Summary
Biz x-ışını soğurma kontrast Mısır doku sıradan microcomputed tomografi taramak için uygun geliştirmek için yeni bir yöntem sağlar. CT görüntüleri baz alınarak, biz görüntü işleme iş akışları için etkili bir şekilde Mısır Vaskular demetleri mikroskobik fenotipleri ayıklamak farklı Mısır malzeme bir dizi tanıtmak.
Abstract
Bu doğru bir şekilde yüksek üretilen iş görüntü analiz teknikleri dayalı Mısır malzemelerin anatomik yapıları ölçmek gereklidir. Burada, bir 'örnek hazırlama protokol' Mısır malzemeler (yani, kök, yaprak ve kök) tarama sıradan microcomputed tomografi (mikro-CT) uygun için sağlar. Mısır kök, yaprak ve kök yüksek çözünürlüklü CT görüntüleri baz alınarak, biz iki protokol Vaskular demetleri fenotipik analizi için tarif: (1) Mısır kök ve yaprak CT görüntü dayalı, geliştirdiğimiz otomatik olarak 31 ayıklamak için bir belirli görüntü analiz boru hattı ve damar demetleri 33 fenotipik özellikleri; (2) Mısır kök CT görüntü dizisi dayalı, biz üç boyutlu (3-D) ayrılmasını metaxylem gemiler için bir görüntü işleme düzeni kurmak ve iki boyutlu (2-B) çıkarılan ve gibi cilt, 3-b fenotipik özellikleri yüzey alanı metaxylem gemileri, vb Vaskular demetleri Mısır malzemelerin geleneksel manuel ölçüm ile karşılaştırıldığında, önerilen iletişim kuralları önemli ölçüde verimlilik ve mikron çaplı fenotipik miktar doğruluğunu artırır.
Introduction
Mısır damar sistemi aracılığıyla tüm bitki, kök ve yaprakları, su, mineral besin ve organik maddeler1teslim etmek için anahtar ulaşım yolları oluşturan kök çalışır. Damar sistemi başka bir önemli fonksiyonu için Mısır bitki mekanik destek sağlamaktır. Örneğin, morfoloji, numarası ve dağıtım kökleri ve sapları Vaskular demetleri mısır bitkileri2,3lojman direnç yakından ilgilidir. Şu anda, çalışmaları Vaskular demetleri anatomik yapısını esas olarak kök, yaprak veya kök, belirli bir kısmını anatomik yapıları görüntülemek için mikroskobik ve ultramicroscopic teknikleri kullanmak ve sonra ölçmek ve bu yapıları saymak el ile soruşturma tarafından ilgi. Hiç şüphesiz, büyük ölçekli microimages çeşitli mikroskobik yapıları Manuel ölçüm çok sıkıcı ve verimsiz bir iş ve ciddi bir şekilde kendi öznellik ve tutarsızlık4sayesinde microphenotypic özellikleri duyarlığını sınırlar, 5.
Mısır ikincil hiçbir büyüme vardır ve hücre içeriğini aslında birincil meristem suda oluşur. Herhangi bir ön Mısır dokuların taze örnekler doğrudan bir mikro-CT cihazı kullanarak taranabilir; Ancak, tarama sonuçları muhtemelen kötü ve kaba. Başlıca nedenleri şöyle özetlenebilir: (1) düşük zayıflama yoğunluğu atom numarası ve yüksek gürültü görüntüler; düşük kontrast sonuçlanan bitki dokuların (2) taze bitki malzeme Du6tarafından belirlendiği şekilde kurutmak ve normal tarama ortamı sırasında küçültmek yatkındır. Yukarıda belirtilen sorunları geliştirme ve Mısır, buğday, pirinç ve diğer monocotyledons için microphenotyping teknolojisi uygulama için ana kısıtlamaları haline gelmiştir. Burada, 'örnek hazırlama protokol' tanıtmak Mısır kök, yaprak ve kök örnekleri pretreat için. Bu iletişim kuralı dehidratasyon ve CT tarama sırasında bitki malzemelerin deformasyon önler; Böylece, bitki örnekleri nondeformation ile koruma zaman artırmak yararlıdır. Ayrıca, katı iyot bağlı boyama adımda da bitki malzeme zıtlığını arttırır; Böylece, mikro-CT görüntüleme kalitesi önemli gelişmeler sağlar Ayrıca, görüntü işleme yazılımı, VesselParser Mısır sapları ve yaprakları CT görüntülerini işlemek için adlandırılmış geliştirdik. Bu yazılım bir dizi görüntü işleme boru hatları farklı bitki dokuları 2B CT görüntülerde yüksek üretilen iş ve otomatik fenotipleme analiz gerçekleştirmek için entegre. Mısır kök ve yaprak tüm kesit Vaskular demetleri algılanır, çıkarılan ve otomatik bir görüntü işleme yöntem kullanarak tanımlanan. Sonuç olarak, Mısır kök 31 mikroskobik fenotipleri ve mikroskobik 33 fenotipleri Mısır yaprak elde etmek. Mısır kök CT resim serisi için 3-b fenotipik özellikleri metaxylem gemilerin elde etmek için bir görüntü işleme düzeni geliştirdik. Bu düzen içinde resim alma ve geleneksel yöntemlere göre imar verimliliğini üstündür.
Bu sonuçlar bu görüntü işleme sıradan röntgen mikro-CT görüntüleme özelliklerini Vaskular demetleri mikroskobik fenotipleme için etkili bir yöntem sağlar dikkate alınarak boru hatları olduğunu gösterir; Bu son derece CT teknikleri bitki biliminde uygulamaları genişler ve hücresel çözünürlük6,7bitki malzemelerin otomatik fenotipleme artırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. örnek hazırlama Protokolü
- Örnekleme, kök, yaprak, toplar ve taze mısır bitkilerden kök ve onları üç tür örnek grup (her grup dört çoğaltmalar ile) bölün. Sonra aşağıdaki şekilde bir cerrahi bıçak kullanarak küçük parçalara kesmek: (1) pay ortasında bir bölümünün kök düğümler arası 1-1.5 cm uzunluğunda; (2) 0.5 - 3 cm uzunluğunda ana ven ile düşey yönde boyunca yaprak maksimum genişliği bir parçasını kesme; (3) bir parçasını taç kök 0.5 cm boy içinde kesme.
- FAA fiksasyon için örnek kesimleri bir çözümde FAA (90:5:5 v/v/v, % 70 etanol: %100 formaldehit: %100 asetik asit) en az 3 d için emmek.
- Dehidratasyon yordamı altı sıralı etanol gradyanlar içinde (Örneğin, % 30, % 50, % 70, % 85, % 95 ve % 100) gerçekleştirmek ve her etanol geçişin işlem süresi 30 dk ayarlayın.
- Bitki malzemeler 3-b bir yazıcı kullanarak üretilen karşılık gelen örnek sepetler içinde yer; sonra hızlı bir şekilde örnek sepet bir CO2 kritik nokta kurutma sistemi örnek hücreye taşıma. Kurutma parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın:
(1) CO2 ': hızlı hız. Tutucu dolgu maddeleri: % 100.
(2) ücreti: CO2 şarj gecikme 120 s çevrimi. Değişim hızı: 5. döngüsü sayı: 12.
(3) gazı: ısı, hızlı. Hız: yavaş, %50.- Mısır kök, kök ve yaprak, tasarım ve 3-b Yazıcı (Örneğin, Şekil 1) kullanarak yazdırma örnek sepetleri morfolojik farklılıkları göre.
- Kurutulmuş bitki malzemeleri (Mısır kök, kök veya yaprak) uçucu iyot buharı ile bitki malzemeleri boya ve ardından, 4-5 h için lightproof bir odada tüpler yerleştirmek için katı iyot 2 g ile 50 mL santrifüj tüpü yerleştirin.
2. mikro-CT tarama protokolü
- Ham CT veri inceden inceye gözden geçirmek için CT tarama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: 40 kV/250 µA (için kök ve yaprak) veya 34 kV/210 µA (kök için). Aralıkları farklı boyutları ve kullanılan bitki malzemelerin birimleri için tarama karşılık gelen ayarlayın ve görüntüleme piksel boyutları aşağıdaki gibi ayarlayın: 2.0 µm (Mısır kök için) (için mısır sapı) 6,77 µm ve 10.0 µm (Mısır yaprak için).
- Dilim görüntüleri yeniden oluşturmak için bir resim yeniden yapılanma yazılımı kullanarak ham CT verileri CT dilim görüntüleri 2 K çözünürlük (2.000 x 2000 piksel) dönüştürün. Daha fazla bilgi NRecon Kullanım Kılavuzu (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf) sağlanır.
3. görüntü analiz protokolü için bir Mısır kök ve yaprak bir tek CT görüntüleri
Not: Mısır kök ve yaprak (Şekil 2) CT dilim görüntülerini içinde damar demetleri fenotipleme çözümleme yapmak üzere Vaskular paketler için otomatik görüntüleme yazılımı kullanın. Yazılım kullanım adımları aşağıda açıklanmıştır.
- Farklı algoritma boru hatları başlatmak için organ türü tayin. Yöntem parametreleri düğmesini tıklatın ve Mısır kök veya Mısır yaprak ilk açılan kutusunda seçin.
- Görüntüleri içe aktarmak için veri yönetimi düğmesini tıklatın, çalışma dizini ayarlama ve otomatik olarak bu dizindeki tüm dilim görüntüleri içe. Tek veya birden çok dilim görüntüleri görüntü boru hatları seçin.
- Görüntünün gerçek piksel boyutunu belirlemek. Yöntem parametreleri düğmesini tıklatın ve görüntünün gerçek piksel boyutunu piksel boyutu Düzenle öğesini girin.
- Fenotipleme hesaplama için otomatik olarak tüm seçili dilim görüntüleri için damar demetleri fenotipik özellikleri ayıklamak için fenotipleme hesaplama düğmesini tıklatın.
- Sonuçları bir TXT veya CSV dosya biçimi olarak çıkış için istatistik analiz düğmesini tıklatın.
4. görüntü analiz Protokolü Mısır kök CT resim serisi için
Not: Mısır kökleri CT resim dizi metaxylem damarları görüntü işleme yazılımı kullanarak 3 boyutlu yapıları ayıklamak için kullanılmaktadır. Ana adımları aşağıdaki gibidir.
- (BMP dosya biçiminde) Mısır köklerinin yeniden oluşturulan görüntüleri içe ve doğru aralığı parametreleri (voxel [yani, x, y, z] boyut) belirleyin. Görüntü kalitesini artırmak için bu görüntüleri düzeltmek için özyinelemeli Gauss aracını kullanın.
- 3-b segment metaxylem gemilerin eşik parametreleri ayarlayarak kuralları; Her bağlı metaxylem araç için bir tek tip renk etiket oluşturur.
- Geliştirmek ve etkileşimli morfoloji, bitwise, kullanarak metaxylem damarları ve sel-dolgu işlemleri tanımlar.
- Birim görselleştirme ve yüzey gemi inşası kuralları. Maske istatistik aracı ve 2-B ve 3-b seviyelerinde bir gemi fenotipik özellikleri ölçmek için kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sıradan mikro-CT tarama için uygun örnek hazırlama Protokolü sadece bitki doku deformasyon engeller, ancak aynı zamanda x-ışını soğurma zıtlığını arttırır. Ön işleme tesisi malzemeleri bir mikro-CT sistemi yüksek kaliteli dilim görüntüleri kullanılarak taranır ve en yüksek çözünürlükte 2 µm/piksel ulaşabilirsiniz. Şekil 4 taranan mikro-CT görüntüleri, kök, yaprak ve kök gösterir ve görüntü kontrastı taze bitki malzemelerden taranan sonuçları ile karşılaştırıldığında önemli bir iyileşme vardır. Bu CT dilim görüntüleri gri düzeyi değerleri önemli farklılıklar gözlemlenebilir Vaskular demetleri, parankimi hücreleri, xylem gemiler, epidermis ve diğer doku arasında vardır.
Vaskular paketler için bu düşsel bilgisayar yazılımı dayanarak, Vaskular demetleri tüm kök veya yaprak kesit içinde yapı ve dağıtım özelliklerini otomatik olarak analiz sayılabilir ve. Örnek olarak bir mısır sapı görüntüsünü almak ve yazılım fenotipleme algoritması beş adımdan oluşur: dilim görüntü segment, Vaskular demetleri segment, Vaskular demetleri kayma dağılımını analiz, tanımlamak ve damar demetleri geliştirmek ve hesaplamak ve damar demetleri fenotipik özellikleri çıktı. Görüntü tüm epidermis bölgede ilk olarak, belirli veya edinilmiş eşik değerleri ve kontur analiz teknikleri epidermis bölge (Şekil 3A ve 3B) ayıklamak için gerçekleştirilen göre parçalara. Ardından, segmentasyon Vaskular demetleri yapılır. Vaskular demetleri içinde epidermis çevrilidir; Bu nedenle, önceden tanımlanmış kalınlıkta epidermis bölgesiyle dilim görüntüden kaldırılır. Görüntünün geri kalanı sadece yüksek piksel yoğunluklarda ile dağınık vascular bundles ve zayıf piksel yoğunluklarda parankimi hücreleri oluşur. Sonra sabit eşik değeri temel alınarak görüntü segmentasyonu Vaskular demetleri tüm aday bölgeler ayıklamak için gerçekleştirilir ve bu bölgelerde daha fazla alan ve şekil özellikleri ( sınırlamaları göre geçerli Vaskular demetleri olarak belirlenir Şekil 3 c ve 3D).
Vaskular demetleri ayrılmasını sonra damar demetleri kayma dağıtım özellikleri ayıklanır. Üçgen kafesleri için tüm damar demetleri dilim görüntü oluşturmak için düğümleri kadar dağınık Vaskular demetleri geometrik merkezleri yararlanmak ve bu kafesler beş türlerine göre kendi bölgeleri kümelenir. Vaskular demetleri alanlarında Mısır kök kenarına Merkezi'nden önemli bir azalan eğilim tezahür. Üçgen Voronoi kafesler kayma dağıtım ve topolojik bağlantıları Vaskular demetleri açıklayan ve her kafes Vaskular demetleri (3E şekil - 3 H) kümelenmiş sonuçlarına göre belirli bir renkle çizilir. Kayma dağıtım kısıtlamaları karşılamak Vaskular demetleri (kafes alanı ve şekli olan damar paket kullanılabilirliğini belirlemek için önemli dizinler) ayrılmış ve son segmentasyon sonuçları (Şekil 3ben) oluşturmak için kullanılan.
Vaskular demetleri, geometrik, şekil gibi son, fenotipik özelliklerin yönü ve dağıtım bilgilerini, TXT veya CSV dosyası (Şekil 3J) çıktıda sonuçlar yukarıdaki Analize göre hesaplanan. Vaskular demetleri görüntüleme yazılımı dayanarak, kök 31 fenotipik özellikleri otomatik olarak analiz edilebilir; ~ 30 her CT resim ortalama hesaplama sırası s. Kök göreli fenotipik parametreleri Tablo 1' de gösterilmiştir. Benzer şekilde, yaprak 33 fenotipik özellikleri ayıklanır, ~ 50 Ortalama hesaplama zamanı s ve bu parametre sınıflandırmalar Tablo 2' de gösterilmiştir. Dilim görüntüleri listesi için yukarıdaki görüntü analiz boru hatları bir toplu işlem için otomatik yürütme içine entegre edilmiştir. Bu iş akışının bir Mısır kök ve yaprak tüm dilim görüntü içindeki tüm damar demetleri fenotipik özellikleri analiz etmek için etkilidir. Özellikle, fenotipik özellikleri Toplam alan, ortalama alan ve alan oranı Vaskular demetleri gibi Vaskular demetleri en önemli ölçüde tarafından el ile ölçümler ölçülecek zordur.
Çünkü Mısır kökleri metaxylem gemilerin kök büyüme yönünde boyunca açık morfolojik değişiklikler, metaxylem gemiler fenotipik analiz için 3-b yapılarının ayıklamak daha değerlidir. Mısır kök CT resim serisi baz alınarak, 3-b segment, yüzey yeniden yapılanma ve ses görselleştirme gerçekleştirilir. Kesimli sonuçlarına göre 3-b yapısal parametreleri metaxylem gemilerin otomatik olarak, birim, yüzey alanı, kesit alanı (bazal) ve toplam metaxylem damarları ve her kesit alanı (distal) gibi hesaplanabilir tek metaxylem gemisi. Bu iş akışı, 3-b fenotipik özellik çözümleme verimliliğini önemli ölçüde artırır. Segmentasyon, yeniden yapılanma ve ses görselleştirme sonuçlarını doğrudan Şekil 5' te gösterildiği gibi Mısır kökünün metaxylem gemilerin mekansal yapılar meydana gelen.
Resim 1 : Örnek sepetleri farklı türde bulunan 3-b bir yazıcıya yazdırılan. (A ve B) yaprak sarmal örnek sepet oluşur ile merkezi bir oval (A1) groove ve çevresindeki sarmal (A2) groove. Spiral oluk genişliği yaklaşık 4 mm ana ven ile yaprak yerleştirmek için ayarlanır. Spiral oluk yan (A5) ile oluşturulan kare drenaj delikleri ve sepet (B6) dairesel drenaj delikleri ile altında olduğunu. (C ve D) Bu iki panel bir dört-iyi örnek sepet kök için uygun göster (C1) örnek delik çapı 25 mm ve sepet (D2) ve alt yedi delik drenaj. (E ve F) bu iki panel göstermek multiwell örnek sepet kökle (E1) dört dairesel delik merkezi alanında, 10 mm çapında için uygundur ve (E2) 13 dairesel delik çapı 8 mm düzenlenmiş yakınındaki sepetin kenarına. Örnek sepet alt 1 mm çapında drenaj delikleri küçük kök doku sızıntı değil ki temin etmelidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Otomatik görüntüleme yazılımı Vaskular paketler için ekran. (A) Bu panel herhangi bir dosya dizininden CT görüntüleri içe ve sonraki işlem için CT dilim görüntüleri seçmek için veri yönetimi gösterir. (B) Bu panel CT dilim görüntüleri, organ türünü tanımlamak ve ilgili yöntem parametrelerini yapılandırmak için yöntem parametrelerini gösterir. (C) Bu panel CT dilim görüntüleri toplu hesaplama gerçekleştirmek ve yürütme ilerleme göstermek için fenotipleme hesaplama gösterir. (D) Bu panel istatistiksel hesaplama sonuçları doğrulamak ve CT görüntüler için fenotipik özellikleri oluşturmak için gösterir. (E) Bu panel bir TXT veya CVS dosyası olarak çıktı analizi sonuçları hesaplama sonuçları gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Görüntü işleme ve fenotipleme hesaplama iş akışı tabanlı CT dilim görüntülerde. (A)alma CT dilim görüntü Mısır kök. (B) Segment dilim görüntü Sabit eşik değeri. (C) özü Mısır kök tüm bölge. (D) Sil epidermis bölgesi Mısır kök. (E) üçgen kafesleri Vaskular demetleri. (F) Bu panel bir kümeleme Analizi Vaskular demetleri alanlara göre gösterir. (G) Bu panel bir kümeleme Analizi üçgen kafesleri alanlara göre gösterir. (H) Bu panel bir kümeleme analizine göre Voronoi alanlarında kafesleri gösterir. (I) Bu panel son kesimli Vaskular demetleri sonuçlarını gösterir. (J) Bu panel Vaskular demetleri kayma dağılımını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Mısır kök, yaprak ve kök multiplanar yeniden yapılanma (MPR) görüntülerini. Sol bölmede bir kök kesit MPR görüntüsünü gösterir. Orta paneli bir yaprak kesit MPR görüntüsünü gösterir. Doğru kapı aynası bir kök kesit MPR görüntüsünü gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Kök metaxylem gemilerin 3-D görüntüleme. Barlar 0.2 mm. (A ve B) = bu paneller bir 3-b görsel bir kök olarak göster. (C - F) bu paneller bir 3-D görüntüleme metaxylem gemilerin göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: Mısır kök mikroskobik fenotipik özellikleri.
Tablo 2: Mısır yaprak mikroskobik fenotipik özellikleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CT teknolojisi biyomedikal ve malzeme bilimi alanlarında başarılı uygulama ile bu teknoloji yavaş yavaş Botanik ve bitki yaşam bilimleri araştırmaları umut verici bir teknik araç olarak teşvik tarım alanlarına kullanılmaya başlanan . 1990'ların sonunda CT teknolojisi ilk çalışma morfolojik yapıları ve bitki kök sistemlerinin geliştirilmesi için kullanıldı. Geçtiğimiz on yılda, sinkrotron HRCT bitki biyologlar için güçlü, zararsız bir araç haline geldi ve başarıyla doku yapıları üzüm damar sistemi8, Arabidopsis yaprak9 doku yapısını tanımlamak için kullanılan , 10ve tecavüz11tohum yapısı. Sinkrotron HRCT, büyük yapısı, çalışma ve odunsu bitkiler12,13,14Vaskular demetleri fonksiyonu ilerlemeler kaydedilmiştir. Ancak, Mısır, buğday, pirinç ve diğer bitkileri için HRCT teknoloji küçük araştırma15yapılmıştır. Mısır ikincil hiçbir büyüme vardır ve hücre aslında birincil meristem suda oluşur. Her ne kadar taze örnekler mikro-CT olmadan herhangi bir ön tarafından taranabilir, tarama sonuçları çok kötü. Başlıca nedenleri şunlardır: (1) düşük zayıflama yoğunluğu atom sayısı düşük kontrast ve yüksek gürültü görüntüler; sonuçlanan bitki dokuların (2) taze malzeme kurutmak ve tarama döneminde küçültmek Du6tarafından bildirildiği gibi eğilimindedir. Yukarıda belirtilen nedenlerle bu teknoloji Mısır, buğday, pirinç ve diğer monocotyledons sınırlama ana faktörler haline gelmiştir.
Burada, biz sadece bitki doku deformasyon engeller, ancak aynı zamanda x-ışını soğurma zıtlığını arttırır basit ve pratik bir örnek hazırlama protokol tanıtmak. Kök, kök ve yaprak yüksek kaliteli ve yüksek çözünürlüklü CT görüntülerini örnek hazırlama Protokolü ve mikro-CT görüntüleme sistemi göre elde edilmiştir ve en çok 2 µm/piksel yüksek çözünürlükte yapıldı. Böylece, örnek hazırlama Protokolü sıradan mikro-CT tarama için uygundur ve monocot ve diğer bitki Bilimleri daha geniş uygulamalar için büyük bir fırsat sağlar. Bu iletişim kuralı dehidratasyon veya kurutma işlemi gibi diğer bitki maddeler karşılamak için kolayca değiştirilebilir ve parametre ayarına da belirli bitki malzemeleri en iyi sonuç için göre ayarlanabilir. Özellikle, bu yaklaşım boyutu ve bitki örnek hacmi sınırlıdır. Bir çok kalın örnek kesimi eksik kurutma veya deformasyon örnek için neden olabilir. Bu nedenle, bu örnek hazırlama Protokolü az 3 cm kalınlığında küçük bitki malzemeler için ve Mısır kulak veya koçanı gibi çok daha büyük Mısır maddeler için geçerlidir.
Mikroskobik fenotipleme teknoloji bitki malzemelerin bir sıcak konu bitki fenotipik çalışmaların son yıllarda ve yavaş yavaş genetik ıslah ve bitki fizyolojisi için temel destek teknolojileri biri haline geliyor. Geleneksel mikroskobik fenotipik analiz bitkilerin çok sayıda karmaşık örnek ürünleri ve sıkıcı manuel işlemler gerektirir. Çok emek ve zaman alıcı ve mikroskopik özellikleri ölçmek; sonuçları da öznel hatalar yatkındır. Örneğin, bir mısır sapı Vaskular demetleri fenotipik özellikleri ölçmek için kök örnek parafin içinde gömülü ve sonra dilimlenmiş, lekeli ve görüntüsü gerekiyor. Lekeli dilim görüntü için otomatik bir görüntü hücre sınırları belirsiz tanımı nedeniyle işleme gerçekleştirmek zordur; Bu nedenle, el ile kimlik ve segmentasyon vazgeçilmez16vardır. Anatomik özellikleri büyük ölçekli ölçülerini Mısır kök gereksinimlerini karşılamak için farklı görüntü işleme yöntemleri Legland ve Heckwolf tanıttı; Ancak, kabuklu Vaskular demetleri yapılarının hala bir meydan okuma17,18' dir. Bu nedenle, yüksek üretilen iş görüntü analizi ve Mısır dokuların anatomik özelliklerin doğru miktar gereklidir. Burada, Vaskular demetleri, Vaskular demetleri ~ 30 31 fenotipik özellikleri otomatik olarak ayıklayabileceğiniz için otomatik görüntüleme yazılımı sağlamak her CT resim mısır sapı ve ~ 50 33 fenotipik özellikleri için s s Mısır yaprak her CT görüntüsü için. Vaskular demetleri tüm kaynaklanıyor olsa veya yaprakları kesit içinde yapı ve dağıtım özelliklerini otomatik olarak analiz ve sayısal. Bu yazılım aşağıdaki avantajları vardır: (1) Bu otomatik olarak Mısır kök ve yaprak CT dilim görüntüleri işler ve damar demetleri; fenotipik özellikleri ayıklar (2) Bu CT resmin kenarındaki küçük Vaskular paketler için özellikle damar demetleri daha yüksek bir tanıma oranı vardır; (3) bir roman grafik analiz yöntemi Vaskular demetleri dağıtım özellikleri ortaya çıkarmak için kullanılır.
Ayrıca, x-ışını mikro-CT tarama teknolojisi verimliliği resim alma ve parafin bölüm resimleri19,20 dayalı geleneksel rekonstrüksiyon teknikleri ile karşılaştırıldığında yeniden yapılanma içinde açık avantajları vardır ,21. Mısır kök CT resim serisi baz alınarak, bir görüntü işleme düzeni kayma yapıları metaxylem gemilerin ayıklamak için geliştirilen ve başarıyla mikroskopik özellikleri 3 boyutlu ölçüm için kullanılan. Ana bu düzeni 3-b kesimli sonuçlar hafif el ile etkileşimi üzerinde bağlıdır kısıtlamasıdır. Gelecekte, otomatik 3 boyutlu görüntü analiz yazılımı bir 3-b segment oluşturma ve yeniden yapılanma verimliliğini artırmak için Mısır köküne CT veri kümesi için bir dizi geliştirmek hedefliyoruz.
Sonuç olarak, bir pratik örnek hazırlama protokolü için Mısır kök, yaprak, sıradan bir mikro-CT tarama temel alır ve kök yüksek çözünürlüklü CT görüntüler üretmek için inşa edilmiştir. Burada sağlanan örnek hazırlama Protokolü sadece bitki doku deformasyon engeller ama aynı zamanda x-ışını soğurma zıtlığını arttırır. Bu iletişim kuralı da buğday, pirinç ve diğer monocotyledons uygulamaları tarama diğer CT için uygundur. Şimdiye kadar otomatik olarak ve hızlı bir şekilde Vaskular demetleri fenotipik özellikleri Mısır kök ve yaprak bir tek CT yansımasından ayıklama kapasitesine sahip otomatik düşsel bilgisayar yazılımı için damar demetleri, geliştirdik. Mısır kök CT resim serisi baz alınarak, bir görüntü işleme düzeni başarıyla metaxylem gemilerin 3-b fenotipik özellikleri ayıklamak için ayarlanır. Mikroskobik fenotipleme teknikleri bitki malzeme X-ray mikro-CT dayalı yeni bir umudu doğru ve hızlı miktar ve Mısır Vaskular demetleri tanımlaması için sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu araştırma desteklenen Ulusal Doğa Bilim Vakfı Çin (No.31671577), bilim ve teknoloji yenilik özel inşaat finanse edilen Program Pekin Akademi, tarım ve ormancılık Sciences(KJCX20180423), araştırma Kalkınma Programı Çin (2016YFD0300605-01), Beijing doğal Bilim Vakfı (5174033), Beijing doktora sonrası Araştırma Vakfı (2016 ZZ-66) ve Tarım Akademisi Pekin ve ormancılık Bilimler Grant (KJCX20170404), () JNKYT201604).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skyscan 1172 X-ray computed tomography system | Bruker Corporation, Belgium | NA | For CT scanning |
| CO2 critical point drying system (Leica CPD300) | Leica Corporation, Germany | NA | For sample drying |
| Ethanol | Any | NA | For FAA fixation |
| Formaldehyde | Any | NA | For FAA fixation |
| Acetic acid | Any | NA | For FAA fixation |
| Surgical blade | Any | NA | For cutting the sample sgements |
| 3D printer | Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA | NA | For printing the sample baskets of maize root, stem, and leaf |
| Centrifuge tube | Corning, USA | NA | Place the root, stem, or leaf materials |
| Solid iodine | Any | NA | For sample dyeing |
| SkyScan Nrecon software | SkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgium | NA | For image reconstruction |
| VesselParser software | VesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, China | NA | Image analysis protocol for single CT image of maize stem or leaf |
| ScanIP | ScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UK | NA | 3D image processing software |
| Latex gloves | Any | NA | |
| Tweezers | Any | NA |
References
- Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
- Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
- Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
- Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
- Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
- Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
- Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
- Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
- Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
- Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
- Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
- Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295 (2013).
- Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
- Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673 (2014).
- Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26 (2015).
- Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
- Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655 (2015).
- Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829 (2016).
