Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لجمع عينات دم من الوريد subclavian الفئران.
Abstract
ومن الضروري جمع الدم بما فيه الكفاية حجم الدم في التجارب على الحيوانات. مقارنة بأساليب أكثر عدوانية أخرى مثل عينة الضفيرة الرجعية-المداري جمع جمع الدم من هذا السياق ذيل من الفئران شعبية وأقل إرهاقاً. ومع ذلك، يقتصر هذا الأسلوب جمع الدم في بعض الأحيان معدل نجاح غير مرضية. وهنا نقدم طريقة لجمع الدم من خلال ثقب الوريد subclavian. يقع في الاتجاه subclavian فقط تحت الترقوة وكبيرة بما يكفي للوفاء بمتطلبات التخزين لجمع الدم ومن هذا المنطلق. وتظهر النتائج التي توصلنا إليها أن هذا الأسلوب آمنة وقابلة للتطبيق للدم جمع العينات مع حجم الدم المطلوب. ويمكن جمع الدم من خلال ثقب الوريد subclavian كأسلوب لجمع دم بديلة في حالة الذيل الفاشلة المنطلق أخذ عينات الدم في الفئران.
Introduction
من الضروري جمع الدم في الأبحاث الحيوانية. وتشمل الأوردة المستهدفة لجمع الدم الضفيرة الرجعية-المداري وحبل الوريد والوريد الصافن، والأوعية الدموية الذيل والشريان السباتي1،2،،من34. في بعض الأحيان، يمكن الحصول على الدم من الشريان الاورطي البطني، أو الوريد الأجوف، أو حتى في قلب5،،من67. في مثل هذه المناسبات، يجب التضحية بالحيوانات ولا يمكن استخدامه للمراقبة اللاحقة؛ وبالتالي، يتم استخدام هذه الأساليب أقل في العمل التجريبي اليومي. يتم جمع الدم من الوريد ذيل الفئران شعبية وأقل إرهاقاً بالمقارنة مع8من الأساليب المذكورة أعلاه.
ومع ذلك، يقتصر جمع الدم من الوريد الذيل أحياناً معدل نجاح غير مرضية. في بعض الأحيان، من الصعب أيضا الحصول على ما يكفي من حجم الدم بهذه الطريقة. كبير بما فيه الكفاية على المنوال subclavian ويقع فقط تحت عظم الترقوة، ثقب الوريد سوبكلافيان يمكن أن تكون طريقة بديلة لأخذ عينات من الدم إذا كانت أساليب جمع الدم الروتينية غير ناجحة. هنا، نحن نقدم وسيلة لجمع الدم عن طريق الوريد subclavian ثقب في الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أقر هذه الدراسة "اللجنة المركزية للأخلاقيات جامعة جنوب" "بحوث الحيوان" من مستشفى إكسيانجيا الثانية (مدينة تشانغشا، الصين). أعدت المخطوطة وفقا سيصلون (بحوث الحيوان: الإبلاغ في فيفو التجارب)9من المبادئ التوجيهية.
1-المادية والحيوانية إعداد
- إعداد المواد المطلوبة: شريط لاصق، عامل نتف الشعر، 75% إيثانول، أنبوب جمع الدم، 2.5 مل حقنه متصلة بإبرة (24 غ، 0.6 مم × 25 مم) وماكينة حلاقة الشعر والجدول الإلكتروني، وقياس (انظر الجدول للمواد).
- استخدام 20 الفئران سبراغ داولي (SD) والذين تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع ووزنها 153 200 ز (انظر الجدول للمواد). الحفاظ على الفئران وفقا للدليل ل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية10.
- بيت الفئران تحت الظروف القياسية مع حرية الوصول إلى الغذاء ومياه الشرب. الاحتفاظ بها في أقفاص2 سم 530 مع الأسرة الخشب-الحلاقة (2 الفئران في قفص). الحفاظ على الحيوانات في درجة حرارة الغرفة درجة الحرارة التي تسيطر على حوالي 25 درجة مئوية.
- حمل التخدير العام (بينتوباربيتال الصوديوم 40 مغ/كغ) في جميع الحيوانات عن طريق الحقن داخل قبل ثقب الوريد سوبكلافيان.
- وضع الفئران في موقف ضعيف. إصلاح أطرافه هند في وضع مريح وإصلاح الطرف العلوي الموازي لمحور الجسم فقط بجانب الجذع.
ملاحظة: يلزم لا التهوية الميكانيكية لهذا الإجراء (الشكل 1). - تنظيف جانبي المساحة عظم لإزالة الفراء (مع ماكينة حلاقة الشعر وعامل نتف الشعر، انظر الجدول للمواد) وأي أوساخ مرئية. مسح العنق والصدر الجلد مع الإيثانول 75%. الاحتفاظ بمنطقة لثقب نظيفة وجافة مع شاش.
2-الدم جمع الإجراءات
ملاحظة: كلا الجانبين الوريد subclavian مناسبة للثقب، وهنا علينا أن نختار الجانب الأيسر لثقب. يتم تعريف موقع واتجاه الترقوة اليمنى بالإبهام الأيمن للمشغل (الشكل 2). فوس سوبراستيرنال تأثرنا بلطف مع السبابة كما فوس سوبراستيرنال في اتجاه الإبرة (الشكل 2).
- شطف المحاقن معقمة 2.5 مل مع الهيبارين الحل (10 وحدات دولية/مل).
- موقع ثقب 0.5 مم والذيلية لمنطقة 1/3 الخارجي في الترقوة اليمنى (الشكل 3). نقل المحاقن بلطف داخل الجلد من ثقب الموقع. وحالما تدخل الإبرة الجلد عظم، تطبيق الضغط السلبي مع اليد اليمنى للمشغل (الشكل 4).
ملاحظة: حجم الدم متوسط والقصوى هي مل 1.0 و 1.4 مل، على التوالي. يتم وضع اتجاه فوس سوبراستيرنال اتجاه الإبرة وينبغي أن تكون متوازية تقريبا إلى الترقوة الخلفي فقط لأنها. عادة، يمكن الوصول إلى هذا السياق subclavian بإدخال إبرة حوالي 2 ملم في هذا الاتجاه. وبمجرد دخول الإبرة الوريد، ستدخل الدم المحاقن تحت ضغط سالب.- الحفاظ على ضغط سلبي حتى يتم رسمها ما يكفي حجم الدم (الشكل 5).
- إذا كان جمع الدم الوريد subclavian غير ناجحة، سحب الإبرة إلى منطقة تحت الجلد وضبط اتجاه الإبرة الداخلية قليلاً للقص.
- إذا فشلت المحاولات الثلاث، تجنب الوريد subclavian من نفس الجانب واستخدام الجانب كونترالاتيرال لأخذ عينات من الدم.
- بعد جمع الدم، وإزالة ثقب الإبرة، وتطبيق الضغط على الموقع ثقب لمدة 1-2 دقيقة لوقف النزيف.
ملاحظة: يجب أن يكون الضغط لطيف جداً لمنع الاختناق.
3-الدم عينة التجهيز
- نقل عينة الدم إلى أنبوب معدني مغلف تخثر الدم (مع يدتا) وجهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1600 x ز جمع البلازما.
- نضح المادة طافية في أنبوب نظيف ومخزن في-80 درجة مئوية (الشكل 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إجمالي 20 SD الفئران (ن الذكور = 10، الإناث n = 10) واستخدمت هنا. كوليكتيونواس الدم أداء المشغلين المهرة، الذين أدوا أكثر من 20 من أخذ عينات الدم من الوريد subclavian في الفئران، ومشغلي المبتدئين، الذين لديهم ثقب الوريد subclavian لا خبرة في الفئران أو غيرها من الحيوانات. قبل العمليات، شاهدت المبتدئين على الأقل 3 إجراءات القيام بالمشغلين المهرة.
أخذ عينات من الدم ونجحت في الفئران 17 من خلال الوصول الصحيح subclavian الوريد. فشل هذا الإجراء في الفئران 3 (1 في المجموعة المهرة) و 2 في مجموعة المبتدئين، وأخذ عينات من الدم تم بنجاح من خلال المطالعات الأيسر subclavian المنطلق في هذه الفئران 3. وقت الدورة والدم وحدة التخزين التي تم جمعها لكل حالة على حدة موضحة في الجدول 1. وكان معدل نجاح مماثلة بين مجموعة المبتدئين (80%)، ومجموعة المهارات (90%، p = 0.531). وكان معدل نجاح 100% لكلا الفريقين عندما بما في ذلك زيارات إضافية المنطلق subclavian اليسرى في الفئران 3. اثنين الذيل الطالب t-وأظهر الاختبار أن كان هناك لا اختلاف كبير في وقت ينفق بين مجموعة المبتدئين ومجموعة المهارات (102.1 ± 14.9 s مقابل 84.3 ± 9.7 s, p = 0.33، الرقم 7). لا مضاعفات خطيرة حدثت في جميع إجراءات مثل استرواح الصدر أو هيموبنيوموثوراكس، أو الرئيسية نزيف أثناء أو بعد العملية. ونجا جميع الحيوانات واسترجاعها، في غضون 30 دقيقة بعد أخذ عينات من الدم.
إظهار صعوبات التعلم إجراء الثقب، قارنا زيادة عدد عمليات السحب بين المهرة ومجموعات المبتدئين. كما هو مبين في الجدول 2، ومتوسط عدد من الانسحابات في مجموعة المهارات أقل قليلاً من مجموعة المبتدئين (±0.3 1.6 مقابل روبلين 2.5)، ولكن هناك لا دلالة إحصائية (p = 0.0913).
الشكل 1 : موقف فئران. وضعت الفئران في موقف ضعيف، وأطرافه العلوية ثابتة موازية لمحور الجسم، فقط بجانب الجذع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحديد رموز سطح الفئران. (أ) الإبهام الأيمن للمشغل في الترقوة الأيمن لتحديد الموقع ومجموعة من هذه العظام؛ (ب) سوبراستيرنال فوس بلطف لمست مع السبابة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : موقع الثقب. موقع الثقب يقع 0.5 مم والذيلية للموقع 1/3 الخارجي من الترقوة اليمنى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : تشكيل ضغط سلبي في المحاقن. وحالما تدخل الإبرة الجلد عظم، نقل الأصابع اليد اليمنى لخلق ضغط سالب في المحاقن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : سحب الدم في المحاقن. عند إدخال الإبرة الوريد سوبكلافيان، ستدخل الدم المحاقن تحت ضغط سالب. هو إبقاء الضغط السلبي حتى يتم الحصول على ما يكفي من الدم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : استخراج البلازما بعد سينتريفوجينج- وبعد سينتريفوجينج، يتم فصل الدم إلى البلازما والخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : معدل وقت الدورة والنجاح بين مختلف الفئات. ويبين هذا المخطط لا يوجد اختلافات كبيرة في معدل الوقت الذي يقضيه (اللوحة اليمنى) أو النجاح (اللوحة اليمنى) بين مجموعة المبتدئين ومجموعة المهارات. الوقت هي بالطبع في مجموعة المبتدئين ومجموعة المهارات 102.1 ثانية ± 14.9 و 84.3 ± 9.7 ثانية، على التوالي، ف = 0.33 بين المجموعات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8 : تشريح الوريد سوبكلافيان. ويقع على المنوال subclavian الخلفي فقط ووالذيليه الترقوة. صوتها إلى حبل الوريد الداخلي للنموذج على المنوال براتشيوسيفاليك وأقنية الصرف الصحي في سوبر الوريد الأجوف، تحت فوساي سوبراستيرنال فقط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| مجموعة المهرة | مجموعة المبتدئين | |||||||||
| نوع الجنس | وزن الجسم (ز) | حجم الدم (mL) | بالطبع الوقت (S) | نوع الجنس | وزن الجسم (ز) | حجم الدم (mL) | بالطبع الوقت (S) | |||
| S1 | أنثى | 153 | 1.6 | 70 | B1 | أنثى | 149 | 1.6 | 72 | |
| S2 | أنثى | 168 | 1.6 | 60 | B2 | أنثى | 158 | 1.6 | 68 | |
| S3 | أنثى | 183 | 1.6 | 75 | B3 | أنثى | 190 | 1.6 | 83 | |
| S4 | أنثى | 170 | 1.6 | 74 | B4 | أنثى | 160 | 1.6 | 77 | |
| S5 | أنثى | 159 | 1.6 | 65 | B5 | أنثى | 153 | 1.6 | 200 | |
| S6 | أنثى | 200 | 1.6 | 83 | B6 | أنثى | 187 | 1.6 | 92 | |
| S7 | أنثى | 178 | 1.6 | 86 | B7 | أنثى | 164 | 1.6 | 99 | |
| S8 | أنثى | 187 | 1.6 | 168 | B8 | أنثى | 200 | 1.6 | 82 | |
| S9 | أنثى | 192 | 1.6 | 83 | B9 | أنثى | 198 | 1.6 | 70 | |
| S10 | أنثى | 157 | 1.6 | 79 | B10 | أنثى | 175 | 1.6 | 178 | |
الجدول 1: الدم حجم ووقت الدورة من الثقب إلى مجموعة دم انتهاء. S: مجموعة المهرة؛ باء: المبتدئين.
| المجموعة | n | يعني | سراج الدين | الفاصل الزمني conf 95%. | |
| ب | 10 | 2.5 | 0.4 | 1.59 | 3.41 |
| S | 10 | 1.6 | 0.3 | 0.91 | 2.29 |
الجدول 2: عدد الانسحابات بين الفريقين. باء: المبتدئين؛ S: مجموعة المهرة. p = 0.0913
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن نقدم طريقة بديلة لاستخراج الدم من الوريد subclavian ونظهر أن هذا الأسلوب مجدية وآمنة، والمطبقة لأخذ عينات من الدم في الفئران. هذا الأسلوب مشتق من ثقب الوريد subclavian في زرع منظم ضربات القلب يؤدي للمرضى11. يقع الخلفي فقط ووالذيليه الترقوة على المنوال subclavian وهو استمرار الوريد الابطي. يتم تشغيله من الحد الخارجي للضلع الأول للحدود الآنسي الأمامي سكلين العضلات12. من هنا، فإنه ينضم مع حبل الوريد الداخلي لتشكيل الوريد brachiocephalic وأقنية الصرف الصحي في سوبر الوريد الأجوف، فقط تحت سوبراستيرنال فوساي (الشكل 8). الترقوة يتم التعرف عليها بسهولة، وهناك علاقة واضحة التشريحية بين الوريد subclavian والترقوه. هنا، قمنا بتطبيق هذه المهارة السريرية للتجارب على الحيوانات. بسبب اتجاه مختلف من الطرف العلوي في البشر والفئران، يتم وضع الطرف العلوي فقط بجانب الجذع أثناء إجراء كشف الفضاء والذيلية الترقوة، مما سيسهل الثقب (الشكل 1).
وعلى المنوال subclavian أكبر بكثير من هذا السياق الذيل. ولذلك، من الأسهل للحصول على ما يكفي من الدم من الوريد subclavian من المنطلق الذيل. قد يصل حجم العينة الإجمالية إلى 10 في المائة إجمالي حجم الدم بتعميم كل الوقت1. في حالة فشل مسار آخر أو أخذ عينات من الدم الوريد ذيل التقليدية، يمكن النظر الباحثين ثقب الوريد سوبكلافيان. التخدير العام مطلوب لهذا الإجراء، وهذا يشكل قيداً رئيسيا لهذا الإجراء. وهنا نستخدم بينتوباربيتال الصوديوم للتخدير العام. مقارنة بالعوامل الأخرى، بينتوباربيتال الصوديوم من السهل لحقن، وهناك حاجة إلى أي صكوك أخرى خاصة. وذكرت تسوكاموتو et al. أن استنشاق isoflurane SpO2 الأكثر استقرارا من الوكلاء الآخرين وأوقات الانتعاش القصير. في المراكز بأجهزة استنشاق، يمكن اعتبار isoflurane13. علاوة على ذلك، كما يقع على المنوال subclavian قرب تجويف الصدر، يجب أن تحرص على منع حدوث مضاعفات خطيرة تتعلق بإجراءات مثل استرواح الصدر وهيموبنيوموثوراكس. يجب أن توجه باتجاه الإبرة بعناية لتجنب هذه المضاعفات. هنا، يتم دائماً وضع الإبرة موازية الترقوة والخلفي لأنها فقط وتم نقله بلطف نحو فوس سوبراستيرنال. وأظهرت النتائج أن استخدام تقنية أعلاه يمكن تجنب المضاعفات المحتملة. تجنب أي اتجاه نزولي الإبرة نحو تجويف الصدر في هذا الإجراء. أيضا، عمق الوريد subclavian يجب دائماً أن يبقى حوالي 2 ملم من موقع الثقب.
في بعض الأحيان، قد تفشل محاولات من جانب واحد. أننا لا نقول أكثر من 3 محاولات من نفس الجانب. في مثل هذه الظروف، استخدم الجانب الآخر للثقب، الذي قد يؤدي إلى تحسين معدل نجاح لأخذ عينات من الدم. لزيادة توضيح جدوى أسلوبنا، اختبرنا بمعدل النجاح ووقت ينفق بين مجموعة المبتدئين ومجموعة مهارات. من المثير للاهتمام، كانت هناك لا دلالة إحصائية بين هذه المجموعات (p = 0.33)، التي أثبتت الطابع العملي لهذا حديثا وضع الأسلوب.
كما نوقشت هنا، هو القيد الرئيسي أن معدل النجاح في جانب واحد. إذا فشل هذا الإجراء، يجب النظر في الجانب الآخر من هذا السياق سوبكلافيان. يتم استخدام التخدير العام في هذا الإجراء والوقت الانتعاش في المتوسط حوالي 30 دقيقة مع الصوديوم بينتوباربيتال. التخدير استنشاق Isoflurane له وقت استرداد أقصر كثيرا، واعتماد أساليب التخدير جديدة يمكن أن تكون مفيدة في تقليل مدة الإجراء. ونحن تبين أن هذا الأسلوب المنطبق على الفئران، ولكن نحن لم تختبر انطباقه على الحيوانات الصغيرة مثل الفئران.
وفي الختام، نتائج الدراسة تشير إلى أن الأسلوب ثقب الوريد subclavian لجمع عينة الدم مأمونة ومجدية في الفئران. هذا الأسلوب قيمة خاصة عندما تكون هناك حاجة كميات كبيرة من الدم. هذا الأسلوب بديل أمثل إذا فشل إجراءات أخذ العينات الدموية التقليدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وأيد هذا العمل المنحة من مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية لرقم الصين 81670269 ورقم 81500355 ورقم 81500226.
Acknowledgments
لم يصرح بشيء.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rats | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| stastical software | SPSS Statistics 17 | ||
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co.,Ltd(Guangzhou, Guangdong Province ,China) | ||
| 2.5 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co.,Ltd(Weihai,Shandong Province ,China) | ||
| hair shaver | Shanghai FLYCO Electric Co., Ltd(Shanghai,China) | ||
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH(EdisonstraBe 6,59157 Kamen, Germany) | ||
| Pentobarbital sodium | Merck | ||
| 75% ethanol | Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | ||
| blood collection tube | Hubei Jinxing Technology&Development Co.,Ltd (Wuhan Hubei Province,China) (2ml) | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co.,Ltd (Dongguan,Guangdng Province,China) | ||
| canvas gloves | for anethesia | ||
| hepain | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co.,Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) (2mL, 12500 IU) | ||
| physical saline | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd(Yueyang ,Hunan Province,China) (100ml) |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology, Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Wickremsinhe, E. R., Renninger, M., Paulman, A., Pritt, M., Schultze, A. E. Impact of Repeated Tail Clip and Saphenous Vein Phlebotomy on Rats Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. 44 (7), 1013-1020 (2016).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments. (90), e51969 (2014).
- Cochran, B. J., et al. Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), 266 (2007).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Lab Animal. 44 (4), 377-378 (2010).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th, National Academies Press (US). US (Washington DC). (2011).
- Antonelli, D., Feldman, A., Freedberg, N. A., Turgeman, Y. Axillary vein puncture without contrast venography for pacemaker and defibrillator leads implantation. Pacing and Clinical Electrophysiology. 36 (9), 1107-1110 (2013).
- Luis, A. L., et al. Microscopic magnetic resonance imaging of the thoracic venous system in rats with congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 27 (2), 175-180 (2011).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
