Summary
هنا يصف لنا عزل الخلايا بورسال الابتدائي الدجاج من فبريسوس من الجراب والثقافة والعدوى الخلايا التي تحتوي على فيروس مرض بورسال المعدية، والتحديد الكمي للنسخ المتماثل الفيروسية.
Abstract
فيروس مرض بورسال المعدية (إيبدف) بيرنافيروس أهمية الاقتصادية لصناعة الدواجن. الفيروس يصيب خلايا ب، مما تسبب في معدلات الاعتلال والوفيات، والكبت المناعي في الطيور المصابة. في هذه الدراسة، يصف لنا عزل الخلايا بورسال الابتدائي الدجاج من فبريسوس من الجراب والثقافة وعدوى الخلايا مع إيبدف، والتحديد الكمي للنسخ المتماثل الفيروسية. إضافة الدجاج CD40 يجند زيادة كبيرة في انتشار الخلايا أربعة إضعاف أكثر من ستة أيام للثقافة وبقاء الخلية زيادة كبيرة. الحصول على سلالات اثنين من إيبدف، خلية ثقافة تكييف السلالة و D78 وسلالة خبيثة جداً، UK661، تتكرر أيضا في الثقافات الخلية السابقين فيفو . سيكون هذا النموذج للاستخدام في تحديد كيفية الاستجابة للإصابة إيبدف الخلايا وسوف يسمح بتقليص عدد الطيور المصابة المستخدمة في الدراسات إيبدف المرضية. هذا النموذج يمكن أيضا يمكن توسيعها لتشمل سائر الفيروسات ويمكن تطبيقها على أنواع مختلفة من الطيور.
Introduction
صناعة الدواجن العالمية أمر ضروري لتأمين ما يكفي من الغذاء السكان بشرية الآخذة في توسع. ومع ذلك، الكبت المناعي هو التهديد للأمن الغذائي ورعاية الطيور المتأثرة ويمثل تحديا اقتصاديا رئيسيا لهذه الصناعة. غالبية حالات الكبت المناعي في الدواجن بسبب العدوى بالفيروسات كآبته، مع أكبر المسؤولين عن إضعاف المناعة المكتسبة بعد انتحاء ل الخلايا اللمفية تي وب1. في الطيور، توجد الأغلبية الخلايا ب داخل هيئة تعرف باسم فبريسوس في بورسا (BF). ب الخلايا معرضة للإصابة بالعديد من الفيروسات المثبطة للمناعة، بما في ذلك تلك التي تسبب تحلل، مثل فيروس مرض إيبدف وفي ماريك (MDV)، وتلك التي تسبب التحول، مثل فيروس إنفلونزا الطيور ليوكوسيس (ALV) و (فيروس ريتيكولوندوثيليوسيس REV).
بغية وضع استراتيجيات أفضل للسيطرة على هذه الأمراض، من الضروري أن تميز تفاعل الفيروسات مع خلايا الدجاج ب. ومع ذلك، عندما تتم إزالة الخلايا ب من الطيور، أنها لا البقاء على قيد الحياة جيدا في السابقين فيفو ثقافة2، مما يجعل من الصعب القيام بتحليل دقيق لتفاعلات إيبدف مع خلايا الدجاج ب، أو أحداث المبكر عقب الإصابة ALV أو القس. ونتيجة لذلك، العديد من التفاعلات الفيروس الخلية المضيفة قد درس في فيفو3،4،5،،من67،،من89، 10. وعلى الرغم من هذه الدراسات مفيدة، أنها تنطوي على استخدام الطيور المصابة التي تعاني من الأمراض التي يمكن أن تكون شديدة.
يجند CD40 هو جزيء أن يستحث انتشار الخليوي ب11. بعد تحديد ترميز الجينات الدجاج CD40L (chCD40L)، تم تصميم بروتين لذوبان انصهار، عند إضافة إلى وسائط الثقافة، التي يسببها انتشار الدجاج الابتدائي ب خلايا السابقين فيفو12. في عام 2015، تم العثور على خلايا ب مثقف في هذا الشكل لدعم النسخ المتماثل MDV2 وفي عام 2017، ونحن وآخرون تبين أن الخلايا بورسال الأولية حفزت مع chCD40L يمكن استخدامها كنموذج لدراسة إيبدف النسخ المتماثل13،14. وهنا يصف لنا العزلة وثقافة الخلايا بورسال الابتدائي الدجاج، وعدوى الخلايا مع إيبدف، والتحديد الكمي للنسخ المتماثل الفيروسية. على الرغم من أن يصف لنا الأسلوب في سياق فرنك بلجيكي، هذا يمكن تطبيقها إلى زنزانات عزل والثقافة من مختلف الأجهزة اللمفاوية.
Protocol
يجب أن يوافق جميع الإجراءات مع الحيوانات أخلاقيا مسبقاً. في مؤسستنا، يتم تنفيذ كافة الإجراءات وفقا لقانون "المملكة المتحدة الحيوان" (الإجراءات العلمية) عام 1986 بموجب تراخيص إنشاء المكاتب المنزلية والشخصية والمشروع، بعد الموافقة على "الرفق بالحيوان" الداخلية ومجلس المراجعة الأخلاقية (أويرب).
1-إعداد chCD40L
- بناء ثقافة الخلايا 293-msCD8-CD40L HEK ستابلي تعبر عن chCD40L القابلة لذوبان في 1 × معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) المتوسطة وتستكمل مع 10% معطل الحرارة (مرحبا) مصل العجل الجنين (FCS) و 1 ميكروغرام/مل بوروميسين عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5% أول أكسيد الكربون 2.
ملاحظة: تتوفر هذه الخلايا من معهد بيربرايت في أعقاب التوقيع على اتفاق نقل المواد المناسبة. - تقسيم الخلايا في كثافة 1:5 عندما المتلاقية. يتم تقسيم جمع المادة طافية (التي تحتوي على بنية chCD40L القابلة للذوبان) في كل مرة في الخلايا، والطرد المركزي أنه في 400 x ز لمدة 5 دقائق إزالة الحطام الخلوية، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- عندما تم جمعها 500 مل من المادة طافية، تجمع السائل وتصفية تعقيم أنه عن طريق فلتر 0.2 ميكرون.
- وتركز المادة طافية باستخدام مركزات البروتين الطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي 10 كوفقا لإرشادات الشركة المصنعة. استخراج المادة طافية مركزة من كل عمود وهو تجميع وتصفية تعقيم أنه بتمرير ذلك من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر.
- تحديد التركيز النهائي لاستخدامها في التجارب التي تسلسلياً تمييع الحل chCD40L في 1 x Iscove لتعديل دولبيكو لتثقيف خلايا بورسال الابتدائية حضور تخفيف والمتوسطة (إيمدم) (الموصوفة في الخطوة 2، 4). تحديد صلاحية العدد والنسبة المئوية للخلايا يوميا لتصل إلى أسبوع.
ملاحظة: أدنى تركيز انتشار الخلايا والبقاء فيها كافية هو تركيز لاستخدامها في المقايسة. وهذا يحتمل أن يكون بين 01:20 01:50.
2-إعداد حلول للعزل الرئيسية الخلية بورسال الدجاج
- إعداد 1 x هانكس الملح حل متوازن (هبس) مع الكالسيوم (Ca) بإضافة 10 مل من 10 x HBBS بكاليفورنيا إلى 90 مل ح2س العقيمة و 0.47 ميليلتر ناكو 7.5%3.
- إعداد كولاجيناز د حل الأسهم في 8 ملغ/مل في x HBBS 1 مع تعقيم Ca. تصفية الحل عن طريق فلتر 0.2 ميكرون.
ملاحظة: ينصح بتحضير مختبرين 5 مل وتجميدها في-20 درجة مئوية. - إعداد 1 المتوسطة x RPMI تكملة مع 5 ٪ السفح مرحبا. تخزين الوسائط في 4 درجات مئوية.
- إعداد 1 × 500 مل إيمدم تكملة مع 8% FCS مرحبا، 2% مرحبا الدجاج المصل، β-mercaptoethanol 50 مم، 50 ميليلتر من الأنسولين-ترانسفيرين-الصوديوم-سيلينيت، و 1% البنسلين/ستربتوميسين. تخزين الوسائط في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: إعداد جميع الحلول المذكورة أعلاه في وقت مبكر. - إعداد x HBBS 1 مع مخزن Ca. الحل على الجليد.
- إعداد x HBBS 1 دون Ca بإضافة 10 مل x HBBS 10 دون Ca إلى 90 مل من العقيم ح2س، 0.47 ميليلتر من 7.5% NaHCO3، ويدتا بتركيز نهائي 10 ملم. تخزين الحل على الجليد.
- إعداد حل كولاجيناز د س 1 بإضافة 5 مل من محلول الأسهم كولاجيناز د إلى 13 مل هبس مع المرجع المصدق لجعل ما مجموعة 18 مل. تخزين الحل على الجليد.
ملاحظة: إعداد الحلول المذكورة في الخطوات 2.5 – 2.7 في يوم التجربة.
3-إزالة فبريسوس من بورسا (BF)
- الدجاج خلفي وفتحه في مرفق للمناسبة، وتمت الموافقة عليها وإنسانية إعدام لهم في 2-3 أسابيع من العمر.
ملاحظة: استخدام الأساليب المعتمدة من قبل معهد لإعدام. -
جمع فرنك بلجيكي من كل الدجاج باستخدام تقنيات العقيم.
ملاحظة: استخدام البروتوكولات في مكان في المؤسسة.- ضع الذبيحة في ريكومبينسي الظهرية وتعقيم الجلد والريش وتتراكب في البطن والصدر مع حل الإيثانول 70%، مخففة في الماء.
- تجعل من شق البطني خط الوسط في أسفل البطن باستخدام مقص أو مشرط معقم.
- قم بتحديد موقع فبريسوس من الجراب، الذي يرتبط المقطع والذيلية القولون، الجمجمة إلى مجرور.
- استخدام الملقط المعقم ومقص، قص فبريسوس من الجراب خالية من القولون. الحرص على تجنب ثقب الأمعاء.
- ضع الجهاز في برنامج تلفزيوني الباردة ونقلها إلى المختبر على الجليد.
ملاحظة: الخلايا الأولية ينبغي عزل وقت ممكن بعد الحصاد الجهاز.
4-عزل الخلايا بورسال الابتدائي الدجاج
- العامل في سلامة ميكروبيولوجية مجلس الوزراء، يغسل فرنك بلجيكي على الأقل 3 x في 30 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
- نقل الأنسجة إلى طبق بتري (92 ملم في القطر، 21 ملم في الطول) وإضافة 5 مل حل كولاجيناز د س 1.
- استخدام مقص معقم أو شفرة المبضع، يقتطع فرنك بلجيكي القطع أقل من 5 ملم في القطر.
- احتضان الأنسجة في 37 درجة مئوية مع الانفعالات لطيف الدوري لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: سوف يبدأ الحل كولاجيناز هضم الأنسجة. - استخدام ماصة باستور معقمة، مرارا وتكرارا نضح الخليط لتشجيع تفكك النسيج. إذا لزم الأمر، قطع الأنسجة إلى أجزاء أصغر.
- إضافة آخر 5 مل من 1 x كولاجيناز د حل للأنسجة واحتضان أنه عند 37 درجة مئوية مع إثارة لطيف الدوري لآخر 30 دقيقة.
- كرر الخطوات 4-6 و 4، 7 حتى الأنسجة يهضم تماما.
ملاحظة: سوف يكون هناك الحبيبات الصغيرة التي لا تذوب كذلك. - يمر بتعليق خلية مصفاة خلية 100 ميكرومتر إلى 20 مل x HBBS 1 دون Ca.
- الطرد المركزي بتعليق خلية في 400 x ز لمدة 5 دقائق.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 10 مل 1 x RPMI مع 5 ٪ السفح.
- أما تراكب 10 مل تعليق خلية على أعلى 5 مل من الكثافة المتدرجة الوسائط التي تحتوي على دياتريزواتي بوليسوكروسي والصوديوم أو الأساس الذي تقوم عليه 5 مل من كثافة وسائل الإعلام التدرج تحت تعليق خلية 10 مل. ضمان هناك واجهة واضحة بين الاثنين.
- الطرد المركزي التراكب في 900 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تخفيض أو إزالة قطع أجهزة الطرد المركزي.
ملاحظة: ينبغي أن تشكل الخلايا فرقة في مجال التفاعل بين وسائط الإعلام الخلية وكثافة وسائل الإعلام التدرج. - استخدام ماصة باستور معقمة، إزالة الخلايا ووضعها في برنامج تلفزيوني الباردة. تغسل الخلايا 3 x سينتريفوجينج لهم في 400 x ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيندينج لهم في برنامج تلفزيوني الباردة.
5-ثقافة الخلايا بورسال الابتدائي الدجاج
- الطرد المركزي من تعليق خلية في 400 x ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند لهم في 1 × إيمدم كاملة.
- تأخذ قاسمة لتعليق خلية، إضافة إلى حل تريبان أزرق وحساب عدد خلايا قابلة للحياة التي تستبعد تريبان الأزرق. تحديد عدد الخلايا وصلاحية النسبة المئوية.
- الطرد المركزي من تعليق خلية في 400 x ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند في إيمدم كاملة وتستكمل مع 01:20 إضعاف الدجاج CD40L في كثافة 1 × 107 خلايا/مل. تيتراتي المادة طافية المركزة التي تحتوي على chCD40L لتحديد تمييع المثلى، التي من المحتمل أن تقع في نطاق 01:10 إلى 01:50.
- ثقافة الخلايا في لوحات 96-أو 24 جيدا أما عند 37 درجة مئوية لألواح 96-بئر القاع يو حاء – 48 – 72 الأفضل للوحات مغلوطاً.
ملاحظة: يمكن أيضا أن يكون مثقف الخلايا عند 40 درجة مئوية
6-عدوى خلايا بورسال الابتدائي الدجاج مع إيبدف
- 48 – 72 ح بعد انتهاء العزلة، ذوبان الجليد قاسمة للفيروس، ودوامه العينة، وتخزينها على الجليد.
- ريسوسبيند الخلايا بورسال الأولية واتخاذ 10-ميليلتر اليكووت من تعليق خلية، إضافة إلى 10 ميليلتر لحل تريبان الأزرق وتحديد عدد الخلايا وصلاحية النسبة المئوية.
- يضعف هذا الفيروس في 1 × إيمدم كاملة لتعدد مناسبة للعدوى (وزارة الداخلية) لجعل الفيروس العدوى ودوامه.
- الطرد المركزي بتعليق خلية في 400 x ز لمدة 5 دقائق.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في العدوى الفيروس.
- احتضان تعليق خلية في 37 درجة مئوية ح 1 مع الانفعالات الدوري.
- الطرد المركزي من تعليق خلية في 400 x ز لمدة 5 دقائق وإزالة العدوى الفيروس، وتغسل الخلايا في 1 x كاملة إيمدم وسائل الإعلام.
- الطرد المركزي من تعليق خلية في 400 x ز لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية ريسوسبيند الخلايا في الإعلام إيمدم كاملة وتستكمل مع الدجاج CD40L في كثافة الخلايا 1 × 107 كل مل.
- الثقافة الخلايا في لوحات 96-أو 24 جيدا أما عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن أيضا أن يكون مثقف الخلايا عند 40 درجة مئوية
7-التحديد الكمي للنسخ المتماثل إيبدف في خلايا بورسال الابتدائي الدجاج
- على بوستينفيكتيون نقطة الوقت المطلوب، ريسوسبيند الخلايا وتحويلها إلى أنبوب مناسب والطرد المركزي لهم في 400 x ز لمدة 5 دقائق وحصاد المادة طافية لمعايرة الفيروس بمقايسة اللوحة أو المقايسة50 تسيد حسب ريد-مونش الأسلوب15.
- تغسل الخلايا الموجودة في 1 مل من برنامج تلفزيوني وإعدادهم أما إيمونوستينينج مع جسم معين إلى إيبدف، أو استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة مناسبة (اتباع إرشادات الشركة المصنعة) وتنفيذ سلسلة بوليميراز كمية النسخ العكسي رد فعل (RT-قبكر) باستخدام كبسولة تفجير محددة لجينات إيبدف (إلى الأمام، جاجتجككجاككتكاكت؛ عكس، جكككجاتاتجتكتتجاج). ينبغي أن تستخدم الخلايا المصابة موك الثقافات كعنصر تحكم.
Representative Results
يمكن استزراع الخلايا بورسال الابتدائي الدجاج حضور CD40L الدجاج
عندما كانت مثقف خلايا بورسال الابتدائي الدجاج حضور chCD40L القابلة للذوبان، ازداد عدد الخلايا أربعة إضعاف من 9.02 × 105 إلى 3.63 x 106 كل مل على مدى فترة 6 أيام، على عكس عندما كان غائبا (ف < 0.05) ( الشكل 1A). بقاء الخلية أيضا أدخلت تحسينات كبيرة، وعلى سبيل المثال من 25% في ثقافة ما بعد يوم 3 في غياب chCD40L إلى 48% حضور chCD40L (ف < 0.05) (الشكل 1B)13.
يمكن دعم خلايا بورسال الابتدائي الدجاج بالنسخ المتماثل لكل خلية ثقافة تكييف وسلالات خبيثة جداً من إيبدف
الثقافات الخلية المصابة بصورية والمصابة كانت ثابتة ح 18 إمكانية، المسمى بجسم [مونوكلونل] ضد VP2 إيبدف وجسم ثانوي مترافق إلى 488 فلور أليكسا، وكونتيرستينيد مع DAPI. الخلايا المصابة أدلة الأسفار الخضراء حول النواة (الشكل 2A)، تمشيا مع وجود إيبدف في السيتوبلازم. وكان هذا واضحا لسلالات اثنين من إيبدف، خلية ثقافة تكييف الضغط و D78 وسلالة خبيثة جداً، UK661 (الشكل 2A). الساعة 5، 18 و 24 و 48 ح بوستينفيكتيون، المستخرجة من الثقافات المصابة الجيش الملكي النيبالي وتعرض ل RT-قبكر مع الإشعال محددة إلى منطقة مصانة من الجينات VP4 إيبدف. التعبير عن VP4 أولاً بتطبيع للجين حفظ البيت وت وثم أعرب عن كتغيير إضعاف بالنسبة إلى عينات وهمية في إجراء تحليل ΔΔCt. زيادة التعبير VP4 إيبدف لنسخ 16,603 في بوستينفيكشن ح 48 مع D78 ونسخ 38,632 في بوستينفيكشن 48 ساعة مع UK661. أخذت معا، تبين هذه البيانات أن الخلايا بورسال الابتدائي الدجاج يمكن أن تدعم النسخ المتماثل لتكييفها مع الثقافة الخلية وضراوة جداً سلالات إيبدف13.
رقم 1: يمكن استزراع الخلايا بورسال الابتدائي الدجاج حضور الدجاج CD40L- كانت مثقف خلايا بورسال الابتدائي الدجاج في وجود أو عدم وجود chCD40L (أسود الحانات والبارات البيضاء، على التوالي). (أ) العدد من الخلايا الحية) و (ب) تم تحديد النسبة المئوية للخلايا قادرة على البقاء في بوستينفيكتيون النقاط الزمنية المشار إليها. البيانات المعروضة ممثل على الأقل ثلاث تجارب نسخ متماثل، أشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري للوسط، وكان يحدد الدلالة الإحصائية باستخدام الطالب إقران تي-اختبار في كل وقت نقطة، * p < 0.05. تم تعديل هذا الرقم مع إذن من دولويتش et al. 13.
رقم 2: الدجاج الخلايا بورسال الأولية يمكن أن تدعم النسخ المتماثل لكل خلية-ثقافة تكييفها وسلالات خبيثة جداً من إيبدف- (أ) الدجاج الابتدائي بورسال الخلايا المصابة بصورية أو المصابين D78 أو UK661 وعينه من كل ثقافة ثابتة، والمسمى وتصويرها: VP2 إيبدف، الأخضر؛ النوى، الأزرق. شريط المقياس = 7 تم استخراج ميكرومتر. (ب) الجيش الملكي النيبالي في بوستينفيكشن النقاط الزمنية المشار إليها، عكس نسخها، واتسع نطاق منطقة مصانة من الجينات VP4 إيبدف طريق PCR الكمي. تغيير سجل10 إضعاف في VP4 تطبيع للجين التدبير المنزلي وت عدد النسخ، وأعرب عن بالنسبة للعينات المصابة موك وفقا للأسلوبΔΔCT –2. البيانات المعروضة ممثل على الأقل ثلاث تجارب نسخ متماثل، وأشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري للوسط. وقد تم تعديل هذا الرقم بإذن من دولويتش et al. 13.
Discussion
في هذه الدراسة، وصف ثقافة ناجحة من الدجاج الخلايا الأولية بورسال السابقين فيفو حضور chCD40L القابلة للذوبان، وتبين أن هذه الخلايا يمكن أن تدعم النسخ المتماثل عبئا الموهنة وسلالة خبيثة جداً من إيبدف. يمكن استخدام هذا النموذج السابقين فيفو لتحديد كيفية استجابة الخلايا إيبدف عدوى13، التي لديها مزايا واضحة على الدراسات في الجسم الحي وفي المختبر .
عند الحصاد فرنك بلجيكي، من المهم عدم ثقب الأمعاء لتجنب التلوث البكتيري للخلايا بورسال معزولة. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم أن عزل الخلايا الأولية في أقرب وقت ممكن بعد الحصاد الجهاز للحد من موت الخلايا. الحاجة إلى استخدام chCD40L حد من هذه التقنية؛ ومع ذلك، يظهر العمل الذي اضطلعت به سوبيس et al. أن استخدام phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) لإطالة أمد بقاء الخلية بورسال بدلاً من chCD40L14 قد تمكن النموذج الذي تعتمده أكبر عدد من المختبرات. ويحدد البروتوكول المشار إليها أعلاه تركيز الأمثل chCD40L تجريبيا، باستزراع خلايا ب أولية في تركيزات مخففة متسلسل الجزيء ومراقبة انتشار الخلايا وقدرتها على البقاء. يمكن أن يكون أحد التعديل المحتمل للبروتوكول لتنقية جزيء chCD40L وإضافة تركيز معين إلى خلية ثقافة وسائل الإعلام لتجنب التقلبات دفعة لدفعة.
وقد أظهرت الدراسات في فيفو أن الإصابة إيبدف التالية، هناك زيادة في التعبير عن الجينات المشاركة في الردود سيتوكين برو التحريضية والردود IFN نوع I والمبرمج في BF5،9،10 . ومع ذلك، بعد الإصابة، هناك تدفق الخلايا التحريضية وخلايا المستجيب تي في فرنك بلجيكي، التي تختلف في الجينات وهم يعربون عن مقارنة ب السكان المصابين بخليه9. ولذلك، من الصعب تفسير استجابة الخلايا المصابة كيف إلى إيبدف. ولمعالجة ذلك، اتسمت بعض المجموعات البحثية النسخي استجابة الخلايا المصابة مع إيبدف في الثقافة16،،من1718،،من1920. تتميز هذه الدراسات في المختبر بأشهر المعالم والنقاط الزمنية بوستينفيكشن. ومع ذلك، اتسمت عادة الدراسات في المختبر في الخلايا الجذعية18أو تنتجها الخلايا الليفية الخلايا16،،من1720 . وفي حين لا يمكن أوفيرينتيربريتيد توفير بعض التبصر في التفاعلات إيبدف الخلية المضيفة، الاعتقاد الحالي أن عدوى الخلايا ب أمر حاسم لأمراض ال إيبدف، ومن ثم أهمية البيانات. قبل السابقين فيفو خلية بورسال الثقافة نموذجنا، تميزت دراسة واحدة فقط استجابة الخلايا ب الخلوية ل الإصابة إيبدف19؛ ومع ذلك، تستخدم هذه الدراسة خط مخلدة بخليه التي تحولت بسبب الإصابة مع ALV، يحد من الاستنتاجات التي يمكن أن تقدم. وفي المقابل، يسمح الطراز السابقين فيفو الإصابة إيبدف الموصوفة هنا الباحثين الاحتفاظ بالمزايا في المختبر الدراسات، مثل تعريف أشهر والنقاط الزمنية، أثناء دراسة التفاعلات بين الفيروس مع خلية المضيف ذات الصلة به. كما يتم الحصول على الخلايا بورسال الأولية من المعافين فرنك بلجيكي الأنسجة، هناك لا التهابات أو تي الخلايا الحالية، ونحن قد أثبتت بالتدفق الخلوي (باستخدام الظروف القياسية)، حفز chCD40L التالية، 97 في المائة من السكان خلية إيجابية بالنسبة علامة الخلية ببو-1 (البيانات لا تظهر). وبالنظر إلى أن 3% الخلايا بو-1 السلبية، سوف تكون مثيرة للاهتمام لتحديد ما إذا كانت هذه الخلايا تصبح مصابة إيبدف واستكشاف التعبير الجيني، ومساهمة لأمراض.
ونحن نتوقع أن نموذج الثقافة الرئيسية الخلية بورسال الدجاج السابقين فيفو يمكن توسيعها أيضا لدراسة التفاعلات المضيف الخلية-فيروس من الفيروسات طردية ب-الخلية الأخرى إصابة الدجاج، مثل ALV أو القس، ويمكن أيضا توسيع نطاق إلى أخرى (أنواع الطيور مثلالبط والديك الرومي). القدرة على ثقافة الخلايا الأولية بورسال السابقين فيفو كما يفتح إمكانية دراسة الجوانب المرضية والكبت المناعي التي تسببها هذه الفيروسات دون الحاجة لتصيب الطيور. دراسات في فيفو يسبب الاعتلال كبيرة، هذا سيكون أثرا كبيرا على استبدال والصقل، والحد من استخدام الحيوانات في البحوث.
وباختصار، السابقين فيفو الدجاج خلية بورسال الأولية الثقافة النموذج الموصوفة هنا لديه إمكانات لتوسيع نطاق فهم كيف إنفلونزا الطيور ب-الخلية فيروسات طردية تتفاعل مع الخلايا المضيفة لها مع تقليل عدد الطيور المستخدمة في فيفو دراسات العدوى. يمكن تطبيق التقنيات متعددة الأجهزة اللمفاوية، فيروسات متعددة، وربما أنواع متعددة من الطيور، مما يجعل من نموذج جذاب التي يمكن أن تسهم في ميادين علم الفيروسات وعلم المناعة إنفلونزا الطيور.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب يود أن يشكر فريق "الخدمات الحيوانية" في معهد بيربرايت لخبرتهم في تفريخ وتربية وإعدام الطيور وخبرة هولت كارولين في إزالة أسيبتيكالي فبريسوس من الجراب. أتال بيهاري يمول عن طريق التكنولوجيا الحيوية ومجلس بحوث العلوم البيولوجية (بسرك) عن طريق منح BBS/E/أنا/00001845، ك. د. يمول عن طريق بسرك عن طريق منحة BBS/E/أنا/00002115، ويمول أ. أ. من خلال "المركز الوطني" الاستبدال والصقل والحد من الحيوانات في البحوث (NC3Rs) عن طريق منح NC/R001138/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 Medium | Merck | R8758-500ML | |
| FBS | gibco by Life Technologies | 10099-141 | heat-inactivate at 56 °C for 1 h |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20 mL) | Thermo Fisher Scientific | 88528 | |
| 0.22 µm Millex-GP Syringe Filter | Merck | F7648 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14060-040 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl22 - MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14180-046 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA) | Merck | 03690-100ML | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX | gibco by Life Technologies | 31980-030 | |
| Chicken Serum | Merck | C5405-100ML | |
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | gibco by Life Technologies | 31350-010 | |
| Insulin-transferrin-sodium-selenite | gibco by Life Technologies | 41400-045 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics GmbH | 11088882001 | |
| 100 µm Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Histopaque-1083 | Merck | 10831-100ML | |
| Trypan Blue solution | Merck | T8154-20ML | |
| Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates | Thermo Fisher Scientific | 163320 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile | Corning | 353047 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Hoerr, F. J.
- Schermuly, J., et al. In vitro model for lytic replication, latency, and transformation of an oncogenic alphaherpesvirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7279-7284 (2015).
- Farhanah, M. I., et al. Bursal immunopathology responses of specific-pathogen-free chickens and red jungle fowl infected with very virulent infectious bursal disease virus. Archives of Virology. , (2018).
- Farhanah, M. I., et al. Bursal transcriptome profiling of different inbred chicken lines reveals key differentially expressed genes at 3 days post-infection with very virulent infectious bursal disease virus. Journal of General Virology. 99 (1), 21-35 (2018).
- Guo, X., et al. Differential expression of the Toll-like receptor pathway and related genes of chicken bursa after experimental infection with infectious bursa disease virus. Archives of Virology. 157 (11), 2189-2199 (2012).
- He, X., et al. Differential Regulation of chTLR3 by Infectious Bursal Disease Viruses with Different Virulence. In Vitro and In Vivo. Viral Immunology. 30 (7), 490-499 (2017).
- Ou, C., et al. Transcription profiles of the responses of chicken bursae of Fabricius to IBDV in different timing phases. Virology Journal. 14 (1), 93 (2017).
- Rasoli, M., et al. Differential modulation of immune response and cytokine profiles in the bursae and spleen of chickens infected with very virulent infectious bursal disease virus. BMC Veterinary Research. 11, 75 (2015).
- Ruby, T., et al. Transcriptional profiling reveals a possible role for the timing of the inflammatory response in determining susceptibility to a viral infection. Journal of Virology. 80 (18), 9207-9216 (2006).
- Smith, J., et al. Analysis of the early immune response to infection by infectious bursal disease virus in chickens differing in their resistance to the disease. Journal of Virology. 89 (5), 2469-2482 (2015).
- Tregaskes, C. A., et al. Conservation of biological properties of the CD40 ligand, CD154 in a non-mammalian vertebrate. Developmental & Comparative Immunology. 29 (4), 361-374 (2005).
- Kothlow, S., et al. CD40 ligand supports the long-term maintenance and differentiation of chicken B cells in culture. Developmental & Comparative Immunology. 32 (9), 1015-1026 (2008).
- Dulwich, K. L., et al. Differential gene expression in chicken primary B cells infected ex vivo with attenuated and very virulent strains of infectious bursal disease virus (IBDV). Journal of General Virology. 98 (12), 2918-2930 (2017).
- Soubies, S. M., et al. Propagation and titration of infectious bursal disease virus, including non-cell-culture-adapted strains, using ex vivo-stimulated chicken bursal cells. Avian Pathology. 47 (2), 179-188 (2018).
- Reed, L., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 494-497 (1938).
- Hui, R. K., Leung, F. C. Differential Expression Profile of Chicken Embryo Fibroblast DF-1 Cells Infected with Cell-Adapted Infectious Bursal Disease Virus. PLoS One. 10 (6), e0111771 (2015).
- Li, Y. P., et al. Transcriptional profiles of chicken embryo cell cultures following infection with infectious bursal disease virus. Archives of Virology. 152 (3), 463-478 (2007).
- Lin, J., et al. Genome-wide profiling of chicken dendritic cell response to infectious bursal disease. BMC Genomics. 17 (1), 878 (2016).
- Quan, R., et al. Transcriptional profiles in bursal B-lymphoid DT40 cells infected with very virulent infectious bursal disease virus. Virology Journal. 14 (1), 7 (2017).
- Wong, R. T., et al. Screening of differentially expressed transcripts in infectious bursal disease virus-induced apoptotic chicken embryonic fibroblasts by using cDNA microarrays. Journal of General Virology. 88 (Pt 6), 1785-1796 (2007).
