Målet med denne protokollen er å måle transporttid fluorescently merket mat gjennom tarmen av larver sebrafisk på høy gjennomstrømning måte.
Sebrafisk brukes som alternativ modell organismer for narkotika sikkerhet testing. Fordøyelsessystemet (GI) av sebrafisk har genetisk neuronal og farmakologiske likheter som på pattedyr. GI intoleranse i klinisk testing av narkotika kandidater er vanlig og utgjør en alvorlig trussel mot helse. Testing for GI toksisitet i preklinisk pattedyr modeller kan være dyrt i form av tid, test sammensatte og arbeidskraft. Metoden høy gjennomstrømming presenteres her kan brukes til å forutsi GI sikkerhet problemer. Sammenlignet med pattedyr modeller, gir denne metoden mer hensiktsmessig vurdering testen sammensatte effekter på GI transitt mens du bruker små mengder av sammensatte. I denne metoden, larver sebrafisk (7 dager etter befruktning) fôres mat som inneholder en fluorescerende etikett. Etter mating, er hver larver fisk plassert i et godt av en 96-koniske-bunn-godt plate og dosert test sammensatte (oppløst i vann) eller bilen. Gut transitt oppstår, fecal materie akkumuleres på bunnen av brønnene, og hastigheten som dette skjer er overvåket av måle fluorescens fra bunnen av brønnen gjentatte ganger over tid ved hjelp av en plate spektrofotometeret. Fluorescens fra larver i en gitt behandlingsgruppe feltuttrykket og disse verdiene er grafisk sammen med standardfeil, for hvert mål gang, gir en kurve som representerer gjennomsnittet transitt av mat over tid. Effekter på gut transporttid er identifisert ved å sammenligne området under kurven for hver behandling som i gruppen kjøretøy-behandlet. Denne metoden oppdager endringer i sebrafisk GI transittiden indusert av medisiner med kjent klinisk GI effekter; Det kan brukes til å forhøre dusinvis av behandlinger for GI effekter per dag. Som sådan, kan tryggere forbindelser raskt prioriteres for pattedyr testing, som påskynder oppdagelse og proffers 3Rs avansement.
Sebrafisk (Danio rerio) brukes til å modellere virveldyr biologi og forutsi drug giftighet og/eller effekt; nye programmer i disse feltene kommer hvert år. Fordelene med sebrafisk over pattedyr modeller inkluderer deres fruktbarhet, liten størrelse og åpenhet gjennom organogenesen. Sebrafisk brukes til å forutsi stoffet kandidat Akutt toksisitet, så vel som for å vurdere sammensatte innvirkning på organfunksjon, f.eks hjerte, okulær, gastrointestinal (GI)1,2. Sebrafisk utvikling og fysiologi er lik de av pattedyr i mange måter3 80% av gener som er tilknyttet for menneskelig sykdom har en sebrafisk homolog4.
MAGE-tarmkanalen av sebrafisk har lignende fysiologi av pattedyr mage-tarmkanalen, men har en enklere arkitektur5. Sebrafisk har ingen mage; fremre intestinal pære virker som en mat depot. Genuttrykk i sebrafisk tarmen har mange likheter som i pattedyr5. Som pattedyr, enteric nervesystemet av sebrafisk kontroller gut motilitet og intestinal gir speil som andre virveldyr6,7. Basert på disse likhetene, har funksjonelle lidelser av menneskelige tarmen blitt studert hos sebrafisk, ved hjelp av metoder fra pattedyr modeller8.
GI intoleranse i klinisk testing av narkotika kandidater er vanlig og utgjør en alvorlig trussel mot helse. En gjennomgang av programmer i et stort farmasøytisk selskap under 2005-2010 avslørte GI sikkerhet som den viktigste årsaken til 9% av klinisk studie oppsigelser9. Testing for GI toksisitet i preklinisk pattedyr modeller kan være dyrt i form av tid, sammensatte, og arbeidskraft. En prediktiv høy gjennomstrømming analysen for GI transitt kan gi fleksibilitet til sammensatte toksisitet testing, og levere 3Rs effekt. En ny metode tilbyr slike analysen presenteres av protokollen beskrevet her. Denne høy gjennomstrømming analysen kan være ansatt tidlig i utviklingen å prioritere kandidater, og bidrar til reduksjon av GI sikkerhet testing i større arter.
Romanen spectrophotometry metode for å måle sebrafisk Larvene GI transittiden, presenteres her, er en effektiv analyse som kan forutsi behandling effekter på pattedyr GI-funksjon. Selv om analysen har lav følsomhet, har høy positiv predictivity, som er akseptabelt for første tier analyser ansatt paring ned antallet kandidat behandlinger basert på toksisitet12. Denne metoden er lettere å kjøre, har høyere gjennomstrømming og bruker mindre dyr håndtering enn lysstoffrør mikroskopi.
Det er tekniske utfordringer i denne metoden. Fange personlige Larvene etter fôring fluorescerende maten og overfører dem til individuelle brønner er utfordrende først. Men med praksis, kan en dyktig tekniker fylle en 96-brønns plate i mindre enn 15 minutter. Hvis du på et gitt tidspunkt, platen er tilfeldigvis ristet og fecal saken uoppgjorte fra bunnen av brønnene før, vises akkumulering å redusere. Dette kan unngås ved å flytte plate(s) nøye, uten risting. I vår erfaring, normal bevegelighet, inkludert plate spektrofotometer motorized tegner, ikke forstyrr analysen. Plate lesere utstyrt med en ovn (i.e.platen har ikke skal returneres til inkubator mellom målinger), og ligger nær analysen lab-benken kan optimalisere for lavere sjanse for forstyrrelser, men dette var ikke nødvendig i vår erfaring.
Tidlige forsøk på metoden gjorde ikke inkluderer fôring på dagene før analysen. Uten disse “praksis” feedings brukt lavere antall Larvene tilstrekkelig fluorescerende mat i tiden tillot før behandling søknad. I oppringingsforsøk, variasjon i behandlingsgrupper var større og mer data var ubrukelig på grunn av lav/ingen signalet opphopning over tid. Selv med praksis fôring, noen larver forbruke ikke tilstrekkelig mengder fluorescerende maten, unntatt data fra disse Larvene reduserer variasjon i grupper og øker evnen til å identifisere behandling effekter. Starter med større gruppe størrelser (dvs. 24 versus 12) gir tilstrekkelig antall Larvene bidra nyttige data til analyse.
Den fluoriserende mikroskopi avslører at mat transitt var nesten komplett av 24 h i atropin-behandlet Larvene (vises ikke), men microplate data fra det siste tidspunktet gjenspeiler lavere siste signal i gruppen atropin sammenlignet kjøretøy gruppe. Derimot var høyere endelige microplate fluorescens forbundet med behandlinger som akselerert transittiden, selv om bilen-behandlet Larvene har tilsynelatende kansellert sin mage-tarmkanalen før det siste tidspunktet. Basert på tilfeldig oppdraget til behandling av Larvene matet fluorescerende mat, antar vi tilsvarende forbruk av fluorescerende mat, gjennomsnittlig behandling grupper. Gitt dette, og basert på mønstre beskrevet ovenfor, fluorescens fra avføring avslår tidsbruk i larver GI skrift eller raskere transitt legger fluorescens avføring liksom. Den faktiske årsaken er ukjent og har ikke blitt avhørt, men analysen fortsatt er i stand til å måle og sammenligne transittiden grupper.
Bruken av denne metoden oppdage giftige GI effekter fra små molekyl forbindelser er ettall søknad. Andre mulige programmer inkluderer sykdom modellering (f.eks, irritabel tarm syndrom) og romanen terapi oppdagelsen for slike sykdommer eller oppdage pro-kinetisk forbindelser. Videre kan sammen med transgene modeller, denne metoden brukes til å forhøre rolle genene i normal GI transitt, samt transitt lidelser, inkludert enteric Nevron mangel. Sebrafisk Larven tilbyr en hele organismen plattform på en skala som tilnærmet som cellen dyrking, men siden det er flere vev og utallige celletyper fungerer sammen i sebrafisk, biologi spørsmål kan være spurt og besvart benytter denne modell.
Med fremskritt innen teknologi og nye anvendelser derav, vil effektivitet for sebrafisk toksisitet tester fortsette å forbedre. Larver sebrafisk metoder og analyser fortsetter å forbedre i form av høyere gjennomstrømming13,14. Romanen metoden som presenteres her er et eksempel på en forbedring som kan gjøre sebrafisk studier mer slagkraftige.
The authors have nothing to disclose.
Simon Cassar av carpetbones.com designet og skapt den animert figuren som viser i-livet prosedyren til GI transitt analysen.
Wild type zebrafish breeding pair | Various sources – for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
1.7-liter Breeding Tank – Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |