L’obiettivo del presente protocollo è quello di misurare il tempo di transito di fluorescente contrassegnato cibo attraverso l’intestino di zebrafish larvale in modo elevato throughput.
Zebrafish sono utilizzati come organismi modello alternativo per droga test di sicurezza. Tratto gastrointestinale (GI) di zebrafish ha somiglianze genetiche, neuronali e farmacologiche a quello dei mammiferi. L’intolleranza GI durante la sperimentazione clinica dei farmaci candidati è comune e può rappresentare una grave minaccia per la salute umana. Prove di tossicità GI in modelli preclinici di mammiferi può essere costosa in termini di tempo, composto in esame e manodopera. Il metodo di alto-rendimento qui presentato può essere utilizzato per prevedere i problemi di sicurezza di GI. Rispetto ai modelli dei mammiferi, questo metodo consente piu ‘ opportuno valutazione di prova effetti composti su GI transito durante l’utilizzo di basse quantità di composto. In questo metodo, zebrafish larvale (7 giorni dopo la fecondazione) vengono nutriti con cibo contenente un’etichetta fluorescente. Dopo la poppata, ogni pesce larvale è collocato in un pozzetto di una piastra a 96-conico-fondo-pozzetti e dosato con composto in esame (disciolto in acqua) o il veicolo. Come transito intestinale si verifica, materia fecale si accumula sul fondo dei pozzi e il tasso a cui questo accade è monitorato misurando fluorescenza dal fondo del pozzo ripetutamente nel tempo utilizzando uno spettrofotometro di piastra. La fluorescenza da larve in un gruppo dato trattamento sono media e questi valori sono rappresentati graficamente con errore standard, per ogni tempo di misura, producendo una curva che rappresenta la media transito del cibo nel corso del tempo. Effetti sul tempo di transito dell’intestino sono identificati confrontando l’area sotto la curva per ciascun gruppo di trattamento a quello del gruppo veicolo-trattato. Questo metodo ha rilevato modifiche nel tempo di transito di zebrafish GI indotto da farmaci con effetti clinici conosciuti di GI; può essere impiegato per interrogare decine di trattamenti per GI effetti al giorno. Come tale, composti più sicuri possono essere rapidamente la priorità per il test dei mammiferi, che accelera l’avanzamento di 3Rs scoperta e porge.
Zebrafish (Danio rerio) vengono utilizzati per modellare la biologia dei vertebrati e prevedere la tossicità dei farmaci e/o efficacia; nuove applicazioni in questi campi emergono ogni anno. I vantaggi di zebrafish sopra modelli mammiferi comprendono la loro fecondità, piccole dimensioni e la trasparenza attraverso l’organogenesi. Zebrafish sono usati per predire candidato acuta tossicità dei farmaci, nonché valutare composto impatto sulla funzione dell’organo, per esempio, cardiaco, oculare, gastrointestinale (GI)1,2. Fisiologia e sviluppo di Zebrafish sono simili a quelli dei mammiferi in molti modi3 e 80% dei geni che sono associati con la malattia umana hanno un omologo di zebrafish4.
Il tratto di GI di zebrafish fisiologia simile tratto gastrointestinale dei mammiferi ma ha un’ architettura più semplice5. Zebrafish non hanno nessun stomaco; la lampadina anteriore intestinale agisce come un deposito di cibo. Espressione genica in zebrafish intestino ha molte similitudini con quello del mammifero5. Come mammiferi, del sistema nervoso enterico di zebrafish controlla la motilità dell’intestino e innervazione intestinale rispecchia quella di altri vertebrati6,7. Basandosi su queste somiglianze, disturbi funzionali dell’intestino umano sono state studiate in zebrafish, utilizzando metodi derivati da modelli mammiferi8.
L’intolleranza GI durante la sperimentazione clinica dei farmaci candidati è comune e può rappresentare una grave minaccia per la salute umana. Una revisione dei programmi in un’importante azienda farmaceutica nel corso del 2005 – 2010 ha rivelato GI sicurezza come la causa principale di studio clinico terminazioni9il 9%. Prove di tossicità GI in modelli preclinici di mammiferi può essere costosa in termini di tempo, composto e del lavoro. Un’analisi di alto-rendimento predittiva per transito GI può fornire flessibilità per compound test di tossicità e fornire 3Rs impatto. Un metodo novello che offre tale prova è presentato dal protocollo descritto nel presente documento. Questo test di alto-rendimento potrebbe essere impiegato presto nello sviluppo di farmaci per prioritizzare i candidati e contribuire alla riduzione della sicurezza GI test nelle specie più grandi.
Il metodo di romanzo spettrofotometria per misurare il tempo di transito di zebrafish larve GI, qui presentato, è un’analisi efficiente che può predire gli effetti del trattamento su mammiferi GI-funzione. Anche se il saggio ha bassa sensibilità, ha alta predittività positiva, che è accettabile per primo livello dosaggi impiegati per paring giù il numero di candidati trattamenti basati su tossicità12. Questo metodo è più facile da eseguire, ha un throughput più elevato e utilizza meno animale gestire passaggi di microscopia fluorescente.
Ci sono sfide tecniche inerenti a questo metodo. Cattura di larve individuale dopo l’alimentazione il cibo fluorescente e trasferirli in singoli pozzetti è difficile all’inizio. Tuttavia, con la pratica, un tecnico specializzato può riempire una piastra a 96 pozzetti in meno di 15 min. Se, in un punto determinato momento, la piastra è accidentalmente scosso e sconvolto la materia fecale dal fondo dei pozzi prima della lettura, l’accumulo sembrano diminuire. Questo può essere evitato spostando le piastre con attenzione, senza agitazione. Nella nostra esperienza, movimento normale, compresa quella del cassetto motorizzato piastra spettrofotometro, non disturbare il dosaggio. Piastra di lettori dotati di un riscaldatore (cioè, la piastra non sono da restituire all’incubatore tra misurazioni) e si trova vicino il dosaggio banco di laboratorio potrebbe ottimizzare per minore probabilità di dispersione, ma questo non era necessario nella nostra esperienza.
I primi tentativi il metodo non hanno incluso alimentazione nei giorni che precedono il test. Senza quelle poppate ‘pratica’, i numeri più bassi delle larve consumato cibo sufficiente fluorescente durante il tempo consentito prima dell’applicazione del trattamento. In quei tentativi, variazione all’interno di gruppi di trattamento era maggiore, e più dati erano inutilizzabili a causa di accumulo di basso/no segnale nel tempo. Anche con la pratica di alimentazione, alcune larve non consumano una quantità sufficiente di cibo fluorescente, escludendo i dati da tali larve diminuisce variazione all’interno di gruppi e aumenta la capacità di identificare gli effetti del trattamento. A partire con dimensioni maggiori di gruppo (cioè, 24 contro 12) consente un numero sufficiente di larve contribuendo dati utili all’analisi.
La microscopia fluorescente rivela che transito di cibo era quasi completa di 24 h in larve atropina-trattati (non mostrato), tuttavia i dati di micropiastre dal punto finale tempo rifletteranno segnale finale inferiore nel gruppo atropina, rispetto al gruppo di veicolo. Al contrario, maggiore finale micropiastra fluorescenza è stato associato con trattamenti che ha accelerato i tempi di transito, anche se le larve di veicolo-trattati hanno apparentemente annullata loro tratto di GI prima del punto di tempo finale. Basato sull’assegnazione casuale al trattamento delle larve nutrite con cibi fluorescenti, assumiamo equivalente consumo dell’alimento fluorescente, in media, tra i gruppi di trattamento. Dato questo e sulla base degli schemi descritti sopra, fluorescenza da materia fecale diminuisce con il tempo trascorso nel tratto GI larvale o transito più veloce aggiunge fluorescenza per le feci, in qualche modo. La vera causa è sconosciuta e non è stata interrogata, tuttavia ancora il dosaggio è in grado di misurare e comparare il tempo di transito tra gruppi.
L’impiego di questo metodo nella rilevazione di effetti tossici di GI da composti di piccola molecola è una sola applicazione. Altre possibili applicazioni includono modellazione di malattia (ad es., sindrome dell’intestino irritabile) e scoperta nuova terapia per tali malattie, o di scoperta composti pro-cinetico. Inoltre, accoppiato con modelli transgenici, questo metodo potrebbe essere utilizzato per interrogare il ruolo dei geni nella normale transito GI, come pure disturbi del transito, compreso la carenza di neuroni enterici. La larva di pesce zebra offre una piattaforma di tutto l’organismo su una scala che si approssima a quella della coltura delle cellule, ma poiché ci sono più tipi di cella una miriade funzionamento insieme in zebrafish e tessuti, domande di biologia di sistemi possono essere chiesto e ha risposto utilizzando questo modello.
Con gli avanzamenti nella tecnologia e nuove applicazioni della stessa, l’efficienza nello svolgimento delle prove di tossicità di zebrafish continuerà a migliorare. Zebrafish larvale manipolazione metodi e saggi stanno continuando a migliorare in termini di maggiore velocità effettiva13,14. Il romanzo metodo presentato qui è un esempio di un miglioramento che può fare studi di zebrafish più incisivo.
The authors have nothing to disclose.
Simon Cassar di carpetbones.com progettato e creato la figura animata utilizzata per illustrare la procedura di in-vita del dosaggio transito GI.
Wild type zebrafish breeding pair | Various sources – for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
1.7-liter Breeding Tank – Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |