Summary
Nous fournissons une méthode originale pour améliorer le contraste d’absorption des rayons x des tissus de maïs adapté pour la numérisation de la tomographie microcomputed ordinaire. Basée sur des images de CT, nous présentons un ensemble de flux de traitement d’image pour différents matériaux de maïs extraire efficacement des phénotypes microscopiques des faisceaux vasculaires du maïs.
Abstract
Il est nécessaire de quantifier avec précision les structures anatomiques des matériaux maïs issu des techniques d’analyse d’images de haut débit. Ici, nous fournissons un « protocole de préparation d’échantillon » de maïs matériaux (c.-à-d., tige, feuilles et racine) adaptés aux microcomputed ordinaires tomodensitométrie micro-numérisation. Basé sur des images haute résolution de CT de tige de maïs, feuilles et racine, les auteurs décrivent deux protocoles pour l’analyse phénotypique des faisceaux vasculaires : (1) basé sur l’image de CT de tige de maïs et de feuilles, nous avons développé un pipeline d’analyse d’image spécifique pour extraire automatiquement 31 et 33 caractères phénotypiques des faisceaux vasculaires ; (2) basé sur la série d’image de CT des racines de maïs, nous avons mis en place un régime de traitement d’image pour la segmentation d’en trois dimensions (3d) des navires de métaxylème et extrait bidimensionnel (2d) et des caractères phénotypiques 3D, tels que volume, surface habitable de navires de métaxylème, etc. Les protocoles proposés par rapport à la mesure manuelle traditionnelle des faisceaux vasculaires de maïs matériaux, améliorent considérablement l’efficacité et la précision de dosage phénotypique à l’échelle du micron.
Introduction
Le système vasculaire maïs traverse toute la plante, de la racine et la tige à feuilles, qui forme les chemins de transport clé pour livrer de l’eau, minéraux et substances organiques1. Une autre fonction importante du système vasculaire est de fournir un soutien mécanique pour les plants de maïs. Par exemple, la morphologie, le nombre et la répartition des faisceaux vasculaires dans les racines et les tiges sont étroitement liés à la résistance à la verse des plants de maïs2,3. À l’heure actuelle, des études sur la structure anatomique des faisceaux vasculaires principalement utilisent des techniques microscopiques et ultramicroscopiques pour afficher les structures anatomiques d’une certaine partie de la tige, feuille ou racine et ensuite mesurent et comptent ces structures de intérêt par enquête manuelle. Sans aucun doute, mesure manuelle de différentes structures microscopiques dans microimages à grande échelle est une œuvre très fastidieuse et inefficace et limite considérablement la précision des traits microphenotypic, en raison de sa subjectivité et incohérence4, 5.
Maïs n’a aucune croissance secondaire, et le contenu de la cellule se compose essentiellement de l’eau dans le méristème primaire. Sans aucun traitement préalable, les échantillons frais des tissus de maïs peuvent être directement numérisés en utilisant un dispositif de micro-CT ; Toutefois, les résultats d’analyse sont probablement pauvre et rugueuse. Les principales raisons sont résumées comme suit : la densité (1) faible atténuation des tissus végétaux, ce qui entraîne un faible contraste de numéro atomique et un bruit élevé en images ; (2) matières végétales frais ont tendance à déshydrater et rétrécir pendant l’environnement balayage normal, tel que rapporté par Du6. Les problèmes susmentionnés sont devenus les principaux obstacles pour le développement et l’application de la technologie microphenotyping pour le maïs, le blé, riz et autres monocotylédones. Ici, nous introduisons le « protocole de préparation d’échantillon » d’un prétraitement des échantillons de maïs tige, feuilles et racine. Ce protocole permet d’éviter la déshydratation et la déformation des matériaux végétaux pendant la tomodensitométrie ; ainsi, il est utile d’augmenter la durée de conservation des échantillons de plantes avec nondeformation. Par ailleurs, l’étape de teinture basée sur l’iode solide aussi améliore le contraste des matières végétales ; ainsi, il apporte des améliorations significatives dans la qualité d’image de micro-CT. En outre, nous avons développé le logiciel de traitement d’image, nommé VesselParser, à traiter les images de CT des feuilles et des tiges de maïs. Ce logiciel intègre un ensemble de pipelines de traitement des images pour réaliser une analyse phénotypage haut-débit et automatique pour les images CT 2-D des tissus végétaux différents. Faisceaux vasculaires à toute coupe transversale de la tige de maïs et de la feuille sont détectés, extraits et identifié à l’aide d’une méthode de traitement d’image automatique. Ainsi, nous obtenons 31 phénotypes microscopiques de la tige de maïs et 33 phénotypes microscopiques de la feuille de maïs. Pour les séries d’images CT de la racine du maïs, nous avons élaboré un schéma de traitement d’image d’acquérir 3D caractéristiques phénotypiques des vaisseaux de métaxylème. Ce régime est supérieur en efficacité d’acquisition d’images et de la reconstruction par rapport aux méthodes traditionnelles.
Ces résultats indiquent que l’image, traitement des tuyaux étant donné que les caractéristiques d’imagerie d’ordinaire micro-tomodensitométrie fournissent une méthode efficace pour le phénotypage microscopique des faisceaux vasculaires ; C’est extrêmement élargit les applications des techniques de CT en phytologie et améliore le phénotypage automatique du matériel végétal à résolution cellulaire6,7.
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Protocol
1. Protocole de préparation d’échantillon
- Pour l’échantillonnage, recueillir la tige, feuilles et racines de plants de maïs frais et diviser en trois types de groupes d’échantillons (chaque groupe avec quatre répétitions). Ensuite, coupez-les en petits segments à l’aide d’une lame chirurgicale de la manière suivante : (1) coupe un segment du milieu de la tige entre-nœud 1 à 1,5 cm de longueur ; (2) couper un segment de la largeur de la feuille de 0,5 - 3 cm de longueur le long de l’axe vertical avec la veine principale ; (3) couper un segment de la racine de la Couronne 0,5 cm de longueur.
- Pour la fixation de la FAA, tremper les segments de l’échantillon dans une solution de la FAA (90:5:5 v/v/v, 70 % éthanol : 100 % formaldéhyde : 100 % d’acide acétique) pendant au moins 3 jours.
- Effectuez la procédure de déshydratation dans six des gradients séquentielle de l’éthanol (c'est-à-dire, 30 %, 50 %, 70 %, 85 %, 95 % et 100 %) et le délai de traitement de chaque dégradé de l’éthanol comme 30 min.
- Placer les matières végétales dans les paniers d’échantillon correspondant fabriqués à l’aide d’une imprimante 3D ; Ensuite, transférer rapidement les paniers de l’échantillon à la cellule d’un système de séchage CO2 point critique. Définissez les paramètres de séchage comme suit :
(1) CO2 dans : vitesse rapide. Charges de support : 100 %.
(2) charge : CO2 frais retard 120 s dans le cycle. Échange de vitesse : 5. nombre de Cycle : 12.
(3) gaz dehors : chaleur, rapide. Vitesse : lente, 50 %.- Selon les différences morphologiques des racines de maïs, des tiges et des feuilles, conception et impression paniers d’échantillon à l’aide d’une imprimante 3D (par exemple, la Figure 1).
- Placer les matériaux de plante séchée (racines de maïs, tige ou feuille) dans un tube à centrifuger de 50 mL avec 2 g d’iode solide pour teindre les matières végétales avec de la vapeur d’iode volatil et, ensuite, placer les tubes dans une chambre opaque pour 4-5 h.
2. micro-CT Scan protocole
- Pour numériser dans les données brutes de la CT, définissez le paramètres de tomodensitométrie comme suit : 40 kV/250 µA (pour tige et feuilles) ou 34 kV/210 µA (pour root). Régler le balayage des plages pour les différentes tailles et les volumes des matières végétales utilisées correspondant et ajuster les tailles pixel d’imagerie comme suit : 2,0 µm (pour les racines de maïs), 6.77 µm (pour la tige de maïs) et 10,0 µm (pour la feuille de maïs).
- Pour reconstruire des images de tranche, convertir les données brutes de CT en images tranche CT avec une résolution de 2K (2 000 x 2 000 pixels) grâce à un logiciel de reconstruction d’images. Plus de détails sont fournis dans le manuel d’utilisation de NRecon (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf).
3. image Protocole d’analyse d’une Image unique CT d’une tige de maïs ou une feuille
Remarque : Utiliser des logiciels d’imagerie automatique pour les faisceaux vasculaires pour effectuer l’analyse de phénotypage des faisceaux vasculaires dans les images de tranche de CT de la tige de maïs et de la feuille (Figure 2). Les étapes d’utilisation de logiciel sont décrites comme suit.
- Nommer le type d’orgue pour initialiser des pipelines d’algorithme différent. Cliquez sur le bouton paramètres de la méthode et sélectionner les souches de maïs ou de feuilles de maïs dans la première zone de liste déroulante.
- Pour importer les images, cliquez sur le bouton de gestion des données , définir le répertoire de travail et importer automatiquement toutes les images de tranche dans ce répertoire. Sélectionnez les images simples ou multi-slice dans les pipelines de l’image.
- Déterminer la taille réelle de pixel de l’image. Cliquez sur le bouton paramètres de la méthode et entrez la taille réelle de pixel de l’image dans l’élément de modification de la taille en pixels.
- Pour le calcul de phénotypage, cliquez sur le bouton de calcul phénotypage pour extraire automatiquement les caractères phénotypiques des faisceaux vasculaires pour toutes les images de la tranche sélectionnée.
- Cliquez sur le bouton d’analyse statistique pour générer les résultats comme un format de fichier TXT ou CSV.
4. image Protocole d’analyse de séries d’images CT d’une racine de maïs
Remarque : Les séries d’images CT des racines du maïs sont utilisés pour extraire les structures 3D des vaisseaux de métaxylème à l’aide du logiciel de traitement d’image. Les principales étapes sont les suivantes.
- Importer les images reconstruites des racines du maïs (dans le format de fichier BMP) et déterminer les paramètres d’espacement précis (la taille d’un voxel [c.-à-d., x, y, z]). Utilisez l’outil gaussien récursif pour lisser ces images afin d’améliorer la qualité de l’image.
- Conduite de segmentation 3D des vaisseaux de métaxylème en ajustant les paramètres de seuil ; Cela génère une étiquette de couleur uniforme pour chaque navire de métaxylème connectés.
- Améliorer et identifier les navires de métaxylème interactivement à l’aide de la morphologie, au niveau du bit et les inondations-remblais.
- Mener la reconstruction de visualisation et de surface volume des vaisseaux. Utilisez l’outil de statistiques de masque pour compter et mesurer les caractéristiques phénotypiques d’un navire dans les niveaux 2 et 3 dimensions.
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Representative Results
Le protocole de préparation d’échantillon adapté à ordinaire micro-TDM non seulement empêche la déformation des tissus végétaux mais aussi améliore le contraste d’absorption des rayons x. Matières végétales prétraitées sont analysés en utilisant un système de micro-CT dans la tranche haute qualité des images, et la plus haute résolution peut atteindre 2 µm/pixel. La figure 4 montre les images numérisées de la micro-CT de tige, feuilles et racine, et le contraste de l’image a une amélioration significative comparée avec les résultats analysés avec les matériaux de la plante fraîche. Dans ces images de tranche de CT, des différences significatives dans les valeurs de niveau de gris sont observables entre les faisceaux vasculaires, des cellules de parenchyme, les vaisseaux du xylème, épiderme et d’autres tissus.
Basé sur ce logiciel d’imagerie pour les faisceaux vasculaires, les caractéristiques de structure et la répartition des faisceaux vasculaires au sein de la section transversale de la tige ou de feuille peuvent être automatiquement analysés et quantifiés. Prendre l’image d’une tige de maïs à titre d’exemple, et l’algorithme de phénotypage du logiciel se compose de cinq étapes : segmenter l’image de la tranche, à segmenter les faisceaux vasculaires, à analyser la répartition spatiale des faisceaux vasculaires, à identifier et à améliorer les faisceaux vasculaires et calculer et générer les caractéristiques phénotypiques des faisceaux vasculaires. La région entière d’épiderme dans l’image, tout d’abord, segmentée selon des seuils spécifiques ou adaptative et contour analyse techniques sont effectuées pour extraire la région de l’épiderme (Figure 3 a et 3 b). Ensuite, la segmentation des faisceaux vasculaires est menée. Faisceaux vasculaires sont entourés de l’épiderme ; par conséquent, la région de l’épiderme avec l’épaisseur prédéfini est supprimée de l’image de la tranche. Le reste de l’image se compose uniquement de vascular bundles dispersés avec des intensités de pixels de haut et cellules du parenchyme avec des intensités faibles pixel. Ensuite, la segmentation d’image basée sur la valeur de seuil fixe est effectuée pour extraire toutes les régions de candidat des faisceaux vasculaires, et ces régions sont encore déterminées comme des faisceaux vasculaires valides selon les limites des caractéristiques de l’espace et la forme ( Figure 3 et 3D).
Après la segmentation des faisceaux vasculaires, caractéristiques de la distribution spatiale des faisceaux vasculaires sont extraites. Prenez les centres géométriques des faisceaux vasculaires épars comme des nœuds pour générer des maillages de triangles pour tous les faisceaux vasculaires à l’image de la tranche, et ces maillages sont regroupés en cinq catégories selon leurs domaines. Les zones des faisceaux vasculaires manifestent une baisse importante du centre vers le bord de la tige de maïs. La triangulaire et des maillages de Voronoï décrivent la répartition spatiale et les connexions topologiques de faisceaux vasculaires, et chaque maille est dessiné avec une couleur spécifique selon les résultats en cluster des faisceaux vasculaires (Figure 3F - 3 H). Les faisceaux vasculaires qui respectent les contraintes de distribution spatiale (zone de maille et la forme sont les indices importants pour déterminer la disponibilité des faisceaux vasculaires) sont réservés et utilisés pour produire les résultats de la finale de segmentation (Figure 3j’ai).
Au derniers caractéristiques phénotypiques des faisceaux vasculaires, telles que la forme géométrique, et information sur la distribution, peut être calculé selon l’analyse ci-dessus, qui se traduit par la sortie d’un fichier TXT ou CSV (Figure 3-J). Basé sur le logiciel d’imagerie pour les faisceaux vasculaires, 31 caractères phénotypiques de la tige peuvent être automatiquement analysés ; le temps de calcul moyen pour chaque image de CT est ~ 30 s. Les paramètres phénotypiques relatives de la tige sont indiquées dans le tableau 1. De même, 33 caractères phénotypiques de la feuille peuvent être extraite, le temps de calcul moyen est d’environ 50 s et ces classifications de paramètre sont illustrées dans le tableau 2. Pour obtenir la liste des images de la tranche, les pipelines d’analyse image ci-dessus sont intégrées dans un traitement par lots pour l’exécution automatique. Ce workflow est efficace pour analyser les caractéristiques phénotypiques de tous les faisceaux vasculaires dans une image de toute tranche d’une tige de maïs et de la feuille. En particulier, plus les caractères phénotypiques des faisceaux vasculaires, tels que la superficie totale, superficie moyenne et rapport des surfaces des faisceaux vasculaires, sont beaucoup difficiles à mesurer par mesures manuelles.
Parce que les vaisseaux de métaxylème des racines du maïs montrent des changements morphologiques évidentes dans la direction de la croissance des racines, il est plus précieux pour en extraire les structures 3D des récipients de métaxylème pour l’analyse phénotypique. Segmentation 3D, reconstruction de surfaces et visualisation de volume basé sur la série d’image de CT des racines de maïs, sont exécutées. Basé sur les résultats segmentés, les paramètres de structure 3D des vaisseaux de métaxylème peuvent être automatiquement calculés, dont le volume, superficie, transversale (basal) et transversale (distal) des navires métaxylème total et chacun navire de métaxylème unique. Ce flux de travail améliore considérablement l’efficacité de l’analyse 3D caractère phénotypique. Les résultats de la segmentation, la reconstruction et volume de visualisation peuvent se manifester directement les structures spatiales des vaisseaux de métaxylème de racines de maïs, comme illustré à la Figure 5.
Figure 1 : Différents types de paniers échantillon imprimé avec une imprimante 3-d. (A et B) le panier d’échantillon en spirale pour la leaf est composé avec groove d’un ovale central (A1) et (A2) la spirale environnante groove. La largeur de la rainure en spirale est fixée à environ 4 mm pour accueillir la feuille avec la veine principale. Les flancs de la rainure en spirale sont des trous de drainage carrés créés avec (A5) et le fond du panier avec les trous de drainage circulaire (B6). (C et D) Ces deux panneaux montrent un panier de quatre puits échantillon convenable pour la tige, avec des trous d’échantillon (C1) avec un diamètre de 25 mm et le fond du panier (D2) sept orifices, de drainage. (E et F) ces deux panneaux montrent un panier multipuits échantillon convenable pour la racine, avec (E1) quatre trous circulaires d’un diamètre de 10 mm dans la zone centrale et (E2) 13 trous circulaires d’un diamètre de 8 mm disposé près du bord du panier. Le fond du panier échantillon a les trous de drainage de 1 mm de diamètre pour s’assurer que les tissus racinaires minuscule ne fuient pas. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Captures d’écran du logiciel d’imagerie automatique pour les faisceaux vasculaires. (A), ce panneau montre la gestion de données pour importer des images de CT depuis n’importe quel répertoire de fichier, puis sélectionnez images tranche CT pour le traitement ultérieur. (B), ce panneau affiche les paramètres de la méthode pour identifier le type d’organe d’images tranche CT et configurer les paramètres de la méthode correspondante. (C), ce tableau montre le calcul de détermination du phénotype pour effectuer le calcul de lot d’images de tranche de CT et montrer la progression de l’exécution. (D), ce panneau indique l’analyse statistique pour vérifier les résultats des calculs et de générer des caractères phénotypiques pour toutes les images de CT. (E) ce panneau montre les résultats des calculs à l’analyse des résultats de sortie dans un fichier TXT ou CVS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Workflow de traitement d’images et de phénotypage de calcul basée sur des images de tranche CT. (A) importer l’image de tranche de CT de la tige de maïs. Segment (B) l’image tranche avec une valeur seuil fixe. (C) extrait l’ensemble de la région de la tige de maïs. Delete (D) la région de l’épiderme de la tige de maïs. (E) des maillages triangulaires des faisceaux vasculaires. (F), ce panneau indique une analyse de groupement selon les zones des faisceaux vasculaires. (G), ce panneau indique une analyse de groupement selon les zones des mailles triangulaires. (H) ce panneau montre qu'une analyse de groupement selon les régions de Voronoï maillages. (I) ce panneau montre les résultats finaux segmentés des faisceaux vasculaires. (J), ce panneau affiche la distribution spatiale des faisceaux vasculaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Images de reconstruction multiplane (MPR) de la tige de maïs, feuilles et racine. Le panneau de gauche montre une image MPR d’une coupe transversale de tige. Le panneau central montre une image MPR de tout un éventail de feuilles. Le panneau de droite montre une image MPR d’une coupe transversale de racine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Visualisation 3D des vaisseaux de métaxylème racine. Les barres = 0,2 mm. (A et B) ces panneaux montrent une visualisation 3D d’une racine. (C - F) ces panneaux montrent une visualisation 3D des vaisseaux de métaxylème. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Caractéristiques phénotypiques microscopiques de la tige de maïs.
Tableau 2 : Caractéristiques phénotypiques microscopiques de la feuille de maïs.
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Discussion
Avec l’application réussie de la technologie de CT dans les domaines de la biomédecine et science des matériaux, cette technologie a été progressivement introduite dans les domaines de la botanique et l’agriculture, la promotion de recherches en sciences de la vie comme un outil technique prometteur . Dans les années 1990, technologie CT a été tout d’abord utilisée pour étudier les structures morphologiques et développement des systèmes de racine de plante. Au cours de la dernière décennie, synchrotron HRCT est devenu un outil puissant, non destructif pour les biologistes de l’usine et a été utilisé avec succès pour identifier les structures tissulaires du système vasculaire raisin8, de la structure tissulaire de Arabidopsis leaf9 , 10et la structure de la graine de viol11. Par le synchrotron HRCT, grands progrès accomplis dans l’étude de la structure et la fonction des faisceaux vasculaires dans les plantes ligneuses12,13,14. Cependant, peu de recherches de technologie HRCT pour maïs, blé, riz et autres cultures a été fait le15. Maïs n’a aucune croissance secondaire, et la cellule se compose essentiellement de l’eau dans le méristème primaire. Bien que les échantillons frais peuvent être scannés par micro-CT sans aucun prétraitement, les résultats d’analyse sont très pauvres. Les principales raisons sont les suivantes : densité (1) faible atténuation des tissus végétaux, ce qui entraîne un faible contraste au numéro atomique et élevés de bruit dans les images ; (2) matériaux frais ont tendance à déshydrater et rétrécir pendant le balayage, tel que rapporté par Du6. Les raisons qui précèdent sont devenus les principaux facteurs limitant l’application de cette technologie en maïs, blé, riz et autres monocotylédones.
Ici, nous introduisons un protocole de préparation d’échantillon simple et pratique qui non seulement empêche la déformation des tissus végétaux mais aussi améliore le contraste d’absorption des rayons x. Haute qualité et haute résolution des images CT de racine, tige et feuilles sont obtenues basé sur le protocole de préparation d’échantillon et le système d’imagerie micro-CT, et la résolution la plus élevée a été jusqu'à 2 µm/pixel. Ainsi, le protocole de préparation d’échantillon est adapté pour ordinaire micro-tomodensitométrie et offre une excellente occasion pour des applications plus larges dans les monocotylédones et les autres sciences de la plante. Ce protocole peut facilement être modifié pour tenir compte d’autres matières végétales comme la déshydratation ou procédure de séchage et son paramétrage peut être ajustée selon les matières végétales spécifiques pour les meilleurs résultats. Notamment, cette approche est limitée par la taille et le volume de l’échantillon de la plante. Un segment d’échantillon trop épais peut conduire à séchage incomplet ou la déformation de l’échantillon. Par conséquent, ce protocole de préparation d’échantillon est applicable pour les matériaux d’une épaisseur inférieure à 3 cm petite plante et pas pour les matériaux de maïs beaucoup plus grandes comme maïs oreille ou s/n.
La technologie microscopique phénotypage du matériel végétal est l’un des sujets chauds des études phénotypiques plante ces dernières années, et il devient peu à peu une des technologies de support de base pour la génétique élevage et physiologie végétale. Analyse phénotypique microscopique traditionnelle des plantes nécessite un grand nombre de préparations complexes et fastidieuses opérations manuelles. Il est très fastidieux et chronophage compter et mesurer les caractéristiques microscopiques ; les résultats sont également sujettes à Erreurs subjectives. Par exemple, afin de quantifier les caractéristiques phénotypiques des faisceaux vasculaires dans une tige de maïs, l’échantillon de la tige doit être intégrée à la paraffine puis tranchés, colorés et imagés. Pour une image de tranche Taché, il est difficile d’effectuer une retouche automatique en raison de la définition ambiguë des limites d’une cellule ; segmentation et identification manuelle sont donc indispensables16. Pour satisfaire les exigences des mesures à grande échelle pour les caractères anatomiques de la tige de maïs, Legland et Heckwolf a présenté différentes méthodes de traitement d’image ; Toutefois, les structures des faisceaux vasculaires dans la couenne restent un défi17,18. Par conséquent, l’analyse d’image haut débit et une quantification précise des caractères anatomiques des tissus de maïs sont nécessaires. Ici, nous fournissons des logiciels d’imagerie automatique pour faisceaux vasculaires, ce qui permet d’extraire automatiquement 31 caractères phénotypiques des faisceaux vasculaires en ~ 30 s pour chaque image de CT de la tige de maïs et de 33 caractères phénotypiques à ~ 50 s pour chaque image de CT de la feuille de maïs. Les caractéristiques de structure et la répartition des faisceaux vasculaires au sein de la section transversale des tiges entières ou des feuilles peuvent être automatiquement analysés et quantifiés. Ce logiciel présente les avantages suivants : 1 elle automatiquement traite les images de tranche de CT de la tige de maïs et de la feuille et extrait les caractères phénotypiques des faisceaux vasculaires ; (2) il y a un taux plus élevé de reconnaissance des faisceaux vasculaires à l’image de CT, surtout pour les petits faisceaux vasculaires au bord ; (3) une méthode d’analyse graphique roman sert à révéler les caractéristiques de la distribution des faisceaux vasculaires.
En outre, la technologie d’analyse aux rayons x micro-CT a des avantages évidents dans l’efficacité de l’acquisition d’images et de la reconstruction par rapport aux techniques traditionnelles de reconstruction basées sur paraffine section images19,20 ,21. Un système de traitement d’image basé sur la série d’image de CT des racines de maïs, est mis au point pour extraire les structures spatiales des vaisseaux de métaxylème et utilisé avec succès pour la mesure 3D des caractères microscopiques. La principale limitation de ce régime est que les résultats segmentés 3D dépendent de la légère interaction manuelle. À l’avenir, notre objectif est d’élaborer un ensemble de logiciels d’analyse automatique image en 3D pour le dataset CT des racines du maïs pour améliorer l’efficacité de la segmentation 3D et de la reconstruction.
En conclusion, un balayage de micro-CT ordinaire basé sur un protocole de préparation d’échantillon pratique pour la tige de maïs, de feuilles, et racines est construit pour produire des images haute résolution de CT. Le protocole de préparation d’échantillon fourni ici non seulement empêche la déformation des tissus végétaux mais aussi améliore le contraste d’absorption des rayons x. Ce protocole convient aussi pour les autre applications dans le blé, le riz et autres monocotylédones de tomodensitométrie. Jusqu’ici, nous avons développé des logiciels d’imagerie automatique pour les faisceaux vasculaires, qui est capable de rapidement et automatiquement extraire les caractères phénotypiques des faisceaux vasculaires d’une seule image de CT de la tige de maïs et de la feuille. Basé sur la série d’image de CT de la racine du maïs, un système de traitement d’images est correctement configuré pour extraire les caractères phénotypiques 3D des vaisseaux de métaxylème. Les techniques de phénotypage microscopique du matériel végétal issu des micro-tomodensitométrie fournissent une perspective nouvelle pour la quantification précise et rapide et l’identification de maïs des faisceaux vasculaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par National Nature Science Foundation of China (No.31671577), la Science et technologie Innovation spécial Construction financés par le programme de Pékin Académie d’Agriculture et foresterie Sciences(KJCX20180423), la recherche Programme de développement de la Chine (2016YFD0300605-01), la Fondation des sciences naturelles de Beijing (5174033), la Beijing Postdoctoral Foundation (2016 ZZ-66) et recherche la Beijing Academy of Agricultural et subvention de Sciences forestières (KJCX20170404),) JNKYT201604).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skyscan 1172 X-ray computed tomography system | Bruker Corporation, Belgium | NA | For CT scanning |
| CO2 critical point drying system (Leica CPD300) | Leica Corporation, Germany | NA | For sample drying |
| Ethanol | Any | NA | For FAA fixation |
| Formaldehyde | Any | NA | For FAA fixation |
| Acetic acid | Any | NA | For FAA fixation |
| Surgical blade | Any | NA | For cutting the sample sgements |
| 3D printer | Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA | NA | For printing the sample baskets of maize root, stem, and leaf |
| Centrifuge tube | Corning, USA | NA | Place the root, stem, or leaf materials |
| Solid iodine | Any | NA | For sample dyeing |
| SkyScan Nrecon software | SkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgium | NA | For image reconstruction |
| VesselParser software | VesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, China | NA | Image analysis protocol for single CT image of maize stem or leaf |
| ScanIP | ScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UK | NA | 3D image processing software |
| Latex gloves | Any | NA | |
| Tweezers | Any | NA |
References
- Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
- Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
- Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
- Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
- Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
- Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
- Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
- Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
- Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
- Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
- Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
- Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295 (2013).
- Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
- Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673 (2014).
- Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26 (2015).
- Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
- Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655 (2015).
- Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829 (2016).
