Summary
Här beskriver vi isolering av kyckling primära bursal celler från den bursa på Fabricius, kultur och infektion av cellerna med bursal infektionssjukdom virus och kvantifiering av virusreplikation.
Abstract
Bursal infektionssjukdom virus (IBDV) är en birnavirus av ekonomisk betydelse för fjäderfäindustrin. Viruset infekterar B-celler, som orsakar sjuklighet, dödlighet och immunsuppression i infekterade fåglar. I denna studie beskriver vi isolering av kyckling primära bursal celler från den bursa på Fabricius, kultur och infektion av cellerna med IBDV och kvantifiering av virusreplikation. Tillägg av kyckling CD40 ligand ökat betydligt cellproliferation fyrfaldigt över sex dagar av kultur och avsevärt förbättrad cellernas viabilitet. Två stammar av IBDV, en cell-kultur anpassad stam, D78 och en mycket virulent stam, UK661, replikeras i cellkulturer ex vivo . Denna modell kommer att vara till nytta för att bestämma hur celler svarar på IBDV infektion och kommer att möjliggöra en minskning av antalet smittade fåglar används i IBDV patogenes studier. Modellen kan också utvidgas till att omfatta andra virus och skulle kunna tillämpas för olika arter av fåglar.
Introduction
Den globala fjäderfäindustrin är nödvändigt att säkra tillräckligt med mat för ett växande befolkningsgrupp. Immunsuppression är hotet mot livsmedelsförsörjningen och välfärd för drabbade fåglar dock och utgör en viktig ekonomisk utmaning för branschen. Majoriteten av fall av immunsuppression hos kycklingar orsakas av infektion med immunosuppressiva virus, med de mest ansvariga för försämra förvärvad immunitet med en tropism för T- och B-lymfocyter1. Fåglar är majoriteten av B-celler belägna inom ett organ som kallas i bursa på Fabricius (BF). B-celler är mottagliga för infektion med flera immunsuppressiva virus, inklusive de som orsakar Lys, såsom IBDV och Mareks sjukdomvirus (MDV), och de som orsakar omvandling, till exempel aviär leukos virus (ALV) och reticuloendotheliosis virus ( REV).
För att utveckla bättre strategier för kontroll av dessa infektioner, är det viktigt att karakterisera samspelet mellan virus med kyckling B celler. Men när B-celler tas bort från en fågel, överlever de inte bra i ex vivo kultur2, vilket gör det svårt att utföra en grundlig analys av samspelet mellan IBDV med kyckling B celler, eller de tidiga händelser efter ALV eller REV infektion. Därför har många värd cell-virus interaktioner varit studerade i vivo3,4,5,6,7,8,9, 10. Även om dessa studier är informativ, inbegriper de användning av smittade fåglar som lider av sjukdomar som kan vara svår.
Den CD40-liganden är en molekyl som inducerar B cell spridning11. Efter identifiering av genen kodning kyckling CD40L (chCD40L), ett vattenlösligt fusionsprotein var konstruerad som, när de läggs till kultur media, inducerad spridningen av kyckling primära B celler ex vivo12. B-celler som odlas på detta sätt med att stödja replikering av MDV2 och 2017, vi och andra fann att primära bursal celler stimuleras med chCD40L kunde användas som en modell för att studera IBDV replikering13,14hittades i 2015. Här beskriver vi isolering och kultur av kyckling primära bursal celler, infektion av cellerna med IBDV och kvantifiering av virusreplikation. Även om vi beskriver metoden i samband med BF, skulle detta kunna tillämpas på isolat och kultur celler från olika lymfoida organ.
Protocol
Alla förfaranden med djur måste vara etiskt godkända i förväg. I vår institution utförs alla procedurer i enlighet med UK Animal (vetenskapliga förfaranden) Act 1986 under Home Office inrättande, personlig och projektet licenser, efter godkännande av den interna djurskydd och etisk granskning Board (AWERB).
1. beredning av chCD40L
- Kultur HEK 293-msCD8-CD40L celler som stabilt uttrycker en löslig chCD40L konstruera 1 x Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium kompletteras med 10% Värmeinaktiverade (hi) fetalt kalvserum (FCS) och 1 µg/mL puromycin vid 37 ° C i en atmosfär som innehåller 5% CO 2.
Obs: Dessa celler är tillgängliga från Pirbright Institute efter undertecknandet av avtalet lämpliga materiella överföringen. - Dela upp cellerna på en 1:5 täthet när konfluenta. Samla in supernatanten (innehållande den lösliga chCD40L konstruktion) varje gång cellerna delas, Centrifugera det 400 x g för 5 min bort cellulära skräp, och förvara den vid 4 ° C.
- När 500 mL av supernatanten har samlats, pool vätskan och filter-sterilisera det genom ett 0,2 µm filter.
- Koncentrera sig supernatanten med centrifugal protein koncentratorer med en molekylvikt cutoff av 10 K enligt tillverkarens anvisningar. Extrahera koncentrerad supernatanten från varje kolumn, sammanföra det och filter-sterilisera det genom passering genom ett filter med 0,22 µm i sprutan.
- Avgöra den slutliga koncentrationen ska användas i experiment av seriellt späda chCD40L lösningen i 1 x Iscove's modifierade Dulbecco's medium (IMDM) (beskrivs i steg 2,4) och odling primära bursal celler i närvaro av spädningarna. Fastställa antal och andel livskraft celler dagligen i upp till en vecka.
Obs: Den lägsta koncentrationen där cellproliferation och lönsamhet är adekvat är koncentrationen att använda i analysen. Detta är sannolikt att vara mellan 1:20 och 1:50.
2. beredning av lösningar för kyckling primära Bursal Cell isolering
- Bered 1 x Hanks balanserad saltlösning (HBBS) med kalcium (Ca) genom att tillsätta 10 mL 10 x HBBS med Ca 90 ml steril H2O och 0,47 µL av 7,5% NaHCO3.
- Förbereda kollagenas D lager lösning 8 mg/ml i 1 x HBBS med Ca. Filter-sterilisera lösningen genom ett 0,2 µM filter.
Obs: Det är lämpligt att förbereda 5 mL alikvoter och frysa dem vid-20 ° C. - Förbereda 1 x RPMI medium kompletteras med 5% Hej FCS. Förvara materialet vid 4 ° C.
- Förbereda 1 x 500 mL IMDM kompletteras med 8% Hej FCS, 2% Hej kyckling serum, 50 mM β-merkaptoetanol, 50 µL av insulin-transferrin-natrium-selenit, och 1% penicillin/streptomycin. Förvara materialet vid 4 ° C.
Obs: Förbereda alla ovannämnda lösningar i förväg. - Bered 1 x HBBS med Ca. Förvara den på is.
- Förbereda 1 x HBBS utan Ca genom att tillsätta 10 mL 10 x HBBS utan Ca 90 ml steril H2O, 0.47 µL av 7,5% NaHCO3och EDTA med en slutlig koncentration på 10 mM. Förvara lösningen på is.
- Bered 1 x kollagenas D lösning genom att tillsätta 5 mL stamlösning av kollagenas D 13 ml av HBBS med Ca att göra sammanlagt 18 mL. Förvara lösningen på is.
Obs: Förbereda de lösningar som nämns i steg 2.5 – 2.7 på dagen för experimentet.
3. avlägsnande av den Bursa på Fabricius (BF)
- Bak och kläcka kycklingar i en anläggning med lämpliga, godkända och humant slakta dem vid 2 – 3 veckors ålder.
Obs: Använd institute-godkända metoder för avlivning. -
Samla in BF från varje kyckling med aseptisk teknik.
Obs: Använda protokollen på plats vid institutionen.- Stommen i dorsala koordinationsrubbning och sterilisera hud och fjädrar överliggande den buk och bröstkorg med en lösning av 70% etanol, utspädd i vatten.
- Gör en ventrala mittlinjen snitt i bukens nedre del med en steriliserad skalpell eller sax.
- Leta upp den bursa på Fabricius, som är ansluten till kaudala delen av kolon, kraniala till kloaken.
- Med hjälp av steriliserad pincett och sax, klippa i bursa på Fabricius fri från tjocktarmen. Var noga med för att undvika punktering tarmen.
- Placera orgeln i kalla PBS och överföra det till laboratoriet på is.
Obs: primära celler bör isoleras så snart som möjligt efter skörden orgel.
4. isolering av kyckling primära Bursal celler
- Arbetar i ett mikrobiologiskt säkra skåp, tvätta BF åtminstone 3 x 30 mL kall PBS.
- Överför vävnaden till en petriskål (92 mm i diameter, 21 mm i höjd) och tillsätt 5 mL 1 x kollagenas D lösning.
- Med steril sax eller en skalpell blad, skär BF i bitar av mindre än 5 mm i diameter.
- Inkubera i vävnaden vid 37 ° C med periodiska försiktig skakning i 30 min.
Obs: Kollagenas lösningen börjar smälta vävnaden. - Med hjälp av en steril Pasteur-pipett, upprepade gånger att aspirera blandningen för att uppmuntra sönderfall av vävnad. Om det behövs, skär vävnaden i mindre bitar.
- Lägga till en annan 5 mL 1 x kollagenas D lösning i vävnaden och inkubera det vid 37 ° C med periodiska mild agitation för en annan 30 min.
- Upprepa steg 4.6 och 4.7 tills vävnaden är helt smält.
Obs: Det kommer att finnas små korn som inte löser sig vidare. - Passera en 100 µm cell SIL cellsuspensionen i 20 mL av 1 x HBBS utan Ca.
- Centrifugera cellsuspension vid 400 x g i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 mL av 1 x RPMI med 5% FCS.
- Antingen overlay 10 mL cellsuspension ovanpå 5 mL av täthet lutning media som innehåller polysucrose och natrium diatrizoate eller underfång 5 mL täthet lutning media under 10 mL cellsuspension. Se till att det finns ett tydligt gränssnitt mellan två.
- Centrifugera överlägget på 900 x g i 20 min vid 4 ° C. Sänka eller ta bort centrifug avbrottet.
Obs: Cellerna bör bilda ett band på gränssnittet mellan cell media och täthet lutning media. - Med hjälp av en steril Pasteur-pipett, ta bort cellerna och placera dem i kall PBS. Tvätta cellerna 3 x genom centrifugering dem vid 400 x g i 5 min och omblandning dem i kall PBS.
5. kultur av kyckling primära Bursal celler
- Centrifugera cellsuspension vid 400 x g i 5 min och resuspendera dem 1 x komplett IMDM.
- Ta en alikvot av cellsuspensionen, lägga till en Trypan blå lösning och räkna antalet livskraftiga celler som utesluter de blå Trypan. Bestämma antalet celler och procentandel livskraft.
- Centrifugera cellsuspension vid 400 x g i 5 min och återsuspendera det i fullständig IMDM kompletteras med en 1:20 utspädning av kyckling CD40L på en densitet på 1 x 107 celler/mL. Titrera koncentrerad supernatanten innehållande chCD40L för att avgöra den optimala utspädning, som sannolikt kommer att ligga i intervallet av 1:10 till 1:50.
- Odla cellerna i antingen 96 - eller 24-väl-plattorna vid 37 ° C för 48 – 72 h. 96 brunnar flerbrunnsplattor är att föredra framför flatbottnad plattor.
Obs: Cellerna kan också vara odlade vid 40 ° C
6. infektion av kyckling primära Bursal celler med IBDV
- 48 – 72 timmar efter isolering, Tina en alikvot av viruset, vortex provet, och lagra den på is.
- Omsuspendera primära bursal cellerna, ta en 10-µL delmängd av cellsuspensionen, lägga till 10 µL av en Trypan blå lösning och bestämma antalet celler och procentuell viabilitet.
- Späd viruset i 1 x komplett IMDM till lämpliga multiplicityen av infektion (MOI) för att göra viruset inokulum och vortex.
- Centrifugera cellsuspension vid 400 x g i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i det virus inokulatet.
- Inkubera cellsuspension vid 37 ° C för 1 h med periodiska agitation.
- Centrifugera cellsuspension vid 400 x g i 5 min, ta bort det virus inokulatet och tvätta cellerna i 1 x komplett IMDM media.
- Centrifugera cellsuspension vid 400 x g i 5 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i fullständig IMDM media kompletteras med kyckling CD40L på en densitet av 1 x 107 celler per mL.
- Odla cellerna i antingen 96 - eller 24-väl-plattorna vid 37 ° C.
Obs: Cellerna kan också vara odlade vid 40 ° C
7. kvantifiering av IBDV replikering i kyckling primära Bursal celler
- På den önskad tidpunkt angripen, Omsuspendera cellerna, överföra dem till ett lämpligt rör, Centrifugera dem 400 x g i 5 min och skörda supernatanten för virustitrering av antingen plack assay eller TCID50 assay enligt den Reed-Muench metod15.
- Tvätta cellerna i 1 mL PBS och förbereda dem antingen för immunfärgning med en antikropp som är specifik för IBDV, eller extrahera RNA med hjälp av en lämplig kit (efter tillverkarens anvisningar) och utföra omvänd Transkription kvantitativa polymerase chain reaktion (RT-qPCR) med primers som är specifika för en IBDV gen (framåt, GAGGTGGCCGACCTCAACT; Omvänt, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). Mock-infekterade cellkulturer bör användas som en kontroll.
Representative Results
Kyckling primära Bursal celler kan vara odlade i närvaro av kyckling CD40L
När kyckling primära bursal celler odlades i närvaro av lösliga chCD40L, antalet celler ökade fyrfaldigt från 9,02 x 105 3,63 x6 per mL under en period av 6 dagar, till skillnad från när det var frånvarande (p < 0,05) ( Figur 1A). Cellernas viabilitet var också signifikant bättre, till exempel från 25% på dag 3 efter kultur i avsaknad av chCD40L till 48% i närvaro av chCD40L (p < 0,05) (figur 1B)13.
Kyckling primära Bursal celler kan stödja replikering av både Cell-kultur anpassad och mycket virulenta stammar av IBDV
Mock-infekterade och infekterade cellkulturer fastställdes 18 h avsett, märkt med en monoklonal antikropp mot IBDV VP2 och en sekundär antikropp konjugerat till Alexa Fluor 488, och counterstained med DAPI. Infekterade celler hade bevis på grön fluorescens runt kärnan (figur 2A), överensstämmer med förekomsten av IBDV i cytoplasman. Detta var uppenbart för två stammar av IBDV, en cell-kultur anpassad stam, D78 och en mycket virulent stam, UK661 (figur 2A). På 5, 18, 24 och 48 h angripen, var RNA extraherade från infekterade kulturer och genomgå RT-qPCR med primers som är specifika för ett bevarat regionen av IBDV VP4 genen. Uttrycket av VP4 var först normaliserade till städning genen TBP och sedan uttryckt som vik förändring i förhållande till mock prover i en ΔΔCt analys. IBDV VP4 uttryck ökade till 16.603 kopior på 48 h angripen med D78 och 38,632 kopior på 48 h angripen med UK661. Sammantaget visar dessa data att kyckling primära bursal cellerna kan stödja replikering av cell-kultur-anpassat och mycket virulent IBDV stammar13.
Figur 1: kyckling primära bursal celler kan vara odlade i närvaro av kyckling CD40L. Kyckling primära bursal celler odlades i närvaron eller frånvaron av chCD40L (svart barer och vita barer, respektive). (A) antalet levande celler och (B) andelen viabla celler bestämdes vid den angivna tidpunkter angripen. De data som visas är representativa för minst tre replikera experiment, felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet och den statistiska signifikansen bestämdes med hjälp av en parat Students t-test vid varje tidpunkt, * p < 0,05. denna siffra har modifierats med tillstånd från Dulwich o.a. 13.
Figur 2: kyckling primära bursal celler kan stödja replikering av både cell-kultur anpassad och mycket virulenta stammar av IBDV. (A) kyckling primära bursal celler var mock-infekterade eller smittade med antingen D78 eller UK661 och ett prov från varje kultur var fast, märkt och avbildas: IBDV VP2, grön; kärnor, blå. Skalstapeln = 7 µm. (B) RNA extraherades på den angivna tidpunkter angripen, omvänd-transkriberas, och ett bevarat regionen av IBDV VP4 genen förstärktes med kvantitativ PCR. Log10 luckan förändrad VP4 kopienumret var normaliserade till genen TBP städning och uttryckt i förhållande till mock-infekterade prover enligt metoden 2–ΔΔCT . De data som visas är representativa för minst tre replikera experiment och felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Dulwich o.a. 13.
Discussion
I denna studie vi beskriva den framgångsrika kulturen av kyckling primära bursal celler ex vivo i närvaro av lösliga chCD40L och visa att dessa celler kan stödja replikering av en försvagad stam och en mycket virulent stam av IBDV. Detta ex vivo -modell kan användas för att avgöra hur cellerna svarar på en IBDV infektion13, som har tydliga fördelar jämfört i vivo och in vitro- studier.
När avverkning BF, är det viktigt att inte punktera tarmen för att undvika bakteriell kontaminering av isolerade bursal cellerna. Det är dessutom viktigt att isolera de primära cellerna så snart som möjligt efter skörden organ att begränsa celldöd. Behovet av att använda chCD40L är en begränsning av tekniken; arbete som utförs av Soubies et al. visar dock att användningen av phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA) att förlänga bursal cellviabilitet i stället för chCD40L14 kan aktivera modellen antas av ett större antal laboratorier. Protokollet beskrivs ovan bestämmer den optimala koncentrationen av chCD40L empiriskt genom odling primära B-celler i seriellt utspädda koncentrationer av molekylen och observera cellproliferation och livskraft. En potentiell ändring i protokollet kan vara rena chCD40L molekylen och lägga till en viss koncentration till cell kultur media att undvika sats till sats variabilitet.
In vivo -studier har visat att följande IBDV-infektion, finns det en ökning av uttrycket av gener involverade i pro-inflammatorisk cytokin svar, typ I IFN svaren och apoptos i BF5,9,10 . Efter infektion finns det dock en tillströmning av inflammatoriska celler och effektor T-celler i BF, som skiljer sig i generna uttrycker de jämfört med de infektera B cell befolkningen9. Det är därför svårt att tolka hur infekterade celler reagerar på IBDV. För att åtgärda detta, har vissa forskargrupper präglat transkriptionell svaret av celler som smittats med IBDV i kultur16,17,18,19,20. Dessa in vitro- studier har fördelen av väldefinierade MOIs och tidpunkter angripen. In vitro- studier har dock oftast karaktäriserats i fibroblast celler16,17,20 eller dendritiska celler18. Medan vissa insikt värd cell-IBDV-interaktioner, den nuvarande uppfattningen är att infektionen av B-celler är avgörande för patogenesen av IBDV och därmed betydelsen av data kan inte vara overinterpreted. Före vår ex vivo bursal cell kultur modell, hade endast en studie kännetecknas den cellulära Svaren av B-celler till IBDV infektion19; dock utnyttjas denna studie en förevigade B cellinje som förvandlades på grund av infektion med ALV, begränsa de slutsatser som kunde göras. Däremot tillåter den ex vivo -modellen för IBDV infektion beskrivs här forskare att behålla fördelarna med in vitro- studier, som definierade MOIs och tidpunkter, medan du studerar samspelet mellan viruset med dess relevanta värdcellen. Som de primära bursal cellerna fås från oinfekterade BF vävnad, det finns ingen inflammatorisk eller T-celler som är närvarande, och vi har visat genom flödescytometri (med standart villkorar), följande chCD40L stimulering, 97% av cell befolkningen är positivt för B-cell markören Bu-1 (inga data anges). Tanke på att 3% av cellerna är Bu-1 negativa, det ska bli intressant att avgöra om dessa celler bli infekterade med IBDV och utforska deras genuttryck och bidrag till patogenesen.
Vi räknar med att ex vivo kyckling primära bursal cell kultur modellen kan också utvidgas till att studera de mottagande cell-virus interaktioner av andra B-cellslymfom tropic virus infekterar kycklingar, såsom ALV eller REV, och skulle också kunna utvidgas till andra fågelarter ( t.ex., ankor eller kalkoner). Förmågan att kultur primära bursal celler ex vivo också öppnar upp möjligheten att studera aspekter av patogenes och immunsuppression som orsakas av dessa virus utan att infektera fåglar. Eftersom in-vivo studier leda till betydande sjuklighet, har detta en betydande inverkan på ersättning, förfining och minskning av användningen av djur i forskning.
Sammanfattningsvis, ex vivo kyckling primära bursal cell kultur modellen beskrivs här har potential att expandera förståelsen av hur aviär B-cell tropic virus interagerar med deras värdceller samtidigt minska antalet fåglar används i in vivo infektion studier. Teknikerna som kan tillämpas på flera lymfoida organ, flera virus, och potentiellt flera arter av fåglar, vilket gör det till en attraktiv modell som kan bidra till fälten aviär virologi och immunologi.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka teamet från djur tjänster vid Pirbright Institute for sin expertis i kläckning, uppfödning och slakt fåglar och sakkunskapen hos Caroline Holt i aseptiskt bort i bursa på Fabricius. A.B. finansieras genom bioteknik och biologiska vetenskaper forskning rådet (BBSRC) via bevilja BBS/E/jag/00001845, K.D. finansieras genom den BBSRC via UNIVERSITETSSTIPENDIUM BBS/E/jag/00002115 och A.A. finansieras genom nationellt centrum för den Ersättning, förfining och minskning av djur i forskning (NC3Rs) via bevilja NC/R001138/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 Medium | Merck | R8758-500ML | |
| FBS | gibco by Life Technologies | 10099-141 | heat-inactivate at 56 °C for 1 h |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20 mL) | Thermo Fisher Scientific | 88528 | |
| 0.22 µm Millex-GP Syringe Filter | Merck | F7648 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14060-040 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl22 - MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14180-046 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA) | Merck | 03690-100ML | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX | gibco by Life Technologies | 31980-030 | |
| Chicken Serum | Merck | C5405-100ML | |
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | gibco by Life Technologies | 31350-010 | |
| Insulin-transferrin-sodium-selenite | gibco by Life Technologies | 41400-045 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics GmbH | 11088882001 | |
| 100 µm Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Histopaque-1083 | Merck | 10831-100ML | |
| Trypan Blue solution | Merck | T8154-20ML | |
| Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates | Thermo Fisher Scientific | 163320 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile | Corning | 353047 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Hoerr, F. J. Clinical aspects of immunosuppression in poultry. Avian Diseases. 54 (1), 2-15 (2010).
- Schermuly, J., et al. In vitro model for lytic replication, latency, and transformation of an oncogenic alphaherpesvirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7279-7284 (2015).
- Farhanah, M. I., et al. Bursal immunopathology responses of specific-pathogen-free chickens and red jungle fowl infected with very virulent infectious bursal disease virus. Archives of Virology. , (2018).
- Farhanah, M. I., et al. Bursal transcriptome profiling of different inbred chicken lines reveals key differentially expressed genes at 3 days post-infection with very virulent infectious bursal disease virus. Journal of General Virology. 99 (1), 21-35 (2018).
- Guo, X., et al. Differential expression of the Toll-like receptor pathway and related genes of chicken bursa after experimental infection with infectious bursa disease virus. Archives of Virology. 157 (11), 2189-2199 (2012).
- He, X., et al. Differential Regulation of chTLR3 by Infectious Bursal Disease Viruses with Different Virulence. In Vitro and In Vivo. Viral Immunology. 30 (7), 490-499 (2017).
- Ou, C., et al. Transcription profiles of the responses of chicken bursae of Fabricius to IBDV in different timing phases. Virology Journal. 14 (1), 93 (2017).
- Rasoli, M., et al. Differential modulation of immune response and cytokine profiles in the bursae and spleen of chickens infected with very virulent infectious bursal disease virus. BMC Veterinary Research. 11, 75 (2015).
- Ruby, T., et al. Transcriptional profiling reveals a possible role for the timing of the inflammatory response in determining susceptibility to a viral infection. Journal of Virology. 80 (18), 9207-9216 (2006).
- Smith, J., et al. Analysis of the early immune response to infection by infectious bursal disease virus in chickens differing in their resistance to the disease. Journal of Virology. 89 (5), 2469-2482 (2015).
- Tregaskes, C. A., et al. Conservation of biological properties of the CD40 ligand, CD154 in a non-mammalian vertebrate. Developmental & Comparative Immunology. 29 (4), 361-374 (2005).
- Kothlow, S., et al. CD40 ligand supports the long-term maintenance and differentiation of chicken B cells in culture. Developmental & Comparative Immunology. 32 (9), 1015-1026 (2008).
- Dulwich, K. L., et al. Differential gene expression in chicken primary B cells infected ex vivo with attenuated and very virulent strains of infectious bursal disease virus (IBDV). Journal of General Virology. 98 (12), 2918-2930 (2017).
- Soubies, S. M., et al. Propagation and titration of infectious bursal disease virus, including non-cell-culture-adapted strains, using ex vivo-stimulated chicken bursal cells. Avian Pathology. 47 (2), 179-188 (2018).
- Reed, L., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 494-497 (1938).
- Hui, R. K., Leung, F. C. Differential Expression Profile of Chicken Embryo Fibroblast DF-1 Cells Infected with Cell-Adapted Infectious Bursal Disease Virus. PLoS One. 10 (6), e0111771 (2015).
- Li, Y. P., et al. Transcriptional profiles of chicken embryo cell cultures following infection with infectious bursal disease virus. Archives of Virology. 152 (3), 463-478 (2007).
- Lin, J., et al. Genome-wide profiling of chicken dendritic cell response to infectious bursal disease. BMC Genomics. 17 (1), 878 (2016).
- Quan, R., et al. Transcriptional profiles in bursal B-lymphoid DT40 cells infected with very virulent infectious bursal disease virus. Virology Journal. 14 (1), 7 (2017).
- Wong, R. T., et al. Screening of differentially expressed transcripts in infectious bursal disease virus-induced apoptotic chicken embryonic fibroblasts by using cDNA microarrays. Journal of General Virology. 88 (Pt 6), 1785-1796 (2007).
