Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Одновременное исследование вербовки Моноцит субпопуляций под поток в пробирке

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58509
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 3
1Hematology service, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 2Department of Pathology and Immunology, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva

Summary

Здесь мы представляем Интегрированный протокол, который измеряет Моноцит субпопуляция людьми под потока в пробирке путем использования конкретных поверхностных маркеров и конфокальный флуоресцентной микроскопии. Этот протокол может использоваться для изучения последовательного набора мер, а также относительно профиль другие подтипы лейкоцитов, используя другие конкретные поверхностных маркеров.

Abstract

Набор моноцитов в крови для целевых периферических тканях имеет решающее значение для воспалительного процесса во время повреждения тканей, развитие опухоли и аутоиммунных заболеваний. Этому способствует через процесс захвата от свободного потока на поверхность Люминал активированного эндотелиальных клеток, следуют их адгезии и трансэндотелиальной миграции (переселение) в базовом пораженной ткани. Однако механизмы, которые поддерживают преференциальных и контекстно зависимые вербовки Моноцит субпопуляций понимаются еще не полностью. Таким образом мы разработали метод, который позволяет набора различных Моноцит субпопуляций одновременно визуализировать и измеряется в поток. Этот метод, основанный на покадровой конфокальная томография, позволяет недвусмысленное различие между приверженцами и переселенных моноцитов. Здесь мы описываем, как этот метод может использоваться одновременно изучить набор Каскад pro ангиогенных и не ангиогенных моноцитов в пробирке. Кроме того этот метод может быть продлен изучить различные этапы найма до трех Моноцит населения.

Introduction

Моноциты являются фагоцитирующих компонентом врожденного иммунитета, которая необходима для борьбы с патогенами, очистка поврежденных тканей, ангиогенез и патофизиологии многих заболеваний, включая рак1,2,3 . Моноциты являются клетки костного мозга, полученных состоит из гетерогенных субпопуляций, которые циркулируют в крови, но могут быть набраны на месте воспаления в периферических тканях через конкретные молекулярные механизмы. Набор каскадов моноцитов, а лейкоцитов в целом подразумевает различные шаги, включая захват, прокатки, ползать, арест, трансэндотелиальной миграции (переселение) и миграции через стенку сосуда (базальной мембраны и росписи 4клетки). Эти шаги включают главным образом воспаления индуцированной молекул на поверхности эндотелиальных Люминал селектинов, гликопротеин лигандов, chemokines, молекулы адгезии межклеточных и соединительной и их рецепторов на лейкоциты например селектина лигандами и интегринов. Торговли людьми пути через либо развязок эндотелиальных клеток (параклеточный) или через эндотелиальные клетки тела (transcellular) может использоваться лейкоциты пересечь эндотелиальный барьер5. Хотя исторически были задокументированы моноцитов к высыпками через маршрут transcellular, потенциальные расхождения в их миграционных пути были предложены моноциты больше не считаются популяции однородных клеток. В настоящее время становится ясно, что разнообразие Моноцит могут быть определены каждым из их различий и общности, в отношении их отличительные кровоподтек каскады3,6. Таким образом чтобы однозначно различать Моноцит субпопуляций, крайне важно для визуализации и фенотип поведение каждого из этих различных субпопуляций в ходе набора процесса.

Моноциты от человека, свинки, крысы и мыши были подразделены фенотипического субпопуляции с некоторыми объясняется социальными функциями и конкретных миграционных поведения7,8,9. Например в организме человека, моноциты можно подразделить три подгруппы, основанный на их поверхности выражение CD14, coreceptor для бактериальных липополисахарида и CD16, Fc-гамма-рецептор III. Человека Моноцит субпопуляций включают в себя классические CD14 окрашенных CD16 ++-, промежуточные CD14 окрашенных CD16 +++ и неклассические CD14тускломCD16+ клетки6,9. Классическая CD14 окрашенных CD16 ++– моноцитов были показаны в основном воспалительных тогда как бассейн CD16+ моноцитов коллективно были найдены представить TIE2 выражения и proangiogenic функции10. Последовательно, стимуляции эндотелиальных клеток с воспалительных цитокинов, таких как некроза опухолей человека фактор (ФНО) α или интерлейкина (IL-1) бета (обычные воспаление) достаточно, чтобы вызвать полный набор классических CD14 окрашенных CD16 ++ – моноцитов. Тем не менее, одновременных действий Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и TNFα (ангиогенных факторов driven воспаление) требуются спровоцировать трансмиграции CD16+ proangiogenic бассейн моноциты3. Исторически традиционная система Transwell при статических условиях, Камера потока параллельной пластине и µ слайд потока камеры были использованы для количественного анализа набора одного лейкоцита населения на время в пробирке11 ,12,13. Хотя эти протоколы были подтверждены, более надежный метод, который позволяет одновременный анализ нескольких Моноцит субпопуляций будет считаться более глубокий. Такие методологии должны учитывать различные частоты каждого соответствующего населения и несколько взаимодействий и также предусматривают набор каскадов, которые определяют каждый Моноцит механистического понимания сходства и особенностей подмножество.

Здесь мы представляем метод, основанный на промежуток времени изображений набора Моноцит под поток, который позволяет мигрирующих каскады Моноцит различных субпопуляций одновременно быть изучены с помощью конфокальной микроскопии. Этот метод объединяет некоторых критических функций, которые имитируют эндотелиальных клеток воспаления, а также гемодинамики циркулирующих моноцитов в пост капиллярного венулы, основное место лейкоцита вербовки в естественных условиях. Предложенный метод использует эндотелиальных клеток человека пупочную вену (HUVEC), которые генерируются с помощью устоявшихся Протокол изоляции от человека пуповины. Этот клинический ресурс имеет преимущество легко доступны как побочный продукт биологического, также одновременно обеспечивая разумной доходности эндотелиальных клеток, которые могут быть изолированы от пупочную вену. Мы также использовали флуоресцентных красителей и иммунофлюоресценции для различения различных клеточных компонентов и confocal микроскопии однозначно определить Моноцит позиционирования (люминал против abluminal) с течением времени. Протокол, представленные здесь был разработан одновременно измерить уровни трансмиграции Моноцит субпопуляций. Кроме того следует отметить, что эта методология может быть расширен для изучения других субпопуляций лейкоцитов и процессы набора персонала путем использования различных биомаркеров и маркировки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

С осознанного согласия добровольцев доноров и в соответствии со швейцарской комитетов по этике клинических исследований были использованы материалы человека.

1. изоляция и замораживание человека пупочной вены эндотелиальных клеток (HUVEC)

  1. Добавьте 5 мл раствора покрытие в колбе T75 (0,1 мг/мл коллаген G и 0,2% желатина в солевой PBS фосфатного буфера при рН 7,4) для 30 минут при 37 ° C до начала HUVEC изоляции.
  2. Очистить шнур с PBS, протрите его стерильные компрессы и поместите его в стерильных 20 см Петри. Отрежьте концы шнура с стерильными ножницами.
  3. Определите один большой вен и два малых артерий. Аккуратно вставьте канюлю с трехходовой кран, прикрепленных к нему в Вену конечностях на концах кабеля.
  4. Затяните шнур и канюли связи прочно с длиной провода.
  5. Perfuse шнур дважды с 20 мл RPMI носитель, содержащий 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 ед/мл и 250 нг/мл амфотерицин B мыть шнур вен. Этот процесс делает внешний вид шнур белее и яснее. Пустые Вены перед добавлением коллагеназы, собирая RPMI с помощью шприца на одном конце.
  6. Perfuse вен с 12 мл 1 мг/мл коллагеназы типа I (0,22 мкм фильтрация).
  7. Закрыть кран на шнур заканчивается и инкубировать шнур при 37 ° C 12 мин.
  8. Нежно массируйте за шнур для отсоединения эндотелиальных клеток от просвета вены.
  9. Возьмите 30 мл RPMI, содержащие 10% плода телячьей сыворотки с 50 мл шприц и подключить его к одному концу пуповины.
  10. Подключите пустой 50 мл шприц в другой конец пуповины
  11. Откройте кран и perfuse вен с одного конца, хотя взаимно сбор с другого конца.
    Примечание: Собранные суспензии содержит эндотелиальных клеток.
  12. Центрифуга этот суспензию клеток на 200 x g за 5 мин.
  13. Отменить супернатант и Ресуспензируйте клетки лепешка с 10 мл полного среднего M199 (M199 добавки, содержащие 20% FCS, рост эндотелиальных клеток 15 мкг/мл, 100 мкг/мл гепарина натрия, 0,5 мкм гидрокортизон, 10 мкг/мл L-Аскорбиновая кислота, 100 ед/мл пенициллин, 100 ед/мл Стрептомицина и 250 нг/мл амфотерицин B).
  14. Удалить раствор для нанесения покрытия из T75 колбу и один раз промыть PBS.
  15. Семя клетки собраны из шага 1,13 в колбу T75 и поместите его в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2.
  16. Следующий день, промойте колба 3 раза с полного среднего M199 удалить остаточные красных кровяных клеток, а затем изменить носитель каждые 2 дня до слияния.
  17. При впадении в 80 – 90% промойте HUVEC монослоя раз с 5 мл PBS и отсоединение клетки с 5 мл 0,05% трипсина в 1 мм ЭДТА при 37 ° C за 5 минут добавить 4 мл M199 и 1 мл FCS прекратить действие трипсина. Промойте Фляга для отсоединения всех HUVEC.
  18. Собирайте Алиготе 50 мкл использоваться для окрашивания VE-Кадгерины, PECAM-1 и gp38, и анализировать подачей cytometry проверить чистоту HUVEC.
  19. Сбор на оставшуюся часть HUVEC от шага 1.18 в 15 мл трубки и центрифуги на 200 x g 5 мин при комнатной температуре.
  20. Отменить супернатант из шага 1.19, Ресуспензируйте Пелле клеток в замораживания раствора (FCS, содержащие 10% ДМСО) на плотности тарелок 5 x 105 клеток/мл в cryotubes и заморозить при температуре-80 ° C или в жидком азоте до использования.
  21. Чтобы проверить HUVEC чистоты:
    1. Добавьте 1 мкл антител против человека VE-Кадгерины FITC, 1 мкл антител против человека PECAM1-PE и 1 мкл антител против человека Podoplanin-APC Алиготе 50 мкл HUVEC, собранных на этапе 1.18.
    2. Инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.
    3. Добавить 100 мкл PBS и центрифуги 400 x g 30 s.
    4. Отменить супернатант и Ресуспензируйте в 100 мкл PBS. Данные теперь могут быть приобретены потока цитометрии методами.
      Примечание: HUVEC позитивные для VE-Кадгерины и PECAM-1 и негативные для Podoplanin.

2. HUVEC размораживания

Примечание: Использование HUVEC на низкий проход для экспериментов (максимум 5 ходов).

  1. Герб T75 флакон с 1 мл раствора покрытие при 37 ° C за 30 мин.
  2. Быстро разморозить HUVEC при 37 ° C на 2 мин и Ресуспензируйте клетки в 10 мл полной M199.
  3. Центрифуга клетки на 200 x g при комнатной температуре в течение 5 мин и удалить супернатант.
  4. Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл полной M199.
  5. Передача суспензию клеток в предварительно покрытых колбу. Место колбу в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2. Измените ячейки питательной среды каждые 2 дня.

3. HUVEC культура в камере 0.4 мкг слайд

  1. Пять дней до начала эксперимента потока, предварительно покройте палат 0.4 мкг слайд с 30 мкл PBS, содержащие 0,1 мг/мл коллаген G, 0,2% желатина при 37 ° C за 30 мин.
  2. Вымойте камер с 100 мкл PBS.
  3. Отсоедините клетки от 80 – 90% вырожденная HUVEC T75 колбы.
  4. Промойте HUVEC 5 мл PBS и отсоединить их с 5 мл 0,05% трипсина при 37 ° C за 5 мин.
  5. Потолочные и собирать суспензию клеток в полной M199 и подсчитать количество ячеек по наиболее удобным способом. Центрифуга на 200 x g 5 мин при комнатной температуре.
  6. Ресуспензируйте Пелле клеток на 106 клеток/мл и распространять 30 мкл (30000 клеток) на камеру.
  7. Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2 на 1 ч.
  8. 150 мкл полного M199 для каждой камеры и культура клетки на 5 дней в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2. Измените носитель каждые 2 дня.

4. HUVEC пятная для Assay Моноцит набора под поток

  1. Подготовить маркировки среднего M199 и 1 мкм CMFDA (5-chloromethylfluorescein диацетата) и тепло при 37 ° C за 5 мин до клеток маркировки.
  2. Вымойте HUVEC дважды с M199 среднего нагревается при 37 ° C.
  3. Замените 30 мкл утепленные маркировки среды, содержащие 1 мкм CMFDA среды и поместите в инкубатор при 37 ° C и 5% CO2 за 10 мин.
  4. Мыть раз с полным M199 и инкубировать клетки с полным M199 в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 на 30 мин.
    Примечание: Важно удалить все следы сыворотки перед добавлением раствора маркировки, в противном случае она может изменить HUVEC пятнать.
  5. Заменить в среду с полным M199 содержащие либо человека TNFα (500 ед/мл) или смесь человека TNFα (500 ед/мл) с человеческой VEGFA (1 мкг/мл) за 6 ч в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.

5. изоляция человека Пан моноцитов и пятнать субпопуляций

  1. Используйте Баффи слой концентрированного человеческой крови, или 20 мл свежевыделенных человеческой крови, собранные в день эксперимента в ЭДТА vacutainer трубы.
  2. Разбавить кровь в PBS-1 мм ЭДТА (1:1) и аккуратно Пипетка 20 мл разбавленной крови поверх 20 мл градиента плотности средств массовой информации. Центрифуга на 400 x г за 30 мин при комнатной температуре с медленным ускорение и без тормозов.
  3. Собирать мононуклеарных клеток периферической крови (КСДОР)-уровень тромбоцитов (между СМИ градиента плотности и плазмы слои) в новый Тюбик 50 мл, содержащие 40 мл PBS - 1 мм ЭДТА. Топ 50 мл с ЭДТА PBS - 1 мм.
  4. Центрифуга на 200 x g при комнатной температуре на 5 мин отбросить супернатант.
  5. Ресуспензируйте клетки лепешка с 10 мл окрашивание буфера (PBS - 1 мм ЭДТА содержащих 0,5% альбумина bovine сыворотки BSA).
  6. Центрифуга на 200 x g при комнатной температуре на 5 мин отбросить супернатант.
  7. Повторите шаги 5.5 и 5.6.
  8. Ресуспензируйте клетки лепешка с 10 мл окрашивания буфера. Возьмите Алиготе 10 мкл для подсчета клеток.
  9. Проверьте КСДОР населения и подсчитать ячейки быстро с проточный цитометр.
    Примечание: Характеристика лимфоцитов и моноцитов населения может наблюдаться (рис. 1A). От 50 мл свежей крови человека ожидать о 50-100 х 106 КСДОР.
  10. Для найма CD14 + против CD14-КСДОР под поток:
    1. Помыть лепешка три раза с буфера потока (M199 содержащих 0,5% BSA) и Ресуспензируйте мононуклеарных клеток в буфере потока на 6 x 106 клеток / мл.
    2. Сделайте аликвоты 200 мкл калибровочных. Инкубируйте при 37 ° C до 20 мин до assay.
    3. Мкл 5 анти CD14-PE и Hoechst 33342 в конечной концентрации 2 мкм для каждого Алиготе. Смешать и инкубировать при 37 ° C за 10 мин.
    4. Центрифуга Алиготе на 400 x g 30 s.
    5. Отменить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 200 мкл буфера потока.
  11. Для найма Моноцит субпопуляций в поток:
    1. Изолируйте моноциты с комплектом Пан Моноцит изоляции согласно инструкциям производителя.
      Примечание: Следующий протокол изоляции предназначен для 50 x 106 клеток. Он может масштабироваться вверх или вниз, пока он находится в пределах рекомендациям изготовителя.
    2. Центрифуга КСДОР подвеска на 200 x g при комнатной температуре в течение 5 мин.
    3. Отменить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 400 мкл окрашивания буфера.
    4. Добавьте 50 мкл Реагента Fc рецептор блокировки и 50 мкл антител Пан Моноцит коктейль.
    5. Инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.
    6. Окрашивание буфера и 100 мкл магнитной бусины конъюгированных антител анти биотина 400 мкл. Инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
    7. Добавить 2 мл окрашивание буфера и использовать столбец MACS LS, в сочетании с магнитом.
    8. Разместите LS столбца на магните и добавьте 1 mL окрашивания буфера. Отказаться от потока через.
    9. Передайте КСДОР подвеска в столбце и собирать четкий поток хотя содержащие Пан моноцитов в новой трубки 15 мл.
    10. Добавьте окрашивание буфера к началу до 5 мл.
    11. Возьмите Алиготе и проверить качество изоляции Моноцит с проточный цитометр.
    12. Определите количество Моноцит Пан.
      Примечание: Только Моноцит население может наблюдаться (рис. 1B).
    13. Центрифуга оставшуюся часть моноциты из шага 5.11.11 при 200 x g за 5 мин.
    14. Выбросите супернатант.
    15. Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл буфера потока (M199 содержащих 0,5% BSA).
    16. Повторите 5.11.13 для 5.11.14 дважды для устранения следов ЭДТА.
  12. Сделать Моноцит приостановления потока буфера (M199 с 0,5% BSA) в 6 х 106 клеток/мл.
  13. Сделайте аликвоты 200 мкл моноцитов для каждого набора assay.
  14. Держите Алиготе при 37 ° C в инкубаторе до 20 мин перед инъекцией.
  15. Добавьте 5 мкл антител анти CD16-PE и Hoechst 33342 (окончательный 2 мкм) для каждого Алиготе.
  16. Смешать и инкубировать при 37 ° C за 10 мин.
  17. Центрифуга Алиготе на 400 x g 30 s.
  18. Отменить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 250 мкл буфера потока.
  19. Мкл 30 взвеси Моноцит в одной палате слайд, чтобы служить для настройки параметров получения конфокального микроскопа.
  20. Держите аликвоты Моноцит подвеска из шага 5.18 при 37 ° C.
    Примечание: Эта подвеска готова быть введен в системе потока.

6. Подготовка оптимизированных системы

  1. Убедитесь, что ячейка инкубатора для изображений на 37 ° C.
    Примечание: Схема потока системы показан на рисунке 2.
  2. Соберите трубки часть I: вставьте люэровский коннектор папа один конец кусок силиконовые трубки (8 см длиной и 3 мм толщиной) и подключите другой конец к набору инъекции Luer в линии. Подключите второй Luer к кусок силиконовые трубки (40 см и 3 мм толщиной) на одном конце.
    Примечание: При необходимости 3-ходовой кран, подключенных к шприц 5 мл может быть вставлен между инъекции Luer в линии и силиконовые трубки для возможного воздушного пузыря удаления.
  3. Соберите трубки часть II: подключение 20 мл шприц один конец длиной силиконовые трубки (длиной 1 м и толщиной 3 мм). Вставьте люэровский коннектор папа в другой конец трубки.
  4. Подключите часть I и часть II труб, вставив разъем мужчины Luer для женского Luer замок автосцепки (рисунок 2A).
  5. Положите свободный конец трубки силиконовые в водохранилище, содержащий буфер потока (M199 + 0,5% BSA) нагревают при 37 ° C.
  6. Потяните поршень шприца 20 мл для заполнения трубки с потока буфера.
  7. Поместите шприц на насос и закрепите его.
  8. Установите насос в отказаться режим (в отличие от на настаиваться) и укажите скорость потока.
  9. Определите скорость потока согласно IBIDI слайд, используемый с помощью следующей формулы:
    Equation
    Примечание: Слайд фактор зависит от IBIDI слайд, используемый для эксперимента. Для µ слайд я0,4 люэровского, используемые в этом примере, слайд фактор – 131,6. Для конкретных слайд факторов смотрите веб-сайт компании14. Вязкость буфера потока является 0,0072 dyn.s/cm2. Касательное напряжение на пост капиллярного венулы составляет около 0,5 дин/см2.
  10. Подключите слайд (рис. 2B):
    1. Зажим силиконовые трубки вокруг женского Luer Lock муфта и отсоедините два самца Luer разъем от стяжку.
    2. Подключите их к водоемам слайд, содержащий стимулировали HUVEC и заполнить с среднего. Избегайте воздушных пузырей во время этого шага.
    3. Снимите зажимы и убедитесь, что подключение не протекает.
  11. Поместите слайд под микроскопом для покадровой воображения и запуска насоса.

7. промежуток времени визуализации Моноцит вербовки под потока конфокальная микроскопия

  1. Использовать цель 40 x (см. Таблицу материалы) для изображений.
  2. Активировать 405 нм (синий Моноцит ядер), 488 нм (зеленый эндотелиальных клеток) и 561 Нм (красный CD16 + подмножество) лазеры.
  3. Использование камеры, содержащий моноциты установить параметры приобретения.
    Примечание: Чтобы обнаружить-переселено и переселенных моноцитов, обскуры и интенсивности лазера 405 нм устанавливаются высокие. Таким образом моноциты переселено слегка видны в плане базальной. Однако только переселенных моноциты представляют безупречный район вокруг ядра, соответствующее новое пространство под эндотелиальных клеток.
  4. Место камеры, чтобы быть приобретены под микроскопом.
  5. Выберите 3 поля представлений в радиусе 1 см для многопозиционных конфокальная томография.
  6. Определение базальной и апикального стороны эндотелиальных клеток
  7. Установка z стека в диапазоне 10-12 мкм (шаг 0,5 мкм). Запуск промежуток времени приобретения каждые 1 мин.
  8. После 3 минут изображений придать 200 мкл суспензии Моноцит (6 x 106 клеток/мл) через порт впрыска Luer в линии.
    Примечание: Быстро моноцитов появляются в апикальной фокальной плоскости, присоединиться и начать трансмиграции (транзит из апикального базальной план).
  9. Изображение для по крайней мере 30 минут. После завершения, остановить изображений и остановить поток. Зажим трубы, чтобы отсоединить их от слайда.
  10. Исправьте слайд с параформальдегида 4% на 4 ° C на 10 мин.
  11. Вымойте слайд с PBS и сохранять слайд на 4 ° C для дальнейшего анализа, если это необходимо.

8. анализ данных с ImageJ

  1. Подсчитать количество всего адэрентных моноцитов в каждом поле. Определите количество клеток в мм2.
  2. Граф переселенных моноцитов, которые присутствуют в плане базальной под эндотелиальных клеток и выявленных наличием черной дыры (в зелёном канале) вокруг ядра.
  3. Разделите количество переселенных лейкоцитов на общее количество адэрентных лейкоцитов. Трансмиграции курс представлен в процентном отношении адэрентных моноцитов.
  4. Для иллюстрации верхушечный и базальной стороны могут отображаться одновременно чтобы проиллюстрировать событий, происходящих в каждой из этих эндотелиальной отсеков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Определение состояния активации HUVEC индуцированных TNFα

Био активности воспалительных цитокинов TNFα может зависимости пакета и пресыщения цикла замораживания оттаивания. Важно проверить состояние активации HUVEC TNFα лечения. Это может быть выполнена путем пятнать параллельно некоторые образцы вырожденная HUVEC для воспалительных индукции селектинов, ИКАМ-1 и VCAM-115,16,17. Легче и проще способ проверить состояние активации HUVEC после лечения TNFα это морфологические изменения отображаются на эндотелиальных клеток воспалительный стрессовом. Как показано на рисунке 3, HUVEC удлиненное после 6-h в присутствии TNFα по сравнению с кератоз клетки. Подобные удлинение наблюдается простимулировано HUVECs смесь TNFα и VEGFA. Запись состояния активации HUVEC важно как окончательные результаты трансмиграции моноциты будет зависеть качество активацию эндотелиальных клеток.

Моноцит трансмиграции делает характерный прекращения в эндотелиальных клетках

Для изучения Моноцит трансмиграции под поток, мы использовали конфокальная микроскопия с эндотелиальных клеток, окрашенный в зеленый цвет с CMFDA и ядер изолированных моноцитов, окрашенные в голубой с клетки проницаемой краситель Hoechst 33342 (рис. 4). Покадровой конфокальная томография допускается, что визуализация моноцитов в апикальной плоскости, где их фенотипом могут быть оценены (рис. 4A-C, дополнительные фильм 1). Мигрирующих клеток происходят трансмиграции переехала в межклеточном пространстве, соответствующий ячейке развязок прежде чем они исчезли из плоскости апикальной и появилась в плоскости базальной. Переселенные клетки представил чёрной дыры вокруг ядра, соответствующие Моноцит фигур. Эта форма, постоянно меняется во время миграции Моноцит под эндотелиальных клеток (рис. 4A-C, дополнительные фильмы 2-3). Этот динамический черная дыра Моноцит органом под эндотелиальных клеток и позиционирование Моноцит, допускается для однозначной идентификации переселенных клеток. Количественный Моноцит набора с течением времени показал Моноцит адгезии следуют трансмиграции (Рисунок 4 d-E). Хотя лейкоциты могут extravasate через transcellular и параклеточный маршруты, мы могли только наблюдать за параклеточный переселения под поток с помощью этого метода. Это согласуется с нашими18,3,предыдущие замечания версии11,19.

Ангиогенных факторов инициативе воспаление способствует трансмиграции CD16 + моноциты

С помощью этого метода, мы проанализировали трансмиграции человека proangiogenic по сравнению с не ангиогенных моноциты через эндотелиальные монослоя, стимулируется воспалительных цитокинов TNFα самостоятельно или в сочетании с ангиогенных факторов VEGFA. Моноциты человека proangiogenic может быть идентифицирован выражение CD16 или TIE2 на их поверхности. Здесь антитела анти CD16-PE был использован для выявления различий между про - и не ангиогенных моноцитов. Как показано на Рисунок 5A-B (дополнительные фильмы 4-5), темпы переселения CD16+ моноцитов была низкой, когда эндотелиальные клетки были стимулируется с TNFα только. Однако этот показатель вырос, когда эндотелиальные клетки были одновременно стимулировали TNFα и VEGFA (рис. 5 c-E, дополнительное фильмы 6-7). Переселение не ангиогенных моноциты составлял аналогично высокой оба воспалительные условиях. Для обоих субпопуляции клеток переселение произошло исключительно через параклеточный маршрута. Поэтому этот метод позволяет трансмиграции способностей различных monocytic групп населения должны расследоваться одновременно.

Чистоту моноциты влияет на эффективность перелетах

Мононуклеаров периферической крови состоят из Т-клетки, клетки B, НК-клеток и моноцитов. Используемый здесь метод изоляции Моноцит требует истощения других популяций лейкоцитов из КСДОР. Чтобы понять, как отсутствие чистоты Моноцит влияет на результаты, мы использовали репликацию и витражи для Пан моноциты с антитела анти CD14-PE перед выполнением набора assay под потока. Как показано на рисунке 6, HUVEC стимуляции с TNFα или TNFα + VEGFA индуцированных трансмиграции только Моноцит населения. Другие лейкоциты состоят из клеток T, B-клеток и NK клеток не высыпками под TNFα или TNFα + VEGFA. Действительно было документально, что эти лейкоциты нуждаются другие сигналы для переселения. Таким образом неэффективность изоляции моноцитов приведет к недооценке Моноцит трансмиграции, как другие лейкоциты будет считаться моноцитов. Это приведет к ошибочный результат на Моноцит трансмиграции, из-за загрязнения Моноцит населения с другими лейкоцитов.

Figure 1
Рисунок 1: Профилирование изолированных моноцитов подачей cytometry. (A) анализ морфологии КСДОР до истощения лимфоцитов. Размер (вперед разброс: FSC) и степень детализации (стороне разброс: SSC) мононуклеаров периферической крови определяется проточной цитометрии. (B) размер и степень гранулярности изолированных моноцитов были определены подачей cytometry после истощения лимфоцитов. Эффективной изоляции моноцитов показывает полное истощение населения лимфоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: схема системы аэрогидродинамических. (A) Схематический обзор перфузии системы до и после подключения слайд и монтажа на шприцевой насос. (B) схема процесса соединения слайд с труб с помощью хомутов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Проверка эффективности активацию эндотелиальных клеток. Активации HUVEC воспалительных стимулами была проверена путем анализа форме ячеек с помощью фазово-контрастной микроскопии. После 6 часов лечения, HUVEC представляют удлиненные морфология при стимуляции с TNFα (500 ед/мл) или смесь TNFα (500 ед/мл) + VEGFA (1 мкг/мл) по сравнению с кератоз клеток. Это морфологические изменения HUVEC после воспалительных стимуляции является показателем легко обнаружить активации клеток, которая должна быть обеспечена для анализа потока. Шкалы бар = 120 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: идентификацию переселенных моноцитов, конфокальная микроскопия. (A) схема Моноцит переселения с ожидаемой видом на апикальной и базальной плоскости. Ядер моноцитов, окрашенных с Hoechst 33342 изображены синим, и теоретические формы моноциты изображаются пунктирными линиями вокруг ядра. В представлении базальной переселенные плоский моноциты показано занимают пространство под эндотелиальных клеток. Это место выглядит как черная дыра, окружающих ядро Моноцит конфокальный изображений. (B) локализация Моноцит до и после переселения. Ортогональных показываются, и появление черной дыры (определенная с белой пунктирной линией) может наблюдаться после Моноцит миграции в отсеке эндотелия abluminal. Красная стрелка указывает положение Моноцит до переселения и белая стрелка показывает ту же ячейку после переселения. Ортогональных показывают, что переселенные Моноцит под эндотелиальных клеток. Шкалы бар = 40 µm. (C) покадровой последовательности изображений (от 0 до 20 мин) Моноцит набора сверхурочных. Представления апикальной и базальной показываются. Полной последовательности можно увидеть в дополнительном фильмы 1, 2 и 3. Красные квадраты выделить переселенных Моноцит с голубой ядром. Черная дыра, соответствующий плоские орган Моноцит под эндотелиальных клеток, разделенное пунктирной желтой линией. Шкалы бар = 40 µm. (D) кератоз количественного определения адгезии Моноцит TNFα-стимулирует против HUVEC с течением времени. (E) количественную оценку темпов переселения Моноцит со временем. N = 3 биологических реплицирует. Данные представлены как среднее ± с.д. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: одновременное исследование трансмиграции Моноцит субпопуляций под потока. (A) промежуток времени изображение последовательности (от 0 до 20 мин) вербовки proangiogenic моноцитов (CD16+) и не ангиогенных моноцитов со временем через TNFα-активированный HUVEC. Шкалы бар = 40 мкм; представления апикальной и базальной показываются. Полной последовательности можно увидеть в дополнительном кино 4 для апикальной и Дополнительные фильм 5 для базальной представлений. (B) количественный трансмиграции человеческого proangiogenic моноцитов (HPMo: CD16 +) и моноцитов (HNMo) человеческий не ангиогенных через TNFα-активированный HUVEC монослоя. N = 4 биологические реплицирует данные представлены как среднее ± с.д. * p < 0,05; Тест Манна-Уитни. (C) промежуток времени изображение последовательности (от 0 до 20 мин) вербовки proangiogenic и не ангиогенных моноциты сверхурочных через TNFα + VEGFA-активированный HUVEC. Шкалы бар = 40 мкм; представления апикальной и базальной показываются. Полной последовательности можно увидеть Дополнительные фильм 6 для апикальной и Дополнительные фильм 7 для базальной представлений. (D) количественный трансмиграции человеческого proangiogenic моноцитов (HPMo: CD16 +) и человека не ангиогенных моноцитов (HNMo: CD16-) через TNFα + VEGFA-активированный HUVEC монослоя. N = 4 биологические реплицирует данные представлены как среднее ± с.д. * p < 0,05; Тест Манна-Уитни. (E) моноциты локализации окрашенных CD16 ++ до (10 мин) и после переселения (15 мин) через TNFα + VEGFA-стимулирует HUVEC. Ортогональных представлений отображаются. Шкалы бар = 40 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Одновременное исследование переселения CD14 + против CD14 - КСДОР под потока. (A) адгезии CD14+против CD14– КСДОР для TNFα-активированный HUVEC под потока. (B) адгезии CD14+против CD14– КСДОР для TNFα + VEGFA-активированный HUVEC под потока. (C) трансмиграции CD14 ставка (%)+против CD14– КСДОР через TNFα-активированный HUVEC под потока. (D) трансмиграции CD14 ставка (%)+против CD14– КСДОР через TNFα + VEGFA-активированный HUVEC под потока. Данные являются среднее ± с.д. N = 4 биологические реплицирует. * p < 0,05; Тест Манна-Уитни. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные фильм 1: вид в плоскости апикальной Пан Моноцит вербовки под потока. Расширенный вид вербовки Пан Моноцит под поток в апикальной плоскости. HUVEC окрашивали CMFDA и ядер моноциты были жить витражи с Hoechst 33342. Шкалы бар = 50 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительные фильм 2: взгляд на базальная плоскость Пан Моноцит вербовки под потока. Расширенный вид вербовки Пан Моноцит под поток при базальная плоскость. HUVEC окрашивали CMFDA и ядер моноциты были жить витражи с Hoechst 33342. Шкалы бар = 50 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительные фильм 3: максимальная проекция z стеки Пан Моноцит вербовки под потока. Расширенное представление о вербовке Пан Моноцит под потока, как показано в дополнительном фильмы 1 и 2. HUVEC окрашивали CMFDA и ядер моноциты были жить витражи с Hoechst 33342. Шкалы бар = 50 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительные фильм 4: вид в плоскости апикальной вербовки Моноцит субпопуляций в ФНОα-активированный HUVEC. Расширенный вид на апикальной плоскости одновременного вербовки Моноцит субпопуляций под поток для TNFα-активированный HUVEC под потока. HUVEC окрашивали CMFDA и ядер моноциты были жить витражи с Hoechst 33342. Моноцит субпопуляций человека proangiogenic были определены поверхности выражением CD16. Шкалы бар = 30 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительные фильм 5: взгляд на базальная плоскость вербовки Моноцит субпопуляций в ФНОα-активированный HUVEC. Расширенный вид в плоскости базальной, одновременное вербовки Моноцит субпопуляций под поток TNFα-активированный HUVEC под потока. HUVEC окрашивали CMFDA и ядер моноциты были жить витражи с Hoechst 33342. Человеческого proangiogenic субпопуляция Моноцит (HPMo) был опознан поверхности выражение CD16. Шкалы бар = 30 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительные фильм 6: вид в плоскости апикальной вербовки Моноцит субпопуляций в ФНОα+ VEGFA-активированный HUVEC. Расширенный вид в плоскости верхушечный, одновременное вербовки Моноцит субпопуляций под поток TNFα + VEGFA-активированный HUVEC под потока. HUVEC окрашивали CMFDA и ядер моноциты были жить витражи с Hoechst 33342. Моноцит субпопуляция человека proangiogenic был опознан поверхности выражение CD16. Шкалы бар = 30 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительные фильм 7: взгляд на базальная плоскость вербовки Моноцит субпопуляций в ФНОα+ VEGFA-активированный HUVEC. Расширенный вид в плоскости базальной, одновременное вербовки Моноцит субпопуляций под поток TNFα + VEGFA-активированный HUVEC под потока. HUVEC окрашивали CMFDA и ядер моноциты были жить витражи с Hoechst 33342. Человеческого proangiogenic субпопуляция Моноцит (HPMo) был опознан поверхности выражение CD16. Шкалы бар = 30 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы приводим метод подробно исследование как Моноцит субпопуляций высыпками через воспаление эндотелия монослоя. Обсудили метод используется confocal микроскопии вместо фазово контрастной микроскопии, который также используется для изучения набора Моноцит под поток3,11,19. Одним из основных преимуществ использования confocal микроскопии для покадровой изображений является возможность однозначно различать трансмиграции и сильная адгезия моноцитов. Хотя фазово контрастной микроскопии-метод, основанный на также является надежным, он требует опыта во избежание смешения переселенных клеток и сильно адэрентных клеток. В этом случае необходимо установить строгие критерии для анализа для того, чтобы сделать четкое различие между этими двумя государствами Моноцит набора Каскад. Кроме того это также важно для выполнения анализа конечной точки на confocal микроскопии для того, чтобы подтвердить глобальные тенденции фазово контрастной микроскопии. Таким образом прямое использование confocal микроскопии расследовать Моноцит набора под поток обеспечивает четкие результаты на состояние фактического переселения захваченных моноцитов.

Одним из основных узких мест в выполнении набора лейкоцита assays под потока и с помощью микроскопа фазово контрастной является время, затраченное для выполнения анализа и отслеживания отдельных ячеек от захвата в перелетах через соединение ячеек. Автоматизации такого анализа можно, но сложно выполнить из-за сходства фазово контрастной обхода и переселенных моноцитов. Здесь мы покажем с помощью конфокальной микроскопии Моноцит переселение сопровождалось прекращением эндотелиальных клеток, пятнать в плоскости базальной, соответствующего форме переселенных моноциты под HUVEC. Это положение было подтверждено ортогональной проекции. Переход Моноцит локализации произошел исключительно между выходами ячейке свидетельствует о параклеточный трансмиграции. Это согласуется с нашими предыдущие данные, которые показали, что под потока в пробирке, моноциты высыпками исключительно через параклеточный маршрут с HUVEC3,18. В дополнение к метод, предложенный здесь, это можно использовать неблокирующий антител против соединительной белки, например VE-Кадгерины, джемы или PECAM1 для того, чтобы фотография потенциальных мест Моноцит переселения (параклеточный против transcellular). Мы подтвердили, что черные фигуры, вокруг ядра Моноцит надежные характерны переселенных клеток и простое событие, которое может быть обнаружено программное обеспечение. Даже несмотря на то, что здесь проявляется ячейку вручную, система подсчета, черный формообразования вокруг ядра лейкоцитов является критерием, который может использоваться для определения лейкоцита переселения в автоматизированный анализ, таким образом экономя массу времени. В настоящее время мы работаем по разработке Автоматизированные приложения для такого анализа.

Флуоресценции и confocal микроскопии ранее были использованы в исследовании лейкоцита вербовки. Однако они не использовались для изучения набора различных субпопуляций одновременно. Здесь мы предлагаем механизм использования confocal микроскопии для изучения набора лейкоцита подтипы одновременно в том же микроокружения. Мы покажем, что конфокальная микроскопия может использоваться одновременно расследовать мигрирующих поведения различных Моноцит субпопуляции. В качестве примера мы использовали выражение CD16 различать proangiogenic и не ангиогенных моноциты с целью изучения трансмиграции потенциала двух субпопуляции в различных воспалительных контекстах. В соответствии с нашей недавней публикации, с помощью конфокальной микроскопии модальности, мы показали, что уровень трансмиграции CD16+ моноцитов был ниже простимулировано эндотелиальных клеток монослой был только TNFα3. Однако сочетание TNFα и VEGFA привело к увеличению в перелетах proangiogenic моноцитов. Переселения составлял аналогично высокой для не ангиогенных CD16– моноцитов в обоих воспалительные условиях. Мы ранее показали что Моноцит окрашивание с анти CD16 антитела не представляет каких-либо значительное влияние на перелетах, подтверждающий это путем анализа немеченого моноциты после переселения assay, с помощью конфокальной микроскопии3. Однако новые подтипы лейкоцитов или антител, используется, чтобы пометить их, обозначая эффекта необходимо оценивать. С помощью этого метода, до трех различных популяциях лейкоцитов может быть одновременно учился. Это может быть субпопуляций, которые являются типами функционально различных или аналогичных иммунных клеток. Хотя основное внимание здесь уделяется Моноцит трансмиграции, другие шаги их вербовки также могут быть проанализированы этим методом, включая поведение клеток до переселения, такие, как захват и миграционном направленность. После переселения как abluminal сохранение и обратного переселения могут также быть расследование событий для населения различных лейкоцитов, как расширение данного метода. Единственным ограничением является бедным обнаружения пятнать в far-red канале в промежуток времени изображений, а также некоторые пролито флуоресценции сигналов, которые снижают резолюции z стека. Это было связано главным образом с инструментом, используемым для конфокальная томография. Использование изображения деконволюция в конечном итоге может помочь улучшить качество изображения и позволить дальнейшего анализа различных этапов вербовки лейкоцитов.

Для изучения набора лейкоцитов при оптимальных условиях, важно проверить состояние активации монослоя эндотелиальных клеток. Действительно недостаточно активацию эндотелиальных клеток приводит к глобальному сокращению в Моноцит адгезии и переселение. Активацию эндотелиальных клеток может быть проверена путем анализа уровень экспрессии молекул адгезии на поверхности эндотелиальных клеток, таких как ICAM1 и VCAM1. Уровень этих сцепления молекул должно быть увеличено по сравнению с кератоз эндотелиальных клеток. Если никаких изменений не является обнаруживаемой в этих молекул адгезии эндотелия, культивированный HUVEC может рассматриваться как не активирована. Оценки уровня экспрессии молекул адгезии может стать хорошим количественного контроля между различные эксперименты с использованием той же партии HUVEC. Однако уровень экспрессии этих молекул адгезии также может варьироваться между различными первичной культуре эндотелиальных клеток, ограничение рассмотрения глобального порога ICAM1 или VCAM1. Изменение в форме macrovascular эндотелиальных клеток, таких как HUVEC также является хорошим показателем их активации. Это последний изменение фенотипа позволяет быструю и качественную оценку HUVEC активации. Однако анализ молекул адгезии может быть лучшим выбором для микрососудистой клетки, которые не показывают основные формы изменения после активации с воспалительных цитокинов.

Механистический исследований соответствующих негативный контроль Моноцит переселения могут выполняться с использованием антител против эндотелиальной сцепления молекул, таких как ICAM1, VCAM1 или на поверхности тромбоцитов такие функции лейкоцитов-связанного антигена (LFA) -1. Использование соответствующих негативных управления имеет важное значение для такого механистический исследования в моноцитов, как они выражают Fc рецепторы на поверхности клеток. Также важна чистота моноциты после изоляции, во избежание загрязнения других популяций лейкоцитов и недооценке скорости Моноцит трансмиграции. Еще одним критическим параметром является температура, который необходимо задать при 37 ° C для всех анализов для того, чтобы убедиться, что все экспериментальные наблюдения актуальны и перевести соответственно человека в естественных условиях торговли клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы имеют без финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим д-р Пол Брэдфилд за рукопись чтения и обратными связями. A. S. получил финансовую поддержку от сэра Жюль Торн благотворительных заморских доверять обл.,

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture Flasks 75 cm2 TPP 90076 Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4 IBIDI 80606
Centrifuge Tubes 15 mL TPP 191015
Centrifuge Tubes 50 mL TPP 191050
Collagen G Biochrom L 7213 For coating of cell culture flasks
Gelatin Sigma-Aldrich 1393 For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
3-Way Stopcocks BIO-RAD 7328103
penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL AMIMED 4-02F00-H
Collagenase type 1 Worthington LS004216
Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes GIBCO 22340020
Bovine Albumin Fraction V ThermoFisher 15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg Millipore 02-102
Heparin Sodium Sigma-Aldrich H3149RT
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H6909
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O APPLICHEM A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC Miltenyi Biotech 130-100-713 AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE Miltenyi Biotech 130-110-807 AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC Miltenyi Biotech 130-107-016 AB_2653263
BD Accuri C6 Plus BD Bioscience
µ-Slide I Luer IBIDI 80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) ThermoFisher C2925
Recombinant human TNFα Peprotech 300-01A
Recombinant human VEGFA Peprotech 100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump KF Technology NE-1000
Ficoll Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE Miltenyi Biotech 130-110-519 AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human Miltenyi Biotech 130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE Miltenyi Biotech 130-106-762 AB_2655403
LS columns Miltenyi Biotech 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech 130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate ThermoFisher H1399
Silicone tubing IBIDI 10841
Elbow Luer Connector IBIDI 10802
Female Luer Lock Coupler IBIDI 10823
Luer Lock Connector Female IBIDI 10825
In-line Luer Injection Port IBIDI 10820
Ar1 confocal microscope Nikon
40x objective Nikon 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software NIH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
  2. De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
  3. Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
  4. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  5. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  6. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
  7. Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
  8. Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
  9. Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
  10. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  11. Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
  12. Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
  13. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
  14. ibidi GmbH. Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).
  15. Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
  16. Yang, C. -R., Hsieh, S. -L., Ho, F. -M., Lin, W. -W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), Baltimore, Md. 1647-1656 (2005).
  17. Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
  18. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  19. Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 141 торговлей Моноцит набора воспаление timelapse изображений конфокальная микроскопия адгезии переселения Моноцит субпопуляций chemokines интегринов молекулы адгезии лейкоцитов
Одновременное исследование вербовки Моноцит субпопуляций под поток в пробирке
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes,… More

Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes, T., Wehrle-Haller, B., Sidibé, A. Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58509, doi:10.3791/58509 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter