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Immunology and Infection

Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58509
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 3
1Hematology service, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 2Department of Pathology and Immunology, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen eine integrierte Protokoll, die Monocyte Subpopulation Handel unter in-vitro-Fluss durch Verwendung von spezifischen Oberflächenmarker und konfokale Fluoreszenzmikroskopie misst. Dieses Protokoll kann sequentielle Rekrutierung Schritte sowie zu erkunden, andere Leukozyten-Subtypen mit anderen spezifischen Oberflächenmarker Profil verwendet werden.

Abstract

Die Rekrutierung von Monozyten aus dem Blut zu gezielten peripheren Geweben ist entscheidend für den Entzündungsprozess bei Gewebeverletzungen, Tumorentstehung und Autoimmunerkrankungen. Dies wird durch einen Prozess der Aufnahme von freien Informationsfluss auf der luminalen Oberfläche des aktivierten Endothelzellen, gefolgt von ihrer Haftung und Transendothelial Migration (Seelenwanderung) in das darunter liegende Gewebe der betroffenen erleichtert. Allerdings sind die Mechanismen, die die bevorzugte und Kontext-abhängige Einstellung von Monocyte Subpopulationen unterstützen noch nicht vollständig verstanden. Daher haben wir eine Methode entwickelt, die ermöglicht die Einstellung von verschiedenen Monocyte Subpopulationen gleichzeitig visualisiert und unter Strom gemessen werden. Diese Methode, basierend auf Time-Lapse confocal Imaging ermöglicht die eindeutige Unterscheidung zwischen Anhänger und transmigrated Monozyten. Hier beschreiben wir, wie diese Methode verwendet werden kann, um gleichzeitig die Rekrutierung Kaskade von Pro-angiogenen und nicht-angiogenen Monozyten in-vitro-Studie. Darüber hinaus kann diese Methode erweitert werden, um die verschiedenen Schritte der Rekrutierung von bis zu drei Monocyte Populationen zu studieren.

Introduction

Monozyten bilden eine phagocytic Komponente der angeborenen Immunität, die wichtig für die Bekämpfung von Krankheitserregern, Bereinigen von beschädigtem Gewebe, Angiogenese und der Pathophysiologie von vielen Krankheiten, einschließlich Krebs1,2,3 . Monozyten sind Knochenmark gewonnenen Zellen bestehend aus heterogener Subpopulationen, die im Blut zirkulieren, aber können an den Ort der Entzündung im peripheren Gewebe durch spezifische molekulare Mechanismen rekrutiert werden. Die Rekrutierung Kaskaden von Monozyten, wie bei Leukozyten impliziert in der Regel verschiedene Schritte einschließlich der Erfassung, Rollen, krabbeln, Verhaftung, Transendothelial Migration (Seelenwanderung) und Migration durch die Gefäßwand (Basalmembran und Wandbild Zellen)4. Diese Schritte beinhalten vor allem Entzündungen-induzierte Moleküle auf der endothelialen luminalen Oberfläche z. B. Selectins Glykoprotein Liganden, Chemokine, Knoten und interzelluläre Adhäsionsmoleküle und ihre Rezeptoren auf Leukozyten wie Selektin-Liganden und Integrine. Handel Wege über entweder die Endothelzellen Kreuzungen (parazellulär) oder über die endotheliale Zellkörper (transzelluläre) lässt sich die endotheliale Barriere5überqueren von Leukozyten. Während Monozyten historisch dokumentiert worden sind, um durch die transzelluläre Route transmigrate wurden mögliche Unterschiede in ihren wandernden Weg da Monozyten nicht mehr als eine homogene Zellpopulation gelten vorgeschlagen. Es wird jetzt klar, dass Monocyte Vielfalt kann von jedem ihrer Unterschiede und Gemeinsamkeiten definiert werden, in Bezug auf ihre unverwechselbare Extravasation Kaskaden3,6. Daher, um eindeutig zwischen Monocyte Subpopulationen unterscheiden, ist es entscheidend, zu visualisieren und Phänotyp das Verhalten der einzelnen von diesen verschiedenen Subpopulationen während der Rekrutierung verarbeiten.

