Målet med detta protokoll är att mäta transittiden av fluorescently märkta livsmedel genom tarmen av larval zebrafiskar i en hög genomströmning mode.
Zebrafiskar används som alternativa modellorganismer för drogtester av säkerhet. Mag-(GI) tarmkanalen av zebrafisk har genetiska, neuronala och farmakologiska likheter som däggdjur. GASTROINTESTINAL intolerans under klinisk testning av läkemedelskandidater är vanligt och kan utgöra ett allvarligt hot mot människors hälsa. Testning för GI-toxicitet i prekliniska däggdjur modeller kan vara dyrt i form av tid, test förening och arbetskraft. Hög genomströmning metoden presenteras här kan användas för att förutsäga GI säkerhetsfrågor. Jämfört med däggdjur modeller, möjliggör denna metod mer ändamålsenlig bedömning av testet sammansatta effekter på GI transit samtidigt använder små mängder av förening. I denna metod, larval zebrafiskar (7 dagar efter befruktning) utfodras med mat som innehåller en fluorescerande etikett. Efter utfodring, varje larval fisk placeras i en bra 96-koniska-botten-bra platta och doseras med test förening (upplöst i vatten) eller fordonet. Som tarm transit inträffar avföring ansamlas på botten av brunnarna och andelen som detta händer övervakas genom att mäta fluorescens från botten av brunnen upprepade gånger över tid med hjälp av en tallrik-spektrofotometer. Fluorescensen från larver i en viss behandlingsgrupp är i genomsnitt och dessa värden återgivningsegenskaper tillsammans med standardfel, för varje mätning, vilket ger en kurva som representerar genomsnittliga transitering av mat över tid. Effekter på tarmen transittid identifieras genom att jämföra arean under kurvan för varje behandlingsgrupp som fordonet-behandlade gruppen. Denna metod upptäckte ändringar i zebrafiskar GI transittid induceras av läkemedel med kända kliniska GI effekter; Det kan användas för att förhöra dussintals behandlingar för GI effekter per dag. Som sådan, kan säkrare föreningar snabbt prioriteras för däggdjur testning, vilket underlättar identifiering och visar istället 3R avancemang.
Sebrafisken (Danio rerio) används för att modellera ryggradsdjur biologi och förutsäga drug toxicitet och/eller effekt. nya tillämpningar inom dessa områden växer fram varje år. Fördelarna med zebrafiskar över däggdjur modeller inkluderar deras fruktsamhet, liten storlek och öppenhet genom organogenes. Zebrafisk är används för att förutsäga drog kandidat akut toxicitet, samt för att bedöma sammansatta inverkan på organfunktion, t.ex., hjärt, okulär, gastrointestinal (GI)1,2. Zebrafiskar utveckling och fysiologi är liknande till de av däggdjur i många sätt3 och 80% av gener som är associerade med mänskliga sjukdomar har en zebrafiskar homolog4.
MAG-tarmkanalen av zebrafisk har liknande fysiologi till däggdjur magtarmkanalen men har en enklare arkitektur5. Zebrafisk har ingen mage; den främre intestinal lampan fungerar som en mat-depå. Genuttryck i zebrafiskar tarmen har många likheter med de däggdjur5. Det enteriska nervsystemet hos zebrafiskar styr gut motilitet som däggdjur, och tarmens innervation speglar med andra ryggradsdjur6,7. Baserat på dessa likheter, har funktionella störningar av mänskliga tarmen studerats hos zebrafiskar, med metoder som härrör från däggdjur modeller8.
GASTROINTESTINAL intolerans under klinisk testning av läkemedelskandidater är vanligt och kan utgöra ett allvarligt hot mot människors hälsa. En översyn av program i ett större läkemedelsföretag under 2005 – 2010 avslöjade GI säkerhet som den främsta orsaken för 9% av klinisk studie avslutningar9. Testning för GI-toxicitet i prekliniska däggdjur modeller kan vara dyrt i form av tid, sammansatta och labor. En förutsägande högt dataflöde test för GI transit kan ge flexibilitet att sammansatta toxicitetstester och leverera 3R inverkan. En roman metod som erbjuder en sådan analys presenteras av det protokoll som beskrivs häri. Denna hög genomströmning analys kan användas tidigt i läkemedelsutveckling att prioritera kandidater och bidra till en minskning av GI säkerhet tester i större arter.
Romanen spektrofotometri metoden för att mäta zebrafiskar larver GI transittid, presenteras här, är ett effektivt test som kan förutsäga behandlingseffekter på däggdjur GI-funktion. Analysen har låg känslighet, har men hög positiv prediktivitet, som är godtagbar för första nivån analyser används för att para ihop ned antalet kandidat behandlingar baserade på toxicitet12. Denna metod är enklare att utföra, har högre genomströmning och använder mindre djurhantering steg än fluorescerande mikroskopi.
Tekniska utmaningar finns inneboende i denna metod. Att fånga enskilda larver efter utfodringen den fluorescerande mat och överföra dem till enskilda brunnar är utmanande först. Men med övning, kan en skicklig tekniker fylla en plattan med 96 brunnar i mindre än 15 min. Om, vid en given tidpunkt, plattan skakas av misstag och avföring oreglerade från botten av brunnarna före behandlingen, kommer ansamling verkar minska. Detta kan undvikas genom att flytta skylt(ar) noggrant, utan att skaka. Vår erfarenhet har normal rörlighet, bland annat av plattan spektrofotometer motoriserad lådan, störde inte analysen. Tavla läsare utrustad med en värmare (dvshar inte plattan återlämnas till inkubatorn mellan mätningar), och ligger nära analysen labbet bänk kunde optimera för lägre chans att störning, men detta inte var nödvändigt i vår erfarenhet.
Tidiga försök på metoden innehöll inte livnär sig på dagarna före analysen. Utan dessa ‘praktik’ matning förbrukas lägre antalet yngel tillräckligt fluorescerande mat under den tid som tillåts innan behandling program. I dessa försök, variation inom grupperna var större och mer data var oanvändbart på grund av låg/ingen signal ackumuleras över tiden. Även med praktiken utfodring, vissa larver konsumera inte tillräckliga mängder av fluorescerande maten, exklusive data från de larverna minskar variationen inom grupperna och ökar förmågan att identifiera behandlingseffekter. Börjar med större gruppstorlekar (dvs 24 kontra 12) möjliggör tillräckligt antal larver bidrar med användbar data till analysen.
Den fluorescerande mikroskopi avslöjar att mat transit var nästan komplett genom 24 h i atropin-behandlade larver (visas inte), men de mikroplattan data från den slutliga tidpunkten speglar lägre finalen signalerar i gruppen atropin jämfört med vehikelgruppen. Omvänt, högre slutliga mikroplattan fluorescens förknippades med behandlingar som accelererade transittid, även om fordonet-behandlade larver har tydligen annullerat sin mag-tarmkanalen innan den slutliga tidpunkten. Baserat på slumpmässiga tilldelningen till behandling av larver fluorescerande mat, anta vi motsvarande konsumtion av fluorescerande maten, i genomsnitt mellan behandlingsgrupperna. Mot denna bakgrund, och baserat på de mönster som beskrivs ovan, fluorescens från avföring avtar med tid i larval magtarmkanalen eller snabbare transit lägger till fluorescens avföring på något sätt. Den egentliga orsaken är okänd och har inte varit förhördes, men analysen fortfarande är kapabel att mäta och jämföra transittid bland grupper.
Anställningen av denna metod att upptäcka GI giftverkningar från småmolekylära föreningar är en ansökan. Andra möjliga tillämpningar inkluderar sjukdom modellering (t.ex., colon irritabile) och ny terapi upptäckten för sådana sjukdomar eller för att upptäcka pro-kinetisk föreningar. Dessutom kan tillsammans med transgena modeller, denna metod användas för att förhöra rollen av gener i normala GI transitering samt transit sjukdomar, inklusive enteriska neuron brist. Zebrafiskar larven erbjuder en plattform för hela organismen på en skala som approximerar det av cell odling, men eftersom det finns flera vävnader och otaliga celltyper fungerar tillsammans i zebrafiskar, system biologi frågor kan ställas och besvaras med hjälp av denna modellen.
Med framsteg inom teknik och nya tillämpningar därav, kommer att effektiviteten i genomförandet av zebrafisk toxicitetstester fortsätta att förbättra. Larval zebrafiskar hantering av metoder och analyser fortsätter att förbättras när det gäller högre genomströmning13,14. Den nya metoden som presenteras här är ett exempel på en förbättring som kan göra zebrafiskar studier mer effektfulla.
The authors have nothing to disclose.
Simon Cassar av carpetbones.com utformat och skapat animerade figuren används för att demonstrera i livet förfarandet GI transit analysens.
Wild type zebrafish breeding pair | Various sources – for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
1.7-liter Breeding Tank – Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |