Summary
本文所述的协议使研究人员能够通过简单的化学方法在选定的地点专门修改腺病毒衣壳。可生成屏蔽腺病毒载体颗粒和重定目标基因转移载体, 并可研究载体宿主相互作用。
Abstract
腺病毒载体是基因接种和溶瘤 virotherapy 的有力工具。然而, 它们容易发生多种不希望的载体-宿主相互作用, 特别是在体内分娩后。人们一致认为, 如果对矢量表面进行了定义的修改, 就只能克服不需要的矢量宿主交互所施加的限制。这些修改包括通过引入新配体来屏蔽粒子不需要的相互作用和靶向。这里提出的协议的目标是使读者能够产生屏蔽, 如果需要的话, 重定目标人腺病毒基因转移载体或溶瘤病毒。该议定书将使研究人员通过对合成聚合物、碳水化合物、油脂或其他生物或化学基团的特定化学附着来修改腺病毒载体衣壳的表面。它描述了结合遗传和化学衣壳修饰的尖端技术, 这已被证明有助于理解和克服在体内提供腺病毒载体的屏障。提供了对生物活性病毒或病毒衍生载体执行特定化学反应的关键步骤的详细和注释性描述。该协议中所述的技术是基于基因引入 (自然缺席) 半胱氨酸残留物的溶剂暴露环腺病毒衍生载体。这些半胱氨酸残留物提供了一种特定的化学反应性, 可在产生高滴度的载体后, 用于高度特异和高效的共价键化学耦合分子从各种各样的物质类到向量粒子。重要的是, 该协议可以很容易地适应, 以执行广泛的不同 (非硫醇基) 化学修饰腺病毒载体衣壳。最后, 除了腺病毒以外的非包膜的基因转移载体也可能根据本协议进行修改。
Introduction
腺病毒 (Ad), 家庭 Adenoviridae 的成员, 是未被包围的 DNA 病毒, 迄今已发现超过70种类型 (http://hadvwg.gmu.edu)。根据 hemaglutination 属性、基因组结构和测序结果, 70 种广告类型可分为七种 (人腺病毒 A 至 G)1、2。人类广告基因组的大小为 38 kb, 由秩核衣壳3封装。由于其丰度, 衣壳蛋白六邻体、彭恩碱和纤维都被称为主要衣壳蛋白。最丰富和最大的衣壳蛋白六邻体形成20衣壳面, 每个构成12六邻体 homotrimers4,5。彭恩位于每个秩边缘 (顶点) 上, 由彭恩基 pentamers 组成, 表示由糖化纤维三聚体5、6构建的顶点尖峰的基部。本机 Ad 单元格条目基本上由两个主要步骤组成。首先, 纤维旋钮与主受体结合。在种类 A、C、E 和 F 的广告类型中, 这是柯萨奇和腺病毒受体 (汽车)。这种相互作用使 virion 进入细胞表面的空间接近, 从而促进彭恩基细胞整合素和 RGD 图案之间的相互作用, 从而诱导细胞反应。第二, 细胞骨架的变化导致 virion 的内部化和运输到缔7。在缔中进行部分拆卸后, virion 被释放到细胞质中, 最终会传播到细胞核进行复制。
虽然可以在本地交付 Ad (例如, 用于基因接种), 但 onco virotherapy 所需的血液系统传递面临几个障碍。在血液循环中, 注射病毒会遇到宿主免疫系统的防御系统, 导致病毒载体的快速中和, 以及在系统应用中呈现基于 Ad 的矢量极低效率。此外, 广告的自然经干扰系统交付, 必须解决, 将广告重定向到其新的目标细胞。
种系编码的天然 IgM 抗体的先天免疫系统迅速识别和绑定高度重复的结构在表面上的 virion8,9。这些免疫复合体然后激活补充系统的经典和非经典通路, 导致快速补充-介导的病毒8的大部分的中和。第二条途径导致主要去除 Ad 病毒由巨噬细胞10介导, 并与急性毒性和血流动力学副作用11,12。特别是在 Ad 的情况下, 枯否细胞驻留在肝脏绑定到和 phagocytically 采取病毒通过特定的清道夫受体的广告, 从而消除他们从血液13,14,15.在肝窦内皮细胞 (lse 细胞)16中也发现了特定的清道夫受体, 而 LSE 细胞也似乎有助于去除17的矢量, 但在多大程度上仍需要澄清。此外, 一些广告类型和他们的衍生载体被有效地隔离的人红细胞18 , 他们通过汽车或补充受体 CR119捆绑。值得注意的是, 这种螯合机制不能在小鼠模型系统中研究, 因为与人红细胞相比, 小鼠红细胞不表示汽车。
自适应免疫系统产生的特定抗 ad 抗体, 无论是由于以前的感染与 ad 或在系统应用的第一次交付后, 对广告载体的有效使用提出了进一步的障碍, 他们应该回避在高效的系统交付。
最后, 一些广告类型 (包括 Ad5) 的强势经严重阻碍了广告在系统性治疗中的应用。这种取向导致肝细胞转导是由于 ad virion 对凝血因子 X (fx) 的高度亲和力, 由 fx 与 Ad 六邻体蛋白20、21、22的相互作用介导。FX 桥 virion 肝素硫酸盐聚糖 (HSPGs) 在肝细胞的表面20,23,24,25。这种相互作用的一个关键因素似乎是肝细胞中 HSPGs 的 n-和邻硫酸化的具体程度24, 与其他细胞类型的 HSPGs 不同。除了这种 FX 介导的途径, 最近的研究表明, 进一步的途径尚未确定, 导致肝细胞的 Ad 转导26,27,28。
最近, 研究表明, FX 不仅涉及 Ad 的肝细胞转导, 而且通过结合, virion 屏蔽病毒颗粒对中和的补充系统26。减少肝细胞转导通过防止 FX 结合, 因此, 将产生不必要的副作用, 增加 Ad 中和通过先天免疫系统。
因此, 有必要深入了解载体和宿主生物体之间的复杂相互作用, 以便为系统应用开发更有效的载体, 以规避宿主有机体施加的障碍。
最初用于治疗蛋白的一种策略已经适应了广告载体, 至少部分克服了上面描述的障碍。通过偶联聚乙烯乙二醇 (PEG)29、30, 可降低治疗蛋白化合物的抗原性和免疫原化。因此, 聚合物如 PEG 或聚 [n-(2-羟丙基) methacrylamid] (pHPMA) 与衣壳表面的共价耦合会保护载体免受不需要的矢量-宿主相互作用。通常, 聚合物耦合靶向在壳体表面随机分布的赖氨酸侧残留物中的ε胺基团。溶液中的矢量粒子是由于附着聚合物的亲水性, 被稳定的水壳所包围, 从而降低了免疫细胞识别或酶降解的风险。此外, 聚乙二醇 Ad 载体被证明在体外和免疫前小鼠体内的抗六邻体抗体, 以逃避中和31。与遗传衣壳的修改相反, 聚合物的化学耦合在生产和纯化后进行, 不仅允许使用传统的生产者细胞和生产高滴度向量种群, 而且还用于同时在衣壳表面上对数以千计的氨基酸进行修改。然而, 胺导向屏蔽在整个衣壳表面随机发生, 导致高异构性问题, 不允许修改特定 capsomers。此外, 所需的大聚合物基团对病毒生物活性的影响32。
为了克服这些局限性, Kreppel等。33引入了合作-化学概念, 用于矢量重定位和去靶化。半胱氨酸是基因引入到病毒衣壳在溶剂暴露的位置如纤维高环路33, 蛋白 IX34, 和六邻体35,36。虽然不是自然发生的, 但半胱氨酸的 Ad 载体可以在正常生产者细胞中以高滴度产生。重要的是, 在某一 capsomer 中插入半胱氨酸在某些 capsomers 和不同位置允许对硫醇基团反应基团进行高度特异的修改。这种合作的方法已经被证明克服了广告矢量设计中的许多障碍。结合胺基聚乙二醇化不再瞄准目标和硫醇基的转铁蛋白与纤维旋钮高环路的耦合已被证明成功地将修改后的广告载体重新定位到缺汽车的细胞33。由于六邻体参与了最不需要的相互作用 (中和抗体, 凝血因子 FX), 硫醇基改性策略也应用于六邻体。耦合小 peg 基团到 HVR5 六邻体阻止 Ad 矢量粒子传感器 SKOV-3 细胞存在 FX, 而大 PEG 基团增加肝细胞转导14,35。在纤维旋钮中载有突变的 Ad 矢量粒子抑制了汽车的束缚和 HVR7 抑制了 FX 的束缚 (在 HVR1 中插入半胱氨酸的位置特定的聚乙二醇化), 以逃避抗体和补充介导的中和,以及清道夫受体介导的摄取而不丧失传染性。有趣的是, 尽管缺乏天然的 FX 盾, 聚乙二醇化再次改善肝细胞转导为 PEG 大小36的功能。然而, 结果表明, 共价屏蔽确实对细胞内的贩运过程产生了影响。造粒等。比较了基于 pHPMA 的不可逆和 bioresponsive 屏蔽, 表明屏蔽和共聚合电荷的模式对细胞进入有影响, 但对细胞核的微粒贩运也有影响。采用带有正电荷的 pHPMA 共聚合物的 bioresponsive 盾, 允许粒子在细胞核内进行颗粒物贩运, 在体外和体内保持 Ad 载体的高转导效率37。
总之, 这些数据表明, 即使在假设所有的矢量-主机-相互作用已知和考虑, 过多的衣壳表面修改是必要的, 以克服与系统向量传递相关的障碍。
在这里, 我们提供了一个协议, 以执行特定于站点的化学修饰腺病毒载体衣壳屏蔽和/或重定向腺病毒载体颗粒和腺病毒溶瘤病毒。图 1概述了该技术的概念。它允许某些衣壳区域免受不必要的相互作用的合成聚合物的共价键连接。同时, 它还提供了一种连接配体并结合屏蔽和定位的方法。使用简单的化学, 实验者将能够共价修改腺病毒载体表面与各种分子, 包括多肽/蛋白质, 碳水化合物, 油脂, 和其他小分子。此外, 该议定书为生物活性病毒源载体在维持其生物学完整性和活性方面的化学修饰提供了一个一般概念。
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Protocol
注意: 在以下内容中, 详细介绍了 Ad 矢量的合作-化学聚乙二醇化协议。为了实现 PEG 基团的特定耦合, Ad5 载体在高变环路5中引入半胱氨酸残留物到六邻体蛋白中, 预先进行了基因改造, 如前一出版物36所述, 以及马来酰亚胺活化的 PEG化合物用作偶联化合物。
1. CsCL 阶梯梯度法制备矢量纯化缓冲液
- 通过加入50毫米 HEPES (4.76 g/400 毫升) 和150毫米氯化钠 (3.504 g/400 ml) 到双蒸馏水 (ddH2O), 准备400毫升腺病毒缓冲液 (Ad 缓冲液)。350毫升此缓冲区需要准备以下三个 Ad 缓冲区变体。
- 变体 A: 使用氢氧化钠调整150毫升的 Ad 缓冲器至 pH 7.6。
- 变体 B: 添加最终浓度为10毫米 TCEP [三 (2-羧乙基) 膦), 0.143 g] 到50毫升, 并调整到 pH 7.2 与 HCl。
- 变体 C: 添加最终浓度为0.5 毫米 TCEP (0.022 g) 到150毫升, 并调整到 pH 7.2 与 HCl。
- 在 ddH2O 和分析级化学品中准备缓冲液。使用 100 mL 变体 A 和变体 C 来准备 CsCl 缓冲区 (请参阅步骤1.2 和 1.3; 50 毫升每个) 必要的 CsCl 步骤梯度 (请参阅步骤 3.2.6. 和 3.2.18)。
- 在 Ad 缓冲区中准备 CsCl 阶跃梯度缓冲器 (ρCsCl = 1.41 g/厘米3)
注意: 此缓冲区将需要在两个不同的变体:- 称量两个等份准确27.42 克 CsCl 成50毫升管。
- ρCsCl = 1.41/TCEP 缓冲区: 解决 CsCl 在40毫升的 Ad 缓冲区的变体 C。
- ρCsCl = 1.41 缓冲区: 解决 CsCl 在40毫升的变体 A 的 Ad 缓冲区。
- 检查, 必要时, 用 HCl 调节 pH 值. 用相应的广告缓冲器变体填充到完全 50 mL。为了达到最佳的分离效果, 精确的 CsCl 浓度和 pH 值至关重要。
- 通过称量每个梯度缓冲器的 1 mL (1.41 g) 来检查密度 (CsCl 含量)。
- 在 Ad 缓冲区中准备 CsCl 阶跃梯度缓冲器 (ρCsCl = 1.27 g/厘米3)
注意: 此缓冲区需要两种不同的变体:- 在50毫升管中称量两个精确18.46 克 CsCl 的等份。
- ρCsCl = 1.27/TCEP 缓冲区: 解决 CsCl 在40毫升的 Ad 缓冲区的变体 C。
- ρCsCl = 1.27 缓冲区: 解决 CsCl 在40毫升的变体 A 的 Ad 缓冲区。
- 检查, 必要时, 用 HCl 调节 pH 值。最后, 用相应的广告缓冲器变体填充到完全 50 mL。为了达到最佳的分离效果, 精确的 CsCl 浓度和 pH 值至关重要。
- 通过称量每个梯度缓冲器的 1 mL (1.27 g) 来检查密度 (CsCl 含量)。
- 通过过滤 (使用0.45 µm 网孔尺寸) 将所有缓冲液 (Ad 缓冲器和 CsCl 步进梯度缓冲器) 消毒到无菌瓶中。
- 灭菌后, 为了防止氧化的 TCEP, 饱和和覆盖的缓冲区包含 TCEP 与氩气曝的缓冲液在三十年代左右。在应用氩气时, 请注意只使用无菌设备 (例如, 无菌移液器提示), 并使用足够大的瓶子来允许氩脂。
注意: 所有缓冲器应准备新鲜, 并保护从光, 可以存储在4°c 几天 (特别是 CsCl 阶梯梯度缓冲区, 应该只保留几天)。
2. 联轴器基团: 储存和准备
注: Moeities 用于耦合到半胱氨酸需要承受硫醇反应基团。马来酰亚胺活化的化合物将形成稳定的硫醚键与基因引入半胱氨酸。另外, 还可以使用邻 pyridyldisulfide (种种) 活化化合物, 形成 bioresponsive 在矢量粒子和偶联基团之间的二硫化物桥。冻干 malPEG-750 以及大多数其他偶联试剂对水解敏感, 应以冻干粉的形式储存在-80 摄氏度的干燥状态。
- 为了防止冷凝水在小瓶解冻后积聚, 请将小瓶存放在较大的管子 (例如, 50 毫升管) 中, 填充有硅胶珠垫。将这些管子存放在一个足够大的容器里, 还装满了硅胶珠垫。
- 在紧紧关闭每个管和容器之前, 用氩气交换空气。这可以通过将打开的管子和容器放入干燥器, 然后用氩气去除和更换空气来实现。由于氩气比空气重, 管和容器用氩气填充, 现在可以彼此放置, 每个盖子紧紧关闭。
- 将容器存放在-80 摄氏度。
- 解冻时, 将容器放在干燥器的硅胶珠上, 慢慢加热至室温, 然后打开容器。
- 在进行偶联反应时, 新鲜的溶液中所需的耦合基底量。注意不要将10% 以上的耦合溶液添加到最终的偶联反应中, 特别是当 DMF 或 DMSO 用作耦合基底的溶剂时。
3. 广告载体的扩增、纯化和化学修饰:
- 广告载体的放大
注意: 根据当地的生物安全规则, 必须使用安全柜执行以下步骤。- 转染复制缺陷∆E1 Ad 向量包含一个 (或多个) 基因引入半胱氨酸残留物到 HEK 293 细胞, 如凯策和 Kreppel38所述。
- 根据协议38, 按顺序 reinfections 放大向量, 直至最终制备感染15-20 个大 (15 厘米) 细胞培养板 (大约 1-2 x 107细胞/板)。
注意: 最佳, 最后一次再感染应定时, 以便细胞显示全细胞病变效果 (CPE) 在上午的纯化和修改性能 (见图 2)。 - 最终放大步骤后, 在 Ad 缓冲区重悬的单元格 + 10 毫米 TCEP (变体 B) 可以冻结在-80 摄氏度;然而, 为了获得最佳的矢量粒子产量, 建议立即对细胞裂解和载体纯化和修饰进行随访。
- Ad 矢量的纯化与化学修饰
注: 根据所述的腺病毒纯化协议, 对载体进行纯化。38但在非氧化条件下。细胞采集和裂解以及载体纯化和化学修饰可以在一天内进行。根据前面描述的协议, 采集并裂解受感染的细胞38.- 通过刮板并将上清液转移至200-500 毫升离心管来收集细胞。
- 在 400 x g 旋转细胞溶液10分钟。
- 将细胞颗粒重悬4毫升的 Ad 缓冲器 + 10 mM TCEP (pH 7.2) (变体 B) 并转移到无菌50毫升管中。如果细胞产量低或只有弱 CPE 被诱导, 重悬在2毫升。
- 用3个循环冷冻 (液氮) 和解冻 (在37摄氏度的水浴中) 来挽救向量。
- 旋转10分钟, 5000 x g, 4 摄氏度。
- 离心时, 准备两个相等的 CsCl 步长梯度:
- 首先, 作为较低的阶段, 添加3毫升1.41 克/厘米3 ρCsCl 在 Ad 缓冲区 + 0.5 毫米 TCEP (pH 7.2, 变体 C) 到超速离心管。在加载上一阶段之前, 在管上标记较低阶段的水平。
- 小心地堆叠5毫升的 1.27 g/cm3 ρCsCl 在 Ad 缓冲器 + 0.5 毫米 TCEP (pH 7.2, 变体 C) 的上阶段, 通过非常缓慢移液的5毫升体积沿管壁到较低的阶段。
注: 由于在耦合过程中, 高浓度的 TCEP 可能与 malPEG-750 的马来酰亚胺残留物反应, 并导致耦合效率降低, CsCl 步进梯度的纯化需要在降低的 TCEP 浓度下进行。
- 将上清液加载到 CsCl 梯度上 [均匀地将上清液分成两个梯度, 或者在低矢量屈服 (见上文) 的情况下, 将上清加载到仅一列], 并以 Ad 缓冲器 + 10 mM TCEP (pH 7) 将两个渐变均匀填充到顶部。. 2, 变体 B)。
- 调整相对管的重量为 0.0 g 重量差。
- 超速离心2小时, 17.6万 x g, 4 摄氏度。
- 使用夹钳, 将超速离心管固定在支架上, 使该区域周围的较低相级别标记可访问。将鹅颈灯放在管子上方。在标记周围, 在下和上阶段之间的边界, 一个明确的波段 (矢量病毒) 应该是可见的 (图 3A-3C)。
- 用针头刺穿管子, 并将载体带入注射器, 收集载体。转移收集的矢量病毒到15毫升管。
注: Ad 矢量波段上方的较弱波段包含不完整的矢量粒子, 应避免吸入。EGFP 表达广告载体的细胞碎片和绿色荧光蛋白 (EGFP) 将在超速离心管的上部收集 (见图 3A和3B)。这一步和以下步骤, 以耦合 (步骤 3.2.16) 应迅速执行, 因为矢量现在是明智的二硫结合由于低 TCEP 浓度。 - 要计算有效地将基底与所有半胱氨酸残留结合在载体制备中所需的耦合基底量, 请测量 OD260:
- 根据凯策和 Kreppel38所述的协议, 涡旋混合了10µL 所收集的矢量病毒、89µL 的 Ad 缓冲器和1µL 10% SDS。作为一个空白探针, 涡旋99µL 的 Ad 缓冲器和1µL 10% SDS。
- 要变性病毒, 请在56摄氏度孵育10分钟。
- 确定 OD260。
- 使用以下公式计算每个µL 的物理矢量滴度: OD260 x 稀释因子 x 经验确定的 Ad 消光系数 (1.1 x 109矢量粒子 = 1 OD260单位/µL)。因此, 测量的 OD260的1.36 的向量稀释 1:10, 将计算为: 1.36 x 10 x 1.1 x 109 = 大约 1.5 x 1010矢量粒子/µL。
注: 此滴定度只是粗略估计;然而, 它是足够准确的计量计算如下所述。
- 根据通过引入半胱氨酸改变的蛋白质, 确定耦合基板的量 (以克为有效的偶联反应), 根据以下一般公式: 病毒滴度 x 体积 x 半胱氨酸 x 的数量超过部分 x分子量/6022 x 1023 = 耦合基底的克。
注: 在这个等式中: 1) 病毒滴度是滴定度/µL, 由 OD260所述, 2) 体积占µL 中所用的渴望向量的体积, 3) 半胱氨酸的数量是蛋白质的数量, 其中半胱氨酸根据载体粒子的残留量, 4) 过量的基团是有效的偶联反应 (50x) 和5的基团过剩的因素, 必须将基团的分子量引入 Da (不是 kDa)。 - 新鲜地解决适当溶剂中所需的化合物 (或可行量) 的数量。
注: 由于所需的耦合基底量低且难以称量, 但价格昂贵, 因此可以称量尽可能少的化合物, 并将其溶解在适当浓度中, 以应用于偶联反应。 - 将矢量解决方案转移到合适的尺寸管 (例如, 2 毫升管), 并将计算出的耦合复合库存溶液的数量添加到矢量。
- 在室温下, 通过架空旋转将溶液轻轻混合1小时。
- 使用 Ad 缓冲器 (pH 7.6, 变体 A) 将矢量解决方案填充为 6 mL 总体积。
注意: 在将解决方案应用到步骤渐变之前, 必须执行此步骤, 以确保仍包含第一步渐变的 CsCl 的矢量解决方案的密度低于1.27 克/毫升。 - 在第二个 CsCl 带状步骤中, 从未反应耦合基团中纯化矢量:
- 通过对每个步骤执行以下步骤, 准备两个相等的 CsCl 步长梯度: 1) 下相: 3 mL 1.41 克/厘米3 ρCsCl 在 Ad 缓冲区 (pH 7.6, 变体 A), 2) 在加载上一阶段前, 在管的较低阶段的标记水平和 3) 上阶段: 5 毫升1.27 克/厘米3 ρCsCl 在 Ad 缓冲器 (pH 7.6, 变体 A)。
注意: 在耦合发生后, 使用没有 TCEP 的缓冲器, 因为在矢量衣壳上不应存在游离的硫醇基团。 - 将上清液加载到 CsCl 梯度上, 并用 Ad 缓冲器 (pH 7.6, 变体 A) 将两个渐变均匀地填充到顶部。
- 调整相对管的重量为 0.0 g 重量差。
- 通过对每个步骤执行以下步骤, 准备两个相等的 CsCl 步长梯度: 1) 下相: 3 mL 1.41 克/厘米3 ρCsCl 在 Ad 缓冲区 (pH 7.6, 变体 A), 2) 在加载上一阶段前, 在管的较低阶段的标记水平和 3) 上阶段: 5 毫升1.27 克/厘米3 ρCsCl 在 Ad 缓冲器 (pH 7.6, 变体 A)。
- 超速离心2小时, 17.6万 x g, 4 摄氏度。
- 在超速离心结束前不久, 平衡 PD-10 柱5倍, 5 毫升的 Ad 缓冲器 (pH 7.6, 变体 a)。
- 如步骤3.2.10 中所做的那样, 请固定超速离心管, 使其保持在较低相位级别标记附近的离开区域。将鹅颈灯放在管子上方。同样, 在上下相之间的边界周围, 一个不同的波段 (矢量病毒) 应该是可见的 (图 3C)。
- 用针头刺穿管子, 将载体带入注射器, 并将载体转移到15毫升的试管中, 收集载体。小心收集病毒的两个梯度管一起作为2.5 毫升总体积或更少。如果收集较小的卷, 填充以获得2.5 毫升总交易量与 Ad 缓冲区 (变体 a)。
- 将2.5 毫升装载到平衡 PD 柱上。丢弃直通。
- 在列上添加 3 mL Ad 缓冲区 (变体 A), 并收集流经 (包含纯化的矢量病毒)。
- 添加甘油 (333 µL) 以获得最终浓度为 10%, 并分为合适的等份 (例如,每个400µL), 并包括等分20µL 的滴定度测定通过 OD260测量。
- 将矢量解决方案存储在-80 摄氏度。
- 通过测量20µL 矢量解的 OD260 、79µL 的 Ad 缓冲器 (变体 A) 和1µL 10% SDS (如步骤3.2.12 中所述), 确定矢量的滴度。作为空白, 使用79µL 的广告缓冲器 (变体 a), 10 µL 10% 甘油, 1 µL 10% SDS。
- 计算矢量滴度为: OD260 x 系数稀释 x 1.1 x 109矢量粒子/µL。
按照步骤3.2.27 中的准备, 计算: OD260 x 5 x 1.1 x 109矢量粒子/µL
4. 通过 SDS 验证耦合页:
注: 如果使用具有足够高分子量的化合物与 Ad 病毒耦合, 则可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS 页) 验证耦合。与未修改的 ad virion 中的蛋白质相比, 成功的耦合应导致与修改后的 ad virion 蛋白相对应的蛋白带的移位 (见图 4)。
- 根据向量的计算滴定度 (步骤 3.2.28), 通过 SDS (8%) 分离 1-2 x 1010矢量粒子。
- 通过银染色凝胶39开发凝胶, 以检测甚至弱蛋白带:
- 准备用于银色染色的缓冲液 (100 毫升缓冲液所需的量用括号表示):
- 通过混合38毫升的 ddH2O, 50% 甲醇 (50 毫升100甲醇), 12% AcOH (12 毫升 100% AcOH) 和0.0185% 甲醛 (50 µL 的37% 甲醛), 准备缓冲液1。
- 通过添加50% 乙醇 (50 mL 100% 乙醇) 到 50 mL ddH2O, 准备缓冲液2。
- 通过添加0.127 克/升 Na2S2O3 (12.744 毫克) 到100毫升的 ddH2o, 准备缓冲液3。
- 准备缓冲液 4, 加入2克/升阿加诺3 (0.2 g) 和0.0185% 甲醛 (50 µL 37% 甲醛) 至100毫升 ddH2O。
- 通过添加60克/升 na2CO3 (6 g)、0.0185% 甲醛 (50 µL 37% 甲醛) 和2.5 毫克/升 na2S2o3 (0.256 mg) 到 ddH2o 以获得最终容积100毫升, 准备缓冲液5。
- 通过混合 38 ml 的 ddH2O、50% 甲醇 (50 ml 100% 甲醇) 和 12% AcOH (12 ml 100% AcOH), 准备缓冲液6。
- 通过混合60毫升的 ddH2O, 30% 甲醇 (30 毫升100% 甲醇) 和10% 甘油 (10 毫升100% 甘油), 准备缓冲液7。
- 通过混合10% 甘油 (10 毫升100% 甘油) 和90毫升的 ddH2O 制备缓冲液8。
- 准备用于银色染色的缓冲液 (100 毫升缓冲液所需的量用括号表示):
- 执行银染色
- 将凝胶固定在缓冲液1中30分钟。
- 将凝胶在缓冲液2中洗涤15分钟。
- 在缓冲液3中预处理凝胶1分钟。
- 在二十年代 ddH2O 洗涤凝胶3次。
- 将凝胶在缓冲液4中浸渍20分钟。
- 在二十年代 ddH2O 洗涤凝胶2次。
- 在缓冲液5中开发凝胶, 直到波段可见 (十年代至10分钟)。
- 在 ddH2O 2 次洗涤凝胶2分钟。
- 停止在缓冲区6的开发5分钟。
- 将凝胶保存在缓冲液7中20分钟。
- 将凝胶储存在缓冲液8中。
注: 耦合效率可通过光密度量化目标 capsomere 的修改和未修改波段来确定。
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Representative Results
图 2显示了 293 (HEK 293) 细胞的细胞病变效应 (CPE) 的示例, 指示成功的矢量生产。细胞在接种病毒载体后40-48 小时内应显示形态学 (图 2C)。正确的 timepoint, 对于不通过细胞裂解和防止基因引入的硫醇基团的氧化而丢失病毒微粒至关重要。如果矢量粒子通过细胞裂解释放到培养基中, 那么基因引入的硫醇几乎会立即被氧化, 并且会变得难以纯化和化学修饰。
图 3显示了示例性的 CsCl 波段。在化学改性之前不间断 CsCl 带的目的是去除病毒微粒中的细胞碎片。修改本身可以在 CsCl 进行。化学修饰后的第二个色带用于除去过量的 (未反应) 偶联基团。值得注意的是, 在梯度中无法看到病毒的成功修改, 需要进一步的分子分析, 最好是 SDS 页面。
图 4显示了成功的衣壳修改的典型示例。大多数基团耦合到特定 capsomeres 将改变 SDS 页面中各自 capsomeres 的运行行为。通过与未修改的控制进行直接比较, 可以验证耦合的成功与否, 光密度分析可以帮助确定整体耦合效率 (修改后的 capsomere 的移位和非移动带的百分比)。
图 1: 联合遗传和化学衣壳对腺病毒载体衣壳的修饰使屏蔽聚合物和靶向配体的共价键附着.半胱氨酸残留物是遗传在选定的, 溶剂暴露的衣壳环腺病毒载体衣壳, 以装备新的化学活性的载体粒子。这些矢量可以使用传统的生产者细胞和协议来制作。生产后, 基因引入的半胱氨酸残留物是由硫醇-反应耦合基团 (配体、屏蔽聚合物、碳水化合物、小分子、荧光染料等) 专门和共价键修饰的。对于耦合, 可采用马来酰亚胺活化化合物 (与矢量粒子表面形成稳定的硫醚键) 或 pyridyldisulfide 衍生物 (形成 bioresponsive 二硫化物桥)。耦合后, 通过不间断 CsCl 带纯化载体, 去除未反应过量耦合基团。聚乙二醇 (屏蔽聚合物);L, 配体 (从种类繁多的物质类派生);-SH, 硫醇功能的基因引入半胱氨酸残留物。使用该技术, 定义的分子数可以共价键耦合到矢量衣壳, 并且精确选择耦合点是可行的。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 矢量生产过程中的细胞病变效应.传统的生产者细胞 (这里, 293-HEK 细胞) 可用于在化学修饰之前生产转基因载体。CPE 的出现表明收获细胞的最佳 timepoint。(A) 细胞感染后两小时, (B) 细胞感染后24小时, 和 (C) 细胞在收割前40小时感染。比例尺 = 20 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: CsCl 梯度的典范结果.CsCl (A、B) 和 (C) 化学改性后的梯度。(A) 腺病毒载体采用间断 CsCl 密度梯度离心法带状。上期显示为绿色, 因为所示的向量有 EGFP 的巨细胞病毒-启动子驱动的表达盒。向量 virion 被带状作为一个单一的, 白色的波段在下部的第三管。两个较小的波段 (上面) 源于不完整的粒子, 不应该收集。(B) 在化学修饰前用半胱氨酸 EGFP 表示的广告载体。(C) 修改后的同一向量。下第三管中的带将通过脱盐柱收集和纯化。B 和 C 中的钢笔标记标注了两个密度的边界, 并允许识别将收集的矢量波段的位置。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 银染色 SDS-页面, 以评估耦合效率.1车道的 MW 标记。半胱氨酸引入 capsomeres 彭恩基中的一个载体, 六邻体未被修改 (车道 2) 或用马来酰亚胺活化 PEG (聚乙二醇) 改性, 分子量为 5 kDa (3 巷)。六邻体和彭恩基地在 SDS 页面上表现出了变化, 表明每个壳的单体 > 90% 的成功修改。六邻体中半胱氨酸残留的载体未经修改 (车道 4), 用 5 kDa peg (5 车道) 或 20 kDa peg (车道 6) 修改。应注意的是, 六邻体带的较大移位是由于 20 kDa peg 的分子量更高, 与 5 kDa peg (5 车道) 相比。凝胶显示了联轴器的特异性和效率。请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
基因引入半胱氨酸的效率通常为 80-99%, 而某些变量会影响这种效率。首先, 最重要的是, 基因引入的半胱氨酸不会过早氧化。在生产者细胞的还原环境中得到良好保护的同时, 在化学修饰过程中释放载体颗粒后, 必须提供非氧化环境。为此, 减少试剂可用于浓度从 0.1-10 毫米, 并有必要使用还原试剂, 不含硫醇基团, 这将容易与马来酰亚胺活性化合物反应。其次, 当使用马来酰亚胺活化化合物时, ph 值在偶联反应时不应超过 7.35, 因为 ph 值大于7.4 可降低反应的特异性。第三, 在任何情况下, 不含胺缓冲液 (例如, HEPES, PBS) 应用于反应。值得注意的是, 半胱氨酸载体颗粒可以通过双 CsCl 带纯化, 如前所述, 然后在化学改性之前储存在 HEPES/10%glycerol 中。在这种情况下, 0.1-1 毫米 TCEP 应使用还原试剂, 或者优选地, 载体应存储在氩气气氛中。可使用带有盖子的氩气塑料罐来实现此目的。另外, 改性效率受耦合到衣壳的化合物的水动力直径及其耦合的部位的影响。许多 capsomeres 可以作为特定合作化学修饰的靶点存在于衣壳中作为三聚体 (纤维、六邻体) 或 pentamers (彭恩基)。因此, 根据基因引入的半胱氨酸的位置, 一个基团分子耦合到一个单体可能空间位阻阻碍另一个分子与相邻单体的耦合。在选择合作化学衣壳的理想场所时应考虑到这一点。
为了便于故障排除, 在遵循协议描述的时候可能会出现一些问题。首先, 低矢量产量 (每个生产者细胞低于1万个矢量粒子) 可能是由生产者细胞的次优感染引起的。理想情况下, 100-300 的 MOI 应用于生产者细胞的感染。请注意, 接种率过高和过低的矢量量会产生不理想的产量。它是理想的在传染前的前一天通过生产者细胞。第二, CsCl 渐变中的油污波段会出现。在 CsCl 梯度中油污带出现的最常见原因是 CsCl 溶液的 pH 值太酸性。还原试剂 TCEP 非常酸性, 在将载体加载到梯度上之前必须注意调整 pH 值, 因为腺病毒载体在酸性环境中容易解体。第三, 低耦合效率 (< 80% 的耦合) 是不纯的载体制备和/或在向量表面上的硫醇基团过早氧化的最常见结果。可通过 SDS 页和银染色检测杂质。在发生大量杂质的情况下, 应重新启动矢量生产。此外, 在反应中自由非矢量硫醇也可能导致低耦合效率。因此, 建议不要使用ß巯基乙醇或 dithiothreitol 作为还原试剂, 因为两者都含有游离的硫醇基团。值得注意的是, 要选择溶剂型场所, 引入可轻易修改的半胱氨酸残留物, 应使用晶体结构;否则, 耦合伙伴可能无法访问半胱氨酸。通过严格使用氩和/或 TCEP, 可以避免在载体表面过早氧化硫醇。
最后, 不正确的化学计量计算也可能导致低耦合效率。下面的示例说明了上述的通用公式, 并促进了化学计量计算。在这个例子中, 一个半胱氨酸被引入到六邻体 capsomere 中。第一 CsCl 步梯度纯化后的矢量粒子的滴度确定为每µL 1.5 x 1010矢量粒子, 并作为耦合基团, malPEG-750 使用。每个向量衣壳包含720六邻体蛋白 (240 三聚体), 因此每µL 半胱氨酸的滴度, 因此总和为 720 x 1.5 x 1010 = 1.08 x 1013半胱氨酸/µL。为了修改1.5 毫升的矢量粒子, 总共 1.62 x 1016半胱氨酸必须与耦合基团反应。为了达到有效的耦合, 推荐使用 1.62 x 1016 x 50 = 8.1 x 1017 malPEG-750 分子与 1.5 x 1016半胱氨酸之间的耦合化合物的50x 摩尔过量。1.5 毫升的矢量溶液纯化的第一个 CsCl 步骤梯度。MalPEG-750 的分子量为 750 Da;因此, 6.022 x 1023分子的 malPEG-750 重量750克。因此, 为了有效地耦合 1.62 x 1016半胱氨酸残留在1.5 毫升的向量溶液中, 50x 过量的 malPEG-750, 8.1 x 1017分子的 malPEG-750 = (750 x 8.1 x 1017)/(6022 x 1023) = 1 x 10 -3g = 1 毫克 malPEG-750 是必需的。
提出的方法补充和超越了矢量聚乙二醇化的方法。传统的胺定向矢量聚乙二醇化不允许特定于站点的屏蔽或瞄准基团的附着, 而此处介绍的合作-化学耦合技术可用于精确连接基团腺病毒载体在定义的位置和定义的副本编号中的曲面。因此, 它适用于腺病毒载体粒子的屏蔽和靶向。
值得注意的是, 本协议也可用于上述的传统的胺导向聚乙二醇化。在这种情况下, 可以从缓冲器中省略还原试剂 TCEP。对于化学计量计算, 每个粒子可获得的胺基团的数量可以被认为是 1.8万, 并且胺反应耦合基团的典型摩尔过量是20-100 倍。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
References
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