Monozyten von Mensch, Schwein, Ratte und Maus waren unterteilt in phänotypischen Subpopulationen mit bestimmten zugeschriebenen Funktionen und spezielle wandernden Verhaltensweisen7,8,9. Beispielsweise können beim Menschen, Monozyten drei Teilmengen basierend auf deren Oberflächenexpression von CD14, ein Coreceptor für bakterielle Lipopolysaccharid und CD16, den Fc-Gamma-Rezeptor III unterteilt werden. Menschliche Monocyte Subpopulationen gehören klassische CD14+CD16-, Mittelstufe CD14+CD16+ und nicht-klassischen CD14dimCD16+ 6,9Zellen. Die klassische CD14+CD16– Monozyten erwiesen sich vor allem entzündliche während der Pool von CD16+ Monozyten fanden sich kollektiv TIE2 Ausdruck und Proangiogenic Funktion10zu präsentieren. Konsequent, Endothelzellen Stimulation mit inflammatorischen Zytokinen wie menschliche Tumor Nekrose Faktor (TNF)-α oder Interleukin (IL-1) Beta (konventionelle Entzündung) ist ausreichend, um die komplette Einstellung von klassischen CD14 auslösen+CD16 – Monozyten. Simultane Aktionen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) A und TNF (angiogenen Faktoren angetrieben Entzündung) sind jedoch erforderlich, um die Seelenwanderung die CD16 provozieren+ Proangiogenic Pool von Monozyten3. Historisch gesehen, das traditionelle Transwell-System unter statischen Bedingungen, die parallelen Platten Strömungsraum und die µ-Folie Fluss Kammern wurden verwendet, um quantitativ zu analysieren, die Rekrutierung von Leukozyten eine Bevölkerung an eine Zeit in-vitro-11 ,12,13. Während diese Protokolle validiert wurden, würde eine robustere Methode, die erlaubt die simultane Analyse von mehreren Monocyte Subpopulationen einsichtsvolleren betrachtet werden. Solche Methoden müssen mehrere Interaktionen und die unterschiedlichen Frequenzen jedes jeweiligen Bevölkerung ausmachen und auch bieten ein mechanistisches Verständnis für die Gemeinsamkeiten und Besonderheiten für die Rekrutierung-Kaskaden, die jede Monocyte definieren Teilmenge.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode basiert auf der Time-Lapse Bildgebung der Monocyte Rekrutierung durch fließen, wodurch die wandernden Kaskaden von verschiedenen Monocyte Subpopulationen gleichzeitig untersucht werden, mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Diese Methode integriert bestimmte kritische Funktionen, die Endothelzellen Entzündung sowie die Hämodynamik des zirkulierenden Monozyten in Post-Kapillaren Venolen, am Hauptstandort der Leukozyten Rekrutierung in vivo zu imitieren. Die vorgeschlagene Methode verwendet menschliche Nabelader Endothelzellen (HUVECS), die durch ein etabliertes Protokoll der Isolation von menschlichen Nabelschnur erzeugt werden. Diese klinische Ressource hat den Vorteil des Seins leicht zugänglich als Nebenprodukt biologischer, während auch eine vernünftige Rendite von Endothelzellen, die von der Nabelader isoliert werden können. Wir auch zur Fluoreszenz-Farbstoffen und Immunfluoreszenz Unterscheidung der verschiedenen zellulären Komponenten und konfokalen Mikroskopie eindeutig definieren Monocyte Positionierung (luminalen vs. abluminalen) im Laufe der Zeit. Die hier vorgestellten Protokoll wurde gleichzeitig messen die Seelenwanderung Ebenen der Monocyte Subpopulationen entwickelt. Darüber hinaus ist darauf hinzuweisen, dass diese Methodik auf um andere Leukozyten-Subpopulationen und Einstellungsverfahren zu studieren erweitert werden kann, durch Einsatz von verschiedenen Biomarker und Kennzeichnung.

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Protocol

Mit der Einwilligung von freiwilligen Spendern und in Übereinstimmung mit den schweizerischen Ethikkommissionen zur klinischen Forschung wurden menschliche Materialien verwendet.

1. Isolierung und Einfrieren der menschlichen Nabelschnur Vene Endothelzellen (HUVECS)

  1. Fügen Sie 5 mL der Beschichtungslösung vor Einleitung eines HUVECS Isolierung T75 Kolben (0,1 mg/mL Kollagen G und 0,2 % Gelatine mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung PBS-Puffer bei pH 7,4) für 30 min bei 37 ° C hinzu.
  2. Reinigen Sie die Schnur mit PBS zu, wischen Sie es mit sterilen Kompressen und legen Sie sie in einen sterilen 20 cm Petrischale. Kürzen Sie die Enden der Schnur mit einer sterilen Schere.
  3. Identifizieren Sie die einzigen großen Vene und zwei kleinen Arterien. Sanft fügen Sie eine Kanüle mit einem Dreiwege Hahn befestigt, um es in die Vene Extremitäten an den Enden der Schnur.
  4. Ziehen Sie das Netzkabel und die Kanüle Verbindung mit einer Länge von Draht fest.
  5. Durchspülen Sie die Schnur zweimal mit 20 mL RPMI Medium mit 100 U/mL Penicillin, 100 U/mL Streptomycin und 250 ng/mL Amphotericin B, das Kabel Adern zu waschen. Dieser Prozess macht das Aussehen des Rückenmarks, weißer und klarer. Leeren Sie die Vene vor Zugabe der Kollagenase durch das Sammeln der RPMI mit einer Spritze an einem Ende.
  6. Durchspülen die Vene mit 12 mL 1 mg/mL Kollagenase Typ ich (0,22 µm gefiltert).
  7. Nahe der Absperrhahn an das Kabel endet und das Kabel bei 37 ° C für 12 min inkubieren.
  8. Massieren Sie die Schnur zum Lösen von Endothelzellen aus dem Lumen der Vene.
  9. Nehmen Sie 30 mL RPMI mit 10 % fetalen Kälberserum mit eine 50 mL Spritze und schließen Sie es an einem Ende der Nabelschnur.
  10. Schließen Sie eine leere 50 mL Spritze an das andere Ende der Nabelschnur
  11. Öffnen Sie den Absperrhahn und durchspülen der Vene von einem Ende, während umgekehrt vom anderen Ende sammeln.
    Hinweis: Die gesammelten Suspension enthält Endothelzellen.
  12. Zentrifugieren Sie diese Zellsuspension bei 200 X g für 5 min.
  13. Den Überstand verwerfen und erneut die Zelle Pellet mit 10 mL des kompletten M199 Medium (M199 mit 20 % FCS, 15 µg/mL Endothelzellen Wachstum ergänzt, 100 µg/mL Heparin-Natrium, Hydrocortison-0,5 µM, 10 µg/mL L-Ascorbinsäure, 100 U/mL Penicillin, 100 U/mL Streptomycin und 250 ng/mL Amphotericin B).
  14. Entfernen Sie die Beschichtungslösung aus der T75-Flasche und einmal Spülen mit PBS.
  15. Samen der Zellen in den T75 Kolben aus Schritt 1.13 gesammelt und legen Sie sie in den Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2.
  16. Am nächsten Tag spülen Sie den Kolben 3 Mal mit dem kompletten M199 Medium verbleibenden Erythrozyten entfernen und ändern Sie dann das Medium alle 2 Tage bis zum Zusammenfluss.
  17. Spülen Sie bei 80 – 90 % Zusammenströmen die HUVECS monomolekularen Film einmal mit 5 mL PBS und lösen Sie die Zellen mit 5 mL 0,05 % Trypsin in 1 mM EDTA bei 37 ° C für 5 min. hinzufügen 4 mL M199 und 1 mL des FCS, Trypsin-Aktion zu stoppen. Spülen Sie die Flasche um alle HUVECS zu entfernen.
  18. Sammeln Sie eine Aliquote von 50 µL für Färbung des VE-Cadherin, PECAM-1 und gp38 verwendet werden, und analysieren von Durchflusszytometrie, HUVECS Reinheit zu überprüfen.
  19. Sammeln Sie den Rest des HUVECS von 1.18 Schritt in einem 15 mL-Tube und Zentrifuge bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
  20. Verwerfen des Überstands von Schritt 1.19, Aufschwemmen der Zelle Pellet in Lösung (FCS, enthält 10 % DMSO) bei einer Dichte von 5 x 105 Zellen/mL in Cryoröhrchen Einfrieren und bei-80 ° C oder in flüssigem Stickstoff bis zum Gebrauch einfrieren.
  21. HUVECS Reinheit zu überprüfen:
    1. Die aliquoten von 50 µL der HUVECS gesammelt bei Schritt 1.18 fügen Sie 1 µL Anti-Human VE-Cadherin-FITC Antikörper, 1 µL Anti-Human PECAM1-PE Antikörper und 1 µL Anti-Human Podoplanin-APC Antikörper hinzu.
    2. Bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
    3. Hinzufügen von 100 µL PBS und Zentrifuge bei 400 X g für 30 s.
    4. Den Überstand verwerfen und in 100 µL PBS aufzuwirbeln. Daten können nun von Flow Cytometry Techniken erworben werden.
      Hinweis: HUVECS sind für VE-Cadherin und PECAM-1 positiv und negativ für Podoplanin.

2. HUVECS Abtauen

Hinweis: HUVECS Einsatz bei niedrigen Durchgang für Experimente (maximal 5 Passagen).

  1. T75 Kolben mit 1 mL der Beschichtung-Lösung bei 37 ° C für 30 min zu beschichten.
  2. Schnell aufzutauen HUVECS bei 37 ° C für 2 min und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL von kompletten M199.
  3. Die Zellen bei 200 X g bei Raumtemperatur für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  4. Die Zelle Pellet in 10 mL komplette M199 aufzuwirbeln.
  5. Übertragen Sie die Zellsuspension in beschichtetem Kolben. Legen Sie die Flasche im Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2. Ändern Sie das Zellkulturmedium alle 2 Tage.

(3) HUVECS Kultur in 0,4 µ-Slide-Kammer

  1. Fünf Tage vor dem Start der Flow-Experiment, Pre-Mantel der Kammern einer 0,4 µ-Folie mit 30 µL PBS mit 0,1 mg/mL Kollagen G, 0,2 % Gelatine bei 37 ° C für 30 min.
  2. Waschen Sie die Kammern mit 100 µL PBS.
  3. Lösen Sie die Zellen von einer 80-90 % konfluierende HUVECS einer T75 Flasche.
  4. HUVECS mit 5 mL PBS spülen und mit 5 mL 0,05 % Trypsin bei 37 ° C für 5 min zu lösen.
  5. Spülen Sie und sammeln Sie die Zellsuspension in kompletten M199 zählen Sie die Zellen durch die bequemste Methode. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
  6. Aufschwemmen der Zelle Pellet 106 Zellen/ml und 30 µL (30.000 Zellen) pro Kammer zu verteilen.
  7. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 1 h.
  8. Jede Kammer 150 µL des kompletten M199 hinzu und Kulturzellen für 5 Tage im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2. Verändern Sie alle 2 Tage das Medium.

4. HUVECS Färbung für Monocyte-Recruitment-Assay unter Strom

  1. Bereiten Sie die Kennzeichnung Medium M199 und 1 µM CMFDA (5-Chloromethylfluorescein Diacetat) gemacht und warm es bei 37 ° C für 5 min vor der Zelle Kennzeichnung.
  2. Waschen HUVECS zweimal mit M199-Medium bei 37 ° c erwärmt
  3. Ersetzen Sie das Medium mit 30 µL erwärmten Kennzeichnung 1 µM CMFDA-haltigem Medium, und legen Sie in den Brutschrank bei 37 ° C und 5 % CO2 10 min. lang.
  4. Einmal mit kompletten M199 waschen und die Zellen mit kompletten M199 im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für 30 min inkubieren.
    Hinweis: Es ist wichtig, alle Spuren des Serums vor Zugabe der Kennzeichnung Lösung entfernen, sonst kann es ändern, HUVECS Färbung.
  5. Ersetzen Sie die beiden menschlichen TNF-haltigem Medium mit kompletten M199 (500 U/mL) oder eine Mischung aus menschlichen TNF (500 U/mL) mit menschlichen VEGFA (1 µg/mL) für 6 h in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.

(5) Isolation von menschlichen Pan Monozyten und Färbung von Subpopulationen

  1. Verwenden Sie entweder einen buffy Mantel des konzentrierten menschliches Blut oder 20 mL frisch isolierte Menschenblut, am Tag des Experiments in EDTA-Vacutainer-Röhrchen gesammelt.
  2. Verdünnen Sie das Blut im PBS-1 mM EDTA (1:1) und pipette vorsichtig 20 mL der verdünnten Blut auf 20 mL der Dichte-Gradienten-Medien. Zentrifugieren Sie bei 400 X g für 30 min bei Raumtemperatur mit langsamen Beschleunigung und ohne Bremse.
  3. Sammeln der peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC)-Thrombozyten-Schicht (zwischen Dichte Gradienten Medien und Plasma Schichten) in eine neue 50 mL-Tube mit 40 mL PBS - 1 mm EDTA. Top-bis zu 50 mL mit PBS - 1 mM EDTA.
  4. Zentrifuge bei 200 X g bei Raumtemperatur für 5 min. verwerfen den überstand.
  5. Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 10 mL der Färbung Puffer (PBS - 1 mM EDTA mit 0,5 % Rinderserumalbumin BSA).
  6. Zentrifuge bei 200 X g bei Raumtemperatur für 5 min. verwerfen den überstand.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 5.5 und 5.6.
  8. Aufzuwirbeln Sie die Zelle-Pellet mit 10 mL der Färbung Puffer. Nehmen Sie eine Aliquote von 10 µL für eine Zellzahl.
  9. Überprüfen Sie PBMC Populationen zu und zählen Sie Zellen rasch mit einem Durchflusszytometer.
    Hinweis: Der charakteristische Lymphozyten und Monocyte Bevölkerung können (Abbildung 1A) beobachtet werden. Ab 50 mL frisches Menschenblut rechnen mit etwa 50-100 x 106 PBMC.
  10. Für die Einstellung von CD14 + versus CD14-PBMC unter Strom:
    1. Waschen Sie die Pellets dreimal mit Flow-Puffer (M199 mit 0,5 % BSA) und Aufschwemmen der mononukleären Zellen im Fluss Puffer auf 6 x 106 Zellen pro mL.
    2. Aliquote von 200 µL für jede Probe zu machen. Inkubation bei 37 ° C bis 20 min vor dem Test.
    3. Jedes aliquoten 5 µL Anti-CD14-PE und Hoechst 33342 auf eine Endkonzentration von 2 µM hinzufügen. Mischen und bei 37 ° C für 10 min inkubieren.
    4. Zentrifugieren der aliquoten 400 X g für 30 s.
    5. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Pellet mit 200 µL Puffer fließen.
  11. Für die Einstellung von Monocyte Subpopulationen unter Strom:
    1. Monozyten mit einer Pfanne Monocyte Isolierungskit laut Herstellerangaben zu isolieren.
      Hinweis: Das folgende Protokoll der Isolierung ist für 50 x 106 Zellen. Es kann nach oben oder unten skaliert werden, solange es in den Empfehlungen des Herstellers ist.
    2. Zentrifugieren Sie die PBMC-Aufhängung bei 200 X g bei Raumtemperatur für 5 min.
    3. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Pellet mit 400 µL Puffer Färbung.
    4. Fügen Sie 50 µL der Fc-Rezeptor blockierende Reagenzien und 50 µL Pan Monocyte Antikörper cocktail.
    5. Bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
    6. Fügen Sie 400 µL Puffer und 100 µL der magnetischen Beads konjugierten Anti-Biotin Antikörper Färbung hinzu. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
    7. Fügen Sie 2 mL Färbung Puffer und verwenden Sie eine MACS LS-Spalte, gekoppelt mit einem Magneten.
    8. Setzen Sie die LS-Säule auf den Magneten und 1 mL Puffer Färbung. Entsorgen Sie den Durchfluss.
    9. Übergeben Sie die PBMC-Suspension in der Spalte und sammeln Sie den klaren Fluss zu, obwohl Pfanne Monozyten in der neuen 15 mL Tube mit.
    10. Fügen Sie den befleckenden Puffer, um bis zu 5 mL top.
    11. Nehmen Sie eine aliquote und überprüfen Sie die Qualität der Monocyte-Isolierung mit einem Durchflusszytometer.
    12. Bestimmen Sie die Anzahl der Pfanne Monocyte.
      Hinweis: Nur Monocyte Bevölkerung kann (Abbildung 1 b)beobachtet werden.
    13. Zentrifugieren Sie den Rest der Monozyten aus Schritt 5.11.11 200 X g für 5 min.
    14. Verwerfen Sie den überstand.
    15. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL Fluss Puffer (M199 mit 0,5 % BSA).
    16. Wiederholen Sie die 5.11.13, 5.11.14 zweimal, um jede Spur von EDTA zu beseitigen.
  12. Monocyte Aufhängung im Fluss zu machen (M199 mit 0,5 % BSA) 6 x 106 Zellen/ml Puffer.
  13. Aliquote von 200 µL der Monozyten für jede Einstellung Assay zu machen.
  14. Halten Sie den Aliquoten bei 37 ° C im Inkubator bis 20 min vor der Injektion.
  15. Jedes aliquoten 5 µL Anti-CD16-PE Antikörper und Hoechst 33342 (letzte 2 µM) hinzufügen.
  16. Mischen und bei 37 ° C für 10 min inkubieren.
  17. Zentrifugieren der aliquoten 400 X g für 30 s.
  18. Verwerfen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie Pellet mit 250 µL Puffer fließen.
  19. Fügen Sie 30 µL der Monocyte Suspension in einer Kammer des Schlittens dienen zur Einstellung der Aufnahmeparameter auf confocal Mikroskop.
  20. Halten Sie die Aliquote Monocyte Suspension davon ab, Schritt 5.18 bei 37 ° C.
    Hinweis: Diese Suspension ist bereit, in den Flow-System injiziert werden.

6. Vorbereitung des fluidischen Systems

  1. Sicherstellen Sie, dass die Zelle Inkubator für die Bildgebung bei 37 ° c eingestellt
    Hinweis: Eine Abbildung des Flow-System ist in Abbildung 2dargestellt.
  2. Montieren Sie den Schlauch-Teil I: einfügen ein Luer-Anschluss männlich an einem Ende ein Stück Silikon Schlauch (8 cm lang und 3 mm dick) und schließen Sie das andere Ende an einem Inline-Luer Injektion Satz. Schließen Sie den letzteren Luer-Anschluss an ein Stück Silikon Schläuche (40 cm und 3 mm dick) an einem Ende.
    Hinweis: Optional kann ein 3-Wege-Hahn verbunden mit einer 5 mL-Spritze zwischen die Inline-Luer Injektion und das Silikon Schläuche für eventuelle Luftentfernung Blase eingefügt werden.
  3. Montieren Sie den Schlauch-Teil II: eine 20 mL Spritze an einem Ende mit einer Länge von Silikon Schlauch (1 m lang und 3 mm dick) zu verbinden. Legen Sie ein Luer-Anschluss männlich an das andere Ende des Schlauches.
  4. Verbinden Sie Teil I und Teil II Schläuche durch das Einfügen der Luer Anschluss Männchen zu einer weiblichen Luer Lock Koppler (Abbildung 2A).
  5. Setzen Sie das freie Ende der Silikonschlauch in die Becken mit den Fluss-Puffer (M199 + 0,5 % BSA) bei 37 ° c erwärmt
  6. Ziehen Sie den Kolben der Spritze 20 mL, die Schläuche mit Flow-Puffer zu füllen.
  7. Legen Sie die Spritze an der Pumpe und sichern.
  8. Legen Sie die Pumpe in zurückziehen Modus (im Gegensatz um zu ziehen) und geben Sie die Durchflussmenge.
  9. Bestimmen Sie die Durchflussmenge gemäß der IBIDI-Folie verwendet, mithilfe der folgenden Formel:
    Equation
    Hinweis: Die Folie-Faktor ist abhängig von der IBIDI-Folie für das Experiment verwendet. Für die µ-Folie ich0,4 Luer Lock verwendet in diesem Beispiel der Folie Faktor ist 131,6. Bestimmten Folie Faktoren finden Sie in der Unternehmens-Webseite-14. Die Fließviskosität Puffer ist 0.0072 dyn.s/cm2. Schubspannung bei der Post-Kapillaren Venolen ist etwa 0,5 dyn/cm2.
  10. Verbinden Sie die Folie (Abb. 2 b):
    1. Klemmen Sie den Silikonschlauch rund um den weiblichen Luer Lock Koppler und trennen Sie die beiden Luer-Anschluss Männchen von der Kupplung.
    2. Verbinden sie mit den Stauseen des Schlittens, stimuliert HUVECS und füllen mit Medium enthält. Vermeiden Sie Luftblasen während dieses Schritts.
    3. Nehmen Sie die Klemmen und sicherzustellen Sie, dass die Verbindung nicht undicht ist.
  11. Legen Sie die Folie unter dem Mikroskop für Zeitraffer-Aufnahmen und einschalten Sie die Pumpe.

(7) Zeitraffer Bildgebung der Monocyte Rekrutierung unter Strömung durch konfokale Mikroskopie

  1. Verwenden Sie ein Objektiv 40 X (siehe Tabelle der Materialien) für die Bildgebung.
  2. Aktivieren der 405 nm (blue Monocyte Kerne), 488 nm (grüne Endothelzellen) und 561 nm (rot CD16 + Teilmenge) Laser.
  3. Verwenden Sie die Kammer, die die Monozyten zur Einstellung der Übernahme-Parameter enthält.
    Hinweis: Um nicht transmigrated und transmigrated Monozyten zu erkennen, sind die Lochkamera und Intensität des Laser 405 nm hoch eingestellt. So sind nicht transmigrated Monozyten in der basalen Plan leicht sichtbar. Jedoch nur transmigrated Monozyten eine ungefärbten Raum um den Atomkern entspricht der neuen Fläche unter endothelial Zellen darstellen.
  4. Legen Sie die Kammer unter dem Mikroskop erworben werden.
  5. Wählen Sie 3 Felder Ansichten im Umkreis von 1 cm für Multi-Positions confocal Imaging.
  6. Die basale und die apikalen Seiten der Endothelzellen zu definieren
  7. Legen Sie einen Z-Stapel auf 10 – 12 µm Bereich (0,5 µm Schritt). Führen Sie einem Zeitraffer Erwerb alle 1 min.
  8. Injizieren Sie nach 3 min der Bildgebung 200 µL Monocyte Suspension (6 x 106 Zellen/mL) durch die Inline-Luer Spritzenport.
    Hinweis: Schnell werden Monozyten in der apikalen Brennebene halten und Seelenwanderung (Transit von der apikalen auf den basalen Plan) zu starten.
  9. Bild für mindestens 30 Minuten. Sobald beendet, Bildgebung und beenden Sie den Fluss. Klemmen Sie den Schlauch um sie von der Folie zu trennen.
  10. Befestigen Sie die Folie mit 4 % Paraformaldehyd bei 4 ° C für 10 Minuten.
  11. Die Folie mit PBS waschen und Lagern der Folie bei 4 ° C zur weiteren Analyse bei Bedarf.

8. die Datenanalyse mit ImageJ

  1. Die Anzahl der insgesamt anhaftende Monozyten in den einzelnen Bereichen. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro mm2.
  2. Zählen Sie transmigrated Monozyten, die in den basalen Plan unter Endothelzellen vorhanden und durch die Anwesenheit eines schwarzen Lochs (in den grünen Kanal) um den Kern identifiziert sind.
  3. Teilen Sie die Anzahl der transmigrated Leukozyten durch die Gesamtzahl der anhaftende Leukozyten. Die Seelenwanderung Rate wird als Prozentsatz des anhaftenden Monozyten vorgestellt.
  4. Zur Veranschaulichung können die apikale und basalen Seiten gleichzeitig angezeigt werden um die Ereignisse, die in jeder der diese endotheliale Fächer zu veranschaulichen.

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Representative Results

Ermitteln des Status der HUVECS Aktivierung durch TNF induziert

Die Bio-Aktivität von inflammatorischen Zytokinen TNF können je nach Charge und die Kalorienzahl Einfrieren Auftauen Zyklus. Es ist wichtig, um den Aktivierungsstatus der HUVECS mit TNF-Behandlung zu überprüfen. Dies könnte durch Färbung einige Proben von konfluierende HUVECS für die entzündliche Induktion Selectins, ICAM-1 und VCAM-115,16,17parallel durchgeführt werden. Eine leichter und einfachere Weg, um den Aktivierungsstatus der HUVECS nach TNF-Behandlung zu überprüfen ist die morphologische Veränderung von Endothelzellen unter entzündlichen Stress angezeigt. Wie in Abbildung 3dargestellt, HUVECS nach 6 h in Anwesenheit von TNF im Vergleich zu unstimulierte Zellen verlängern. Ähnliche Dehnung wird beobachtet, wenn Mediumwechsel durch eine Mischung aus TNF und VEGFA angeregt werden. Aufnahme des Aktivierungsstatus des HUVECS ist wichtig, da die endgültigen Ergebnisse der Transmigration von Monozyten die Qualität der endothelialen Zell-Aktivierung hängt.

Monocyte Seelenwanderung macht eine charakteristische absetzen in Endothelzellen

Um Monocyte Seelenwanderung unter Strömung zu studieren, verwendeten wir konfokalen Mikroskopie mit Endothelzellen gebeizt in grün mit CMFDA und den Kernen der isolierten Monozyten gebeizt in blau mit der Zelle durchlässig Hoechst 33342 Farbstoff (Abbildung 4). Die Time-Lapse confocal Imaging erlaubt die Visualisierung von Monozyten an der apikalen Ebene, wo ihr Phänotyp werden konnte (Abb. 4A-C, ergänzende Film 1) bewertet. Migration von Zellen in der Seelenwanderung zog in den Interzellularraum, Zell-Zell-Verbindungen entsprechen, bevor sie aus dem apikalen Flugzeug verschwand und in der basalen Ebene erschien. Die transmigrated Zellen präsentiert ein schwarzes Loch um den Atomkern entspricht der Monocyte-Formen. Diese Form ständig verändert während der Monocyte Migration unter Endothelzellen (Abbildung 4A-C, ergänzende Filme 2-3). Dieses dynamische schwarze Loch vom Monocyte Körper unterhalb der Endothelzellen und der Monocyte Positionierung erlaubt zur eindeutigen Identifizierung von transmigrated Zellen. Quantifizierung der Monocyte Einstellung im Laufe der Zeit zeigte Monocyte Adhäsion gefolgt von Seelenwanderung (Abbildung 4-E). Obwohl Leukozyten durch die transzelluläre und parazellulär Routen Leber können, konnten wir mit dieser Methode nur parazellulär Seelenwanderung unter Fluss beobachten. Dies steht im Einklang mit unseren bisherigen Beobachtungen3,11,18,19.

Angiogenen Faktor getrieben Entzündung fördert die Seelenwanderung CD16 + Monozyten

Mithilfe dieser Methode haben wir die Seelenwanderung menschlichen Proangiogenic im Vergleich zu nicht-angiogenen Monozyten durch eine endotheliale Monolage angeregt durch die entzündliche Cytokine TNF allein oder in Kombination mit der angiogenen Faktor VEGFA analysiert. Menschliche Proangiogenic Monozyten können durch die Expression von CD16 oder TIE2 auf ihrer Oberfläche identifiziert werden. Hier wurde Anti-CD16-PE Antikörper verwendet, um zwischen Pro - und nicht-angiogenen Monozyten zu unterscheiden. Wie in Abbildung 5A-B (zusätzliche Filme 4-5), die Seelenwanderung bei CD16+ Monozyten war gering, wenn endotheliale Zellen nur mit TNF angeregt wurden. Allerdings erhöht diese Rate wenn endotheliale Zellen gleichzeitig mit TNF und VEGFA (Abbildung 5-E, ergänzende Filme 6-7) angeregt wurden. Die Seelenwanderung-angiogenen Monozyten lag unter beiden entzündlichen Erkrankungen ähnlich hoch. Für beide Zelle Subpopulationen trat die Seelenwanderung ausschließlich durch die parazellulär Route. Diese Methode ermöglicht somit die Seelenwanderung Eignung der verschiedenen monozytären Populationen gleichzeitig untersucht werden.

Die Reinheit der Monozyten betrifft die Seelenwanderung Effizienz

Die peripheren mononukleären Blutzellen bestehen aus T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten. Die hier angewandte Methode der Monocyte-Isolierung erfordert die Erschöpfung der Leukozyten Bevölkerungen von PBMC. Um zu verstehen, wie der Mangel an Monocyte Reinheit der Ergebnisse auswirkt, wir benutzten PBMCs und gebeizt für Pan-Monozyten mit einem Anti-CD14-PE-Antikörper vor der Durchführung der Rekrutierung-Assay unter Strom. Wie in Abbildung 6dargestellt, induzierte HUVECS Stimulation mit TNF oder TNF + VEGFA die Seelenwanderung nur Monocyte Bevölkerung. Die anderen Leukozyten bestehend aus T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen nicht unter TNF oder TNF + VEGFA transmigrate. In der Tat wurde dokumentiert, dass diese Leukozyten andere Signale für die Seelenwanderung brauchen. So wird eine ineffiziente Isolation von Monozyten zu einer Unterschätzung des Monocyte Seelenwanderung führen, wie die anderen Leukozyten als Monozyten gezählt werden würde. Dies führt zu einem fehlerhaften Ergebnis auf Monocyte Seelenwanderung, wegen der Verschmutzung der Monocyte Bevölkerung mit anderen Leukozyten.

Figure 1
Abbildung 1: Profilierung der isolierten Monozyten durch Durchflusszytometrie. (A) Analyse der Morphologie der PBMC vor Erschöpfung der Lymphozyten. Die Größe (forward Scatter: FSC) und Granularität (Side Scatter: SSC) des peripheren Blutes Mononukleäre Zellen wurden durch Durchflusszytometrie bestimmt. (B) die Größe und die Granularität der isolierten Monozyten durch Durchflusszytometrie nach Erschöpfung der Lymphozyten bestimmt waren. Eine effiziente Trennung von Monozyten zeigt eine vollständige Entleerung der Lymphozytenpopulation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung der fluidische System. (A) schematische Übersicht über die Perfusion System vor und nach der Verbindung der Folie und der Montage auf die Spritzenpumpe. (B) schematische Darstellung der Prozess der Verbindung der Folie mit dem Schlauch mit Schellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Überprüfung der effiziente Aktivierungs von Endothelzellen. Die Aktivierung des HUVECS durch entzündliche Reize wurde durch die Analyse der Zellform mit Phasenkontrastmikroskopie überprüft. Nach 6 Stunden nach der Behandlung, HUVECS präsentieren eine längliche Morphologie bei Stimulation mit TNF (500 U/mL) oder eine Mischung aus TNF (500 U/mL) + VEGFA (1 µg/mL) im Vergleich zu unstimulierte Zellen. Diese morphologische Veränderung des HUVECS nach der entzündlichen Stimulation ist ein leicht zu erkennende Indikator für die Zell-Aktivierung, die für die Fluss-Assay gewährleistet werden sollte. Maßstabsleiste 120 µm = Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Identifizierung von transmigrated Monozyten durch konfokale Mikroskopie. (A) schematische Darstellung Monocyte Seelenwanderung mit den erwarteten Ansichten apikale und basale Flugzeuge. Die Kerne der Monozyten mit Hoechst 33342 befleckt sind in blau dargestellt, und die theoretische Formen der Monozyten werden mit gestrichelten Linien um die Kerne dargestellt. In der basalen Ansicht erscheinen die transmigrated flachen Monozyten ein Unterraum Endothelzellen zu besetzen. Dieser Raum wird als ein schwarzes Loch der Monocyte Kern auf konfokalen Bilder umgeben. (B) Lokalisierung von einem Monocyte vor und nach der Seelenwanderung. Die Draufsichten werden angezeigt, und das Aussehen eines schwarzen Lochs (abgegrenzt durch die weiße gestrichelte Linie) nach der Monocyte Migration in das Endothel abluminalen Fach beobachtet werden. Ein roter Pfeil zeigt die Position des Monocyte vor Seelenwanderung und die weiße Pfeilspitze zeigt dieselbe Zelle nach der Seelenwanderung. Die Draufsichten zeigen, dass die transmigrated Monocyte unter den Endothelzellen. Maßstabsleiste = 40 µm. (C) Zeitraffer Bildsequenzen (von 0 bis 20 min) Monocyte Rekrutierung Überstunden. Die apikale und basale Ansicht werden angezeigt. Die vollständigen Sequenzen entnehmen bitte zusätzliche Filme 1, 2 und 3. Rote Quadrate markieren eine transmigrated Monocyte mit einem blauen Kern. Das schwarze Loch entspricht den flachen Körper der Monocyte unterhalb der Endothelzellen wird durch eine gestrichelte gelbe Linie abgegrenzt. Maßstabsleiste = 40 µm. (D) unstimulierte Quantifizierung der Monocyte Haftung auf TNF-stimulierten im Vergleich zu HUVECS im Laufe der Zeit. (E) Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung Rate im Laufe der Zeit. N = 3 biologische repliziert. Daten sind als Mittelwert ± S.D. präsentiert Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: gleichzeitige Untersuchung von der Seelenwanderung Monocyte Subpopulationen unter Strom. (A) Zeitraffer Bildsequenzen (von 0 bis 20 min) bei der Einstellung von Proangiogenic Monozyten (CD16+) und nicht-angiogenen Monozyten im Laufe der Zeit durch TNF-aktivierten HUVECS. Maßstabsleiste = 40 µm; die apikale und basale Ansicht werden angezeigt. Die vollständige Sequenzen können man in zusätzliche Movie 4 für apikalen und ergänzende Film 5 für basale Ansichten. (B) Quantifizierung der Transmigration von menschlichen Proangiogenic Monozyten (HPMo: CD16 +) und menschliche-angiogenen Monozyten (HNMo) durch eine Monolage TNF-aktivierten HUVECS. N = 4 biologische repliziert Daten sind als Mittelwert ± S.D. vorgestellt * p < 0,05; Mann-Whitney-Test. (C) Zeitraffer Bild-Sequenzen (von 0 bis 20 min) bei der Einstellung von Proangiogenic und -angiogenen Monozyten Überstunden durch TNF + VEGFA aktiviert HUVECS. Maßstabsleiste = 40 µm; die apikale und basale Ansicht werden angezeigt. Die vollständigen Sequenzen können gesehen werden, ergänzende Film 6 apikalen und ergänzende Film 7 für basale Ansichten. (D) Quantifizierung der Transmigration von menschlichen Proangiogenic Monozyten (HPMo: CD16 +) und menschliche-angiogenen Monozyten (HNMo: CD16-) durch TNF + VEGFA aktiviert HUVECS monomolekularen Film. N = 4 biologische repliziert Daten sind als Mittelwert ± S.D. vorgestellt * p < 0,05; Mann-Whitney-Test. (E) Lokalisierung des CD16+ Monozyten vor (10 min) und nach (15 min) Seelenwanderung durch TNF + VEGFA angeregt HUVECS. Die Draufsichten werden angezeigt. Maßstabsleiste = 40 µm Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Gleichzeitige Untersuchung von der Seelenwanderung CD14 + versus CD14 - PBMC unter Strom. (A) Haftung von CD14+versus CD14– PBMC, TNF-aktivierte HUVECS unter Strom. (B) Haftung von CD14+versus CD14– PBMC, TNF + VEGFA aktiviert HUVECS unter Strom. (C) Seelenwanderung rate (%) der CD14+versus CD14– PBMC durch TNF-aktivierte HUVECS unter Strom. (D) Seelenwanderung rate (%) der CD14+versus CD14– PBMC durch TNF + VEGFA aktiviert HUVECS unter Strom. Daten sind Mittelwert ± S.D. N = 4 biologische repliziert. * p < 0,05; Mann-Whitney-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Film 1: Blick auf die apikale Ebene des Pan-Monocyte Rekrutierung unter Strom. Erweiterte Ansicht der Rekrutierung von Pan Monocyte unter Durchfluss an der apikalen Ebene. HUVECS waren voller Flecken mit CMFDA und die Kernen der Monozyten waren mit Hoechst 33342 Leben-befleckt. Maßstabsleiste = 50 µm Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Movie 2: Blick auf die basalen Ebene des Pan-Monocyte Rekrutierung unter Strom. Erweiterte Ansicht der Rekrutierung von Pan Monocyte unter Strömung auf der basalen Ebene. HUVECS waren voller Flecken mit CMFDA und die Kernen der Monozyten waren mit Hoechst 33342 Leben-befleckt. Maßstabsleiste = 50 µm Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Movie 3: maximale Projektion des Z-Stapel von Pan-Monocyte Rekrutierung unter Strom. Erweiterte Ansicht der Rekrutierung von Pan Monocyte unter fließen wie in zusätzliche Filme 1 und 2dargestellt. HUVECS waren voller Flecken mit CMFDA und die Kernen der Monozyten waren mit Hoechst 33342 Leben-befleckt. Maßstabsleiste = 50 µm Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Movie 4: Blick auf die apikale Flugzeug der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen, TNFα-aktiviert HUVECS. Blick auf die apikale Flugzeug die gleichzeitige Einstellung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung auf TNF-aktivierte HUVECS unter Strömung erweitert. HUVECS waren voller Flecken mit CMFDA und die Kernen der Monozyten waren mit Hoechst 33342 Leben-befleckt. Menschliche Proangiogenic Monocyte Subpopulationen wurden durch die Oberflächenexpression von CD16 identifiziert. Maßstabsleiste = 30 µm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Film 5: Blick auf der basalen Ebene der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen, TNFα-aktiviert HUVECS. Erweiterte Ansicht, auf der basalen Ebene, der die gleichzeitige Einstellung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung, TNF-aktivierte HUVECS unter Strom. HUVECS waren voller Flecken mit CMFDA und die Kernen der Monozyten waren mit Hoechst 33342 Leben-befleckt. Die menschliche Proangiogenic Monocyte (HPMo) Subpopulation wurde von der Oberflächenexpression von CD16 identifiziert. Maßstabsleiste = 30 µm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Film 6: Blick auf die apikale Flugzeug der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen, TNFα+ VEGFA aktiviert HUVECS. Erweiterte Ansicht, bei der apikalen Ebene, der die gleichzeitige Einstellung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung, TNF + VEGFA aktiviert HUVECS unter Strom. HUVECS waren voller Flecken mit CMFDA und die Kernen der Monozyten waren mit Hoechst 33342 Leben-befleckt. Die menschliche Proangiogenic Monocyte Subpopulation wurde von der Oberflächenexpression von CD16 identifiziert. Maßstabsleiste = 30 µm Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Film 7: Blick auf der basalen Ebene der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen, TNFα+ VEGFA aktiviert HUVECS. Erweiterte Ansicht, auf der basalen Ebene, der die gleichzeitige Einstellung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung, TNF + VEGFA aktiviert HUVECS unter Strom. HUVECS waren voller Flecken mit CMFDA und die Kernen der Monozyten waren mit Hoechst 33342 Leben-befleckt. Die menschliche Proangiogenic Monocyte (HPMo) Subpopulation wurde von der Oberflächenexpression von CD16 identifiziert. Maßstabsleiste = 30 µm Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

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Discussion

Hier berichten wir über eine Methode, die eine Studie über wie Monocyte Subpopulationen durch die entzündeten endotheliale Monolage transmigrate Detaillierung. Die besprochene Methode verwendet konfokalen Mikroskopie statt Phasenkontrast-Mikroskopie, die genutzt wird um Monocyte Rekrutierung unter Strömung3,11,19zu untersuchen. Ein großer Vorteil der konfokalen Mikroskopie für Zeitraffer-Aufnahmen mit ist die Fähigkeit zur Seelenwanderung und starke Adhäsion von Monozyten eindeutig unterscheiden. Obwohl die Phasenkontrast-Mikroskopie-basierte Methode auch robust ist, bedarf es Know-how um zu vermeiden, mischen Sie transmigrated und stark anhaftende Zellen. In diesem Fall muss eine strenge Kriterien für die Analyse zu etablieren, um einen deutlichen Unterschied zwischen diesen beiden