इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक उच्च प्रवाह फैशन में लार्वा zebrafish के पेट के माध्यम से फ्लोरोसेंट लेबल भोजन के पारगमन समय को मापने के लिए है ।
Zebrafish दवा सुरक्षा परीक्षण के लिए वैकल्पिक मॉडल जीवों के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं । zebrafish के जठरांत्र (सैनिक) पथ आनुवंशिक, न्यूरॉन, और स्तनधारियों की है कि औषधीय समानताएं है । दवा उंमीदवारों के नैदानिक परीक्षण के दौरान सैनिक असहिष्णुता आम है और मानव स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा पैदा कर सकता है । नैदानिक स्तनधारी मॉडल में सैनिक विषाक्तता के लिए परीक्षण समय के मामले में महंगा हो सकता है, परीक्षण यौगिक, और श्रम. यहां प्रस्तुत उच्च प्रवाह विधि सैनिक सुरक्षा के मुद्दों का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । स्तनधारी मॉडल की तुलना में, इस विधि यौगिक की कम मात्रा का उपयोग करते हुए सैनिक पारगमन पर परीक्षण यौगिक प्रभाव के अधिक समीचीन मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । इस विधि में, लार्वा zebrafish (7 दिनों के बाद निषेचन) एक फ्लोरोसेंट लेबल युक्त खाना खिलाया जाता है । भोजन के बाद, प्रत्येक लार्वा मछली एक कुआं में रखा जाता है एक ९६-शंकु के नीचे अच्छी तरह से प्लेट और परीक्षण यौगिक के साथ खुराक (पानी में घुल) या वाहन. के रूप में आंत पारगमन होता है, मल के कुओं के तल पर जमा होता है, और दर जिस पर यह होता है पर अच्छी तरह से बार-बार एक प्लेट spectrophotometer का उपयोग कर के तल से प्रतिदीप्ति को मापने के द्वारा निगरानी की जाती है । एक दिया उपचार समूह में लार्वा से प्रतिदीप्ति औसत और इन मूल्यों मानक त्रुटि के साथ ग्राफी कर रहे हैं, प्रत्येक माप समय के लिए, एक समय के साथ भोजन की औसत पारगमन का प्रतिनिधित्व वक्र उपज । आंत पारगमन समय पर प्रभाव वाहन-इलाज समूह के लिए प्रत्येक उपचार समूह के लिए वक्र के तहत क्षेत्र की तुलना करके पहचाने जाते हैं । इस विधि ज्ञात नैदानिक सैनिक प्रभाव के साथ दवाओं द्वारा प्रेरित zebrafish सैनिक पारगमन समय में परिवर्तन का पता लगाया; यह प्रति दिन सैनिक प्रभाव के लिए उपचार के दर्जनों पूछताछ करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । जैसे, सुरक्षित यौगिकों जल्दी स्तनधारी परीक्षण, जो खोज और proffers 3Rs उन्नति में तेजी लाने के लिए प्राथमिकता हो सकती है.
Zebrafish (ढाणियो rerio) हड्डीवाला जीवविज्ञान मॉडल और दवा विषाक्तता की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं और/ इन क्षेत्रों में नए आवेदन हर साल उभर रहे हैं । स्तनधारी मॉडल पर zebrafish के लाभ उनके fecundity, छोटे आकार, और पारदर्शिता organogenesis के माध्यम से शामिल हैं । Zebrafish दवा उंमीदवार तीव्र विषाक्तता की भविष्यवाणी करने के लिए, साथ ही अंग समारोह पर यौगिक प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है, जैसे , कार्डियक, नेत्र, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (सैनिक)1,2. Zebrafish विकास और फिजियोलॉजी कई मायनों में स्तनधारियों के उन लोगों के समान है3 और ८०% जीन है कि मानव रोग के साथ जुड़े रहे है एक Zebrafish homolog4है ।
zebrafish के सैनिक पथ स्तनधारी सैनिक पथ के लिए समान फिजियोलॉजी है, लेकिन एक सरल वास्तुकला5है । Zebrafish के पास पेट नहीं है; पूर्वकाल आंत्र बल्ब एक खाद्य डिपो के रूप में कार्य करता है । zebrafish आंत में जीन अभिव्यक्ति5स्तनधारियों की है कि कई समानताएं है । स्तनधारियों की तरह, zebrafish नियंत्रण आंत गतिशीलता के दर्जी तंत्रिका तंत्र, और आंत्र इन्नेर्वतिओन दर्पण कि अंय रीढ़6,7। इन समानताओं के आधार पर, मानव आंत के कार्यात्मक विकारों zebrafish में अध्ययन किया गया है, स्तनधारी मॉडल8से व्युत्पंन तरीकों का उपयोग कर ।
दवा उंमीदवारों के नैदानिक परीक्षण के दौरान सैनिक असहिष्णुता आम है और मानव स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा पैदा कर सकता है । 2005 के दौरान एक प्रमुख दवा कंपनी में कार्यक्रमों की समीक्षा-2010 नैदानिक अध्ययन समाप्ति9% के लिए मुख्य कारण के रूप में सैनिक सुरक्षा से पता चला । नैदानिक स्तनधारी मॉडल में सैनिक विषाक्तता के लिए परीक्षण समय, यौगिक, और परिश्रम के मामले में महंगा हो सकता है । एक पूर्वानुमान सैनिक पारगमन के लिए उच्च प्रवाह परख के लिए यौगिक विषाक्तता परीक्षण लचीलापन प्रदान कर सकते हैं, और 3Rs प्रभाव उद्धार । एक उपंयास ऐसी एक परख की पेशकश विधि प्रोटोकॉल द्वारा प्रस्तुत की गई है यहां वर्णित है । इस उच्च प्रवाह परख दवा के विकास में जल्दी नियोजित किया जा सकता है उंमीदवारों को प्राथमिकता है, और बड़ी प्रजातियों में सैनिक सुरक्षा परीक्षण की कमी में योगदान ।
zebrafish लार्वा सैनिक पारगमन समय को मापने के लिए उपंयास spectrophotometry विधि, यहां प्रस्तुत है, एक कुशल परख कि स्तनधारी सैनिक पर उपचार प्रभाव-समारोह की भविष्यवाणी कर सकते है । हालांकि परख कम संवेदनशीलता है, यह उच्च सकारात्मक predictivity है, जो प्रथम स्तर के उंमीदवार विषाक्तता12के आधार पर उपचार की संख्या नीचे कतरन के लिए कार्यरत परख के लिए स्वीकार्य है । इस विधि को क्रियांवित करने के लिए आसान है, उच्च प्रवाह है, और कम फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी से निपटने के पशु हैंडलिंग कदम का उपयोग करता है ।
इस विधि में निहित तकनीकी चुनौतियां हैं । फ्लोरोसेंट खाना खिलाने और उंहें व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित करने के बाद व्यक्तिगत लार्वा को पकड़ने पहली बार में चुनौती दे रहा है । हालांकि, अभ्यास के साथ, एक कुशल तकनीशियन से कम 15 मिनट में एक ९६ अच्छी तरह से थाली भर सकते हैं । यदि, किसी दिए गए समय बिंदु पर, प्लेट अकस्मात हिल रहा है और मल की बात पढ़ने से पहले कुएँ के नीचे से बसाया, संचय में कमी दिखाई देगी. इस प्लेट (ओं) को ध्यान से हिलाने के बिना, ले जाने से बचा जा सकता है । हमारे अनुभव में, कि थाली spectrophotometer मोटर दराज के सहित सामांय आंदोलन, परख परेशान नहीं किया । प्लेट एक हीटर के साथ सुसज्जित पाठकों (यानी, प्लेट को माप के बीच मशीन को लौट नहीं है), और परख प्रयोगशाला बेंच के पास स्थित अशांति की कम संभावना के लिए अनुकूलित सकता है, लेकिन यह हमारे अनुभव में आवश्यक नहीं था ।
विधि में प्रारंभिक प्रयासों को परख के पहले दिन पर खिला शामिल नहीं था । उन ‘ अभ्यास ‘ भक्षण के बिना, लार्वा की कम संख्या उपचार आवेदन से पहले की अनुमति दी समय के दौरान पर्याप्त फ्लोरोसेंट भोजन का सेवन किया । उन प्रयासों में, उपचार समूहों के भीतर भिन्नता अधिक थी, और समय के साथ कम/कोई संकेत संचय के कारण अधिक डेटा अनुपयोगी था । यहां तक कि अभ्यास खिलाने के साथ, कुछ लार्वा फ्लोरोसेंट भोजन की पर्याप्त मात्रा का उपभोग नहीं करते, उन लार्वा से डेटा को छोड़कर समूहों के भीतर भिन्नता कम हो जाती है और उपचार प्रभाव की पहचान करने की क्षमता बढ़ जाती है । बड़ा समूह आकार के साथ शुरू (यानी, 24 बनाम 12) लार्वा की पर्याप्त संख्या के लिए अनुमति देता है विश्लेषण करने के लिए उपयोगी डेटा योगदान ।
फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी से पता चलता है कि भोजन पारगमन लगभग 24 atropine में एच इलाज लार्वा (दिखाया नहीं), लेकिन अंतिम समय बिंदु से microplate डेटा atropine समूह में कम अंतिम संकेत प्रतिबिंबित, वाहन समूह की तुलना में पूरा किया गया । इसके विपरीत, उच्च अंतिम microplate प्रतिदीप्ति उपचार है कि त्वरित पारगमन समय के साथ जुड़ा हुआ था, भले ही वाहन का इलाज लार्वा जाहिरा तौर पर अंतिम समय बिंदु से पहले अपने सैनिक पथ voided है । यादृच्छिक काम पर आधारित लार्वा का उपचार करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट भोजन के समतुल्य खपत, औसत पर, उपचार समूहों के बीच ग्रहण । इस को देखते हुए, और ऊपर वर्णित पैटर्न के आधार पर, मल बात से प्रतिदीप्ति लार्वा सैनिक पथ या तेजी से पारगमन में खर्च समय के साथ गिरावट आती है मल को किसी भी तरह प्रतिदीप्ति कहते हैं । वास्तविक कारण अज्ञात है और पूछताछ नहीं किया गया है, लेकिन परख अभी भी मापने और समूहों के बीच पारगमन समय की तुलना करने में सक्षम है ।
छोटे अणु यौगिकों से विषाक्त सैनिक प्रभाव का पता लगाने में इस पद्धति का रोजगार एक आवेदन है. अन्य संभव अनुप्रयोगों में शामिल हैं रोग मॉडलिंग (जैसे, चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम) और इस तरह के रोगों के लिए उपन्यास चिकित्सा खोज, या प्रो-काइनेटिक यौगिकों की खोज के लिए. इसके अलावा, ट्रांसजेनिक मॉडल के साथ युग्मित, इस विधि के लिए सामांय सैनिक पारगमन में जीन की भूमिका, साथ ही साथ पारगमन विकारों, प्रवेश ंयूरॉन कमी सहित पूछताछ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । zebrafish लार्वा एक पैमाने पर एक पूरे जीव मंच प्रदान करता है कि अनुमानित है कि सेल संवर्धन, लेकिन बाद से वहां कई ऊतकों और असंख्य कोशिका zebrafish में एक साथ कार्य प्रकार, सिस्टंस जीवविज्ञान प्रश्न और कहा जा सकता है इस का उपयोग कर जवाब मॉडल.
प्रौद्योगिकी के रूप में प्रगति के साथ, और उसके नए अनुप्रयोगों, zebrafish विषाक्तता परीक्षण के संचालन में दक्षता में सुधार जारी रहेगा । लार्वा zebrafish हैंडलिंग तरीकों और परख के लिए उच्च प्रवाह13,14के मामले में सुधार जारी है । उपंयास विधि यहां प्रस्तुत एक सुधार है कि zebrafish अध्ययन कर सकते है और अधिक प्रभाव का एक उदाहरण है ।
The authors have nothing to disclose.
शमौन carpetbones.com के Cassar डिजाइन और एनिमेटेड के लिए सैनिक पारगमन परख के जीवन की प्रक्रिया को प्रदर्शित करते थे आंकड़ा बनाया ।
Wild type zebrafish breeding pair | Various sources – for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
1.7-liter Breeding Tank – Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |