.
- Mezclar suavemente la solución por la rotación arriba por 1 h a temperatura ambiente.
- Llenar la solución del vector al volumen total de 6 mL con Ad-buffer (pH 7.6, variante A).
Nota: Este paso debe realizarse antes de que la solución se aplica al gradiente de paso para asegurar que la solución del vector, que todavía contiene CsCl del primer gradiente de paso, tiene una densidad por debajo de 1,27 g/mL. - En un segundo paso bandas de CsCl, purificar el vector de la molécula de acoplamiento sin reaccionar:
- Preparar dos gradientes de paso de CsCl igual realizando los pasos siguientes para cada uno: fase 1) inferior: 3 mL de 1,41 g/cm3 ρCsCl en Ad-buffer (pH 7.6, variante A), 2) marca nivel de la fase inferior en el tubo antes de carga superior y fase 3) superior : 5 mL de 1,27 g/cm3 ρCsCl en Ad-buffer (pH 7.6, variante A).
Nota: Después de acoplamiento, tampones sin TCEP se utilizan, como no hay grupos de tiol libre ahora deben estar presentes en la cápsida de vector. - Cargar el sobrenadante en el gradiente de CsCl y rellenar ambos gradientes igualmente a la parte superior con Ad-buffer (pH 7.6, variante A).
- Ajustar los pesos de los tubos frente a una diferencia de peso 0.0 g.
- Preparar dos gradientes de paso de CsCl igual realizando los pasos siguientes para cada uno: fase 1) inferior: 3 mL de 1,41 g/cm3 ρCsCl en Ad-buffer (pH 7.6, variante A), 2) marca nivel de la fase inferior en el tubo antes de carga superior y fase 3) superior : 5 mL de 1,27 g/cm3 ρCsCl en Ad-buffer (pH 7.6, variante A).
- Ultracentrífuga durante 2 h a 176.000 x g a 4 ° C.
- Poco antes del final de ultracentrifugación, equilibrar una columna PD-10 5 veces con 5 mL de Ad-buffer (pH 7.6, variante A).
- Como hecho en el paso 3.2.10, conecte el tubo de ultracentrifugación a dejar el área alrededor de la marca de nivel inferior de fase accesibles. Coloque la lámpara cuello de cisne por encima del tubo. Otra vez, alrededor de la frontera entre las fases superiores e inferiores, una banda distinta (los viriones vector) debe ser visible (figura 3).
- Recoge los vectores de perforar el tubo con una aguja y aspirando la banda del vector en una jeringa y el vector de transferencia a un tubo de 15 mL. Tenga cuidado de recoger los viriones de ambos tubos degradados como un volumen total de 2,5 mL o menos. Si se recoge un volumen menor, llenar para obtener un volumen total de 2,5 mL con tampón de Ad (variante A).
- 2.5 mL en el PD-columna equilibrada de carga. Deseche el flujo a través.
- Añadir 3 mL de tampón de Ad (variante A) a la columna y recoger el flujo a través (contiene los viriones purificados vector).
- Agregar glicerol (333 μL) para obtener una concentración final de 10% y dividir en partes alícuotas adecuadas (por ejemplo, 400 μL cada una) e incluir una alícuota de 20 μl para la determinación del título por la medida de260 OD.
- Almacenar la solución de vector a-80 ° C.
- Determinar el título del vector mediante la medición de OD260 20 μl vector solución de 79 μl de tampón de Ad (variante A), y 1 μl de SDS 10% tal como se describe en el paso 3.2.12. Como un espacio de uso 79 μl de tampón Ad (variante A), 10 μl de glicerol al 10% y 1 μl de SDS 10%.
- Calcular la concentración de vectores como: OD260 x Factor de dilución x 1.1 x 109 vector partículas/μl.
Como preparado en el paso 3.2.27, calcular: OD260 x 5 x 1.1 x 109 vector partículas/μl
4. verificación del acoplamiento por SDS-PAGE:
Nota: Si se usan compuestos con pesos moleculares suficientemente altas para el acoplamiento a viriones Ad, acoplamiento puede verificarse por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Acoplamiento exitoso entonces debería resultar en un cambio de la banda de proteína correspondiente a la proteína de virión anuncio modificada, en comparación con la proteína en el virión de Ad sin modificar (ver figura 4).
- Según la concentración calculada de vector (paso 3.2.28), independiente 1-2 x 1010 partículas de vector por SDS-PAGE (8%).
- Desarrollar el gel por tinción de plata de gel39 para detectar bandas de proteínas aún débil:
- Preparación de buffers para la tinción de plata (las cantidades para 100 mL de buffer se indicaron entre corchetes):
- Preparación de buffer 1 mezclando 38 mL de ddH2O, 50% MeOH (50 mL de MeOH 100), 12% AcOH (12 mL de 100% AcOH) y % 0.0185 HCHO (50 μl de 37% HCHO).
- Preparar el tampón 2 agregando 50% EtOH (50 mL de 100% EtOH) a 50 mL de ddH2O.
- Preparar buffer 3 agregando 0,127 g/L Na2S2O3 (12,744 mg) en 100 mL de ddH2O.
- Preparación de buffer 4 añadiendo 2 g/L AgNO3 (0.2 g) y % de 0.0185 HCHO (50 μl de 37% HCHO) a 100 mL de ddH2O.
- Preparación de buffer 5 añadiendo 60 g/L Na2CO3 (6 g), % 0.0185 HCHO (50 μl de 37% HCHO) y 2,5 mg/L de Na2S2O3 (mg 0,256) a ddH2O para obtener un volumen final de 100 mL.
- Preparación de buffer 6 mezclando 38 mL de ddH2O, 50% MeOH (50 mL de 100% MeOH) y 12% AcOH (12 mL de 100% AcOH).
- Preparar el tampón 7 al mezclar 60 mL de ddH2O, 30% MeOH (30 mL 100% MeOH) y 10% glicerina (10 mL de glicerina 100%).
- Preparación de buffer 8 mezclando glicerina 10% (10 mL de glicerina 100%) con 90 mL de ddH2O.
- Preparación de buffers para la tinción de plata (las cantidades para 100 mL de buffer se indicaron entre corchetes):
- Realizar tinción de plata
- Fije el gel en tampón 1 durante 30 minutos.
- Lavar el gel en tampón 2 durante 15 minutos.
- Use el gel en tampón 3 durante 1 minuto.
- Lavar el gel 3 veces en ddH2O 20 s.
- Impregnar el gel en buffer 4 durante 20 minutos.
- Lavar el gel 2 veces en ddH2O 20 s.
- Desarrollar el gel en buffer 5 hasta que las bandas son visibles (10 s a 10 min).
- Lavar el gel 2 veces en el ddH2O 2 minutos.
- Detener el desarrollo en tampón 6 durante 5 minutos.
- Conservar el gel en tampón 7 durante 20 minutos.
- Guarde el gel en búfer 8.
Nota: Eficiencia de acoplamiento puede determinarse por la cuantificación densitométrica de las bandas modificadas y no modificadas de la capsomere dirigida.
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Representative Results
La figura 2 muestra ejemplos del efecto citopático (CPE) en 293 células (HEK 293) que indica la producción de vectores de éxito. Las células deben presentar morfología (figura 2) 40-48 horas después de la inoculación con el vector de virus. El punto adecuado para la cosecha es crucial para no perder las partículas del virus por lisis celular y previniendo la oxidación de los grupos tiol genéticamente introducidas. Si partículas vectoriales son liberadas al medio por lisis celular, tioles genéticamente introducidas casi de inmediato se convierte oxidados, y resultará difícil purificar y modificar químicamente.
La figura 3 muestra bandas de CsCl ejemplares. El propósito de discontinuo CsCl bandas antes de modificación química eliminar detritos celulares de las partículas de virus. La modificación sí mismo entonces puede tener lugar en CsCl. Las bandas de segunda después de la modificación química sirve para eliminar un exceso de parte de acoplamiento (sin reaccionar). De nota, una modificación del virus no puede verse en el gradiente y requiere más análisis molecular, idealmente por SDS-PAGE.
La figura 4 muestra ejemplos típicos de modificaciones exitosas cápside. Fracciones más acoplados a capsomeres específicos alteran el comportamiento corriente de capsomeres respectivos en SDS-PAGE. Por comparación directa con un control sin modificar, se puede verificar el éxito de acoplamiento y análisis densitométricos pueden ayudar a determinar en general acoplamiento eficiencia (porcentaje de bandas cambiadas de puesto y que para la capsomere modificado).
Figura 1: modificaciones de cápside genética y química combinada de cápsida de vector de adenovirus permiten accesorio covalente de polímeros de protección y dirigida a ligandos. Genéticamente se introducen residuos de cisteína en lazos de cápside seleccionado, expuestos al solvente de la cápsida de vector de adenovirus para equipar a las partículas de vector con nueva reactividad química. Los vectores pueden ser producidos mediante protocolos y células productora convencional. Después de la producción, los residuos de cisteína genéticamente introducidas son específicamente y covalente modificados con partes de acoplamiento tioles reactivos (ligandos, protección de polímeros de hidratos de carbono, moléculas pequeñas, tintes fluorescentes, etcetera). Para el acoplamiento, se pueden emplear compuestos activados maleimida (que forman lazos thioether estable con la superficie de la partícula vectorial) o derivados de pyridyldisulfide (que forman puentes disulfuro de bioresponsive). Después de acoplamiento, los vectores son purificados por CsCl discontinua bandas para quitar partes de acoplamiento exceso sin reaccionar. PEG, glicol de polietileno (polímero de protección); L, ligandos (derivados de una amplia variedad de clases de la sustancia); -SH, funcionalidad de tiol de los residuos de cisteína genéticamente introducidas. Utilizando esta tecnología, un número definido de moléculas puede acoplarse covalentemente a la cápsida de vector, y una selección precisa del sitio de acoplamiento es factible. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: efecto citopático durante la producción de vectores. Las células de la productora convencional (aquí, las células de HEK 293) se pueden utilizar para la producción de los vectores modificados genéticamente antes de la modificación química. La aparición de la CPE indica el punto mejor para cosechar las células. (A) las células dos horas después de la infección, (B) células 24 horas después de la infección y (C) células 40 horas después de la infección antes de la cosecha. Barras de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: resultados ejemplares de gradientes de CsCl. Gradientes de CsCl antes (A, B) y después de la modificación (C) química. (A) un vector de adenovirus es anillado por discontinua centrifugación gradiente densidad de CsCl. La fase superior aparece verde desde el vector mostrado cassettes de expresión osos un hCMV-promotor-conducido para la EGFP. El virión del vector es congregado como una banda única, blanca en el tercio inferior del tubo. Los dos grupos más pequeños (arriba) se derivan de las partículas incompletas, que no deben ser recopiladas. (B) un vector de expresión de EGFP Ad cisteína-cojinete antes de modificación química. (C) el mismo vector después de la modificación. La banda en el tercio inferior del tubo será recopilada y purificada por una columna de desalación. La marca de lápiz en B y C etiquetas la frontera de las dos densidades y permite identificar la ubicación de la banda de vector que se recogerán. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: manchado SiIver SDS-PAGE para evaluar eficiencia de acoplamiento. Marcador de MW en el carril 1. Un vector con cisteínas introducido en la base de penton capsomeres y hexon quedó sin modificar (carril 2) o modificado con activado maleimida PEG (polietileno glicol) con un peso molecular de 5 kDa (carril 3). Hexon y base del penton exhiben un cambio en SDS-PAGE, que indica la modificación de > 90% de los monómeros por la cápside. Un vector con un residuo de cisteína en hexon quedó sin modificar (carril 4), modificado con 5 kDa PEG (carril 5), o con 20 kDa PEG (carril 6). Cabe señalar que el cambio más grande de la banda del hexon es debido al mayor peso molecular de la kDa 20 PEG, en comparación con el kDa 5 PEG (carril 5). El gel muestra especificidad y la eficiencia del acoplamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La eficiencia por el cual las cisteínas genéticamente introducidas pueden ser modificados químicamente es típicamente 80-99%, y ciertas variables influyen en dicha eficacia. En primer lugar, es primordial que las cisteínas genéticamente introducidas no sufren oxidación prematura. Estando bien protegido en el ambiente reductor de las células del productor, es obligatorio proporcionar un ambiente no-oxidative después de lanzar vector partículas de las células del productor y en la modificación química. Para ello, reduciendo los reactivos puede utilizarse en concentraciones de 0.1-10 mM, y es necesario utilizar reductores reactivos que no contienen grupos tiol, que serían fácilmente reaccionan con compuestos de maleimida activado. En segundo lugar, al utilizar compuestos activados maleimida, pH durante la reacción de acoplamiento no debe exceder 7.35, desde un pH mayor a 7.4 puede disminuir la especificidad de la reacción. En tercer lugar, en cualquier caso, libre de aminas tampones (por ejemplo, HEPES, PBS) puede usarse para la reacción. De nota, partículas de vector de rodamiento de la cisteína pueden ser purificadas por CsCl doble bandas como el descrito, entonces almacenado en HEPES/10% glicerol antes de la modificación química. En este caso, 0.1-1 mM TCEP debe utiliza un reactivo reductor, o preferentemente, los vectores deben ser almacenados en una atmósfera de argón. Frascos de plástico lleno de argón con las tapas se pueden utilizar para este propósito. Además, eficiencia de modificación está influenciada por el diámetro hidrodinámico del compuesto juntado a la cápsida y el sitio al que está acoplado. Capsomeres muchas que pueden servir como blancos para la modificación específica de la geneti-químicos están presentes en la cápside como trimers (fibra, del hexon) o pentámeros (base del penton). Por lo tanto, dependiendo de la ubicación de la cisteína genéticamente introducida, una molécula de molécula acoplada a un monómero sterically podría obstaculizar el acoplamiento de otra molécula de monómeros vecinos. Esto se debe considerar al seleccionar sitios ideales para modificaciones de cápside geneti-química.
Para facilitar la solución de problemas, algunos problemas pueden surgir cuando siguiendo el protocolo descrito. Rendimientos de vector primero, baja (por debajo de las partículas vector 10.000 por célula de productor) pueden resultar de subóptima infección de células del productor. Lo ideal sería MOI 100-300 puede usarse para la infección de células del productor. Tenga en cuenta que ambas cantidades vectoriales demasiado alto y demasiado bajo para el inóculo generan rendimientos subóptimos. Es ideal para la productora el día antes de la infección de células de paso. Pueden aparecer bandas segunda, graso en los gradientes de CsCl. La razón más frecuente para el aspecto graso de bandas en los gradientes de CsCl es un pH de las soluciones de CsCl que es demasiado ácido. El reactivo reductor TCEP es muy ácido, y debe tener cuidado al ajustar el pH antes de cargar el vector en el gradiente, puesto que los vectores de adenovirus se desintegran fácilmente en un ambiente ácido. En tercer lugar, bajo acoplamiento eficiencias (< 80% del acoplamiento) son el resultado más frecuente de preparados de vector impuro o prematura oxidación de grupos tiol en la superficie del vector. Las impurezas pueden detectarse por SDS-PAGE y plata. En el caso de que las impurezas significativas ocurren, producción de vectores debe ser reiniciado. Además, eficiencia de acoplamiento baja puede deberse a libres tioles no vectorial en la reacción. Por lo tanto, se aconseja no utilizar ß-mercaptoetanol o Ditiotreitol como reducción de reactivos, ya que ambos contienen grupos tiólicos libres. De la nota, para seleccionar sitios de accesibilidad para introducir residuos de cisteína que pueden ser modificados fácilmente, deben utilizarse estructuras cristalinas; de lo contrario, las cisteínas pueden no ser accesibles a los socios de acoplamiento. El riguroso uso de argón o TCEP puede evitarse prematura oxidación de tioles en la superficie del vector.
Por último, cálculos estequiométricos incorrecta también pueden conducir a acoplamiento bajas eficiencias. En el siguiente ejemplo pretende ilustrar la fórmula genérica presentada arriba y facilitar los cálculos estequiométricos. En el ejemplo, se introduce una cisteína en la capsomere hexon. La concentración de partículas del vector después de la CsCl primer paso purificación gradiente se determina como 1.5 x 1010 partículas de vector por μl y como parte de acoplamiento, se utiliza malPEG-750. Cada cápside vector contiene proteínas del hexon 720 (240 trimers), por lo que el título de cisteínas por μl, por tanto, las sumas a 720 x 1.5 x 1010 = 1,08 x 1013 cisteínas/μl. Para modificar 1,5 mL de partículas de vector, un total de 1.62 x 1016 cisteínas deben reaccionar con la molécula de acoplamiento. Para llegar a acoplamiento eficiente, se recomienda un 50 x exceso molar de acoplamiento compuesto para el total de residuos de cisteína: 1.62 x 1016 x 50 = 8.1 x 1017 moléculas de malPEG-750 es necesario acoplar eficientemente a 1.5 x 1016 cisteínas de la 1,5 mL de solución de vector mediante el primer gradiente de paso de CsCl. MalPEG-750 exhibe un peso molecular de 750 Da; por lo tanto, 6,022 x 1023 moléculas de malPEG-750 peso 750 g. Por lo tanto, para el acoplamiento eficaz de 1.62 x 1016 residuos de cisteína en 1,5 mL de solución de vector con un exceso de 50 x de malPEG-750, 8.1 x 1017 moléculas de malPEG-750 = (750 x 8.1 x 1017) / (6.022 x 1023) = 1 x 10-3 g = 1 mg malPEG-750 se requieren.
El método presentado complementa y supera al método de vector de pegilación. Convencional, dirigido por amina vector pegilación no permite para la fijación específica de blindaje o dirigidos a grupos, mientras que la tecnología de acoplamiento de geneti-química presentada aquí puede utilizarse para fijar precisamente partes de a vector de adenovirus superficies en posiciones definidas y en números de copia definido. Por lo tanto, es adecuado tanto para protección y orientación de las partículas de vector de adenovirus.
De nota, este protocolo también puede utilizarse para una convencional dirigido por amina pegilación de vectores del anuncio mencionado arriba. En ese caso, el reactivo reductor TCEP puede omitirse de los buffers. Para los cálculos estequiométricos, el número de grupos de la amina accesible por partícula puede considerarse como 18.000 y excesos típicos molares de moieties amina reactiva acoplamiento son 20-100 veces.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
References
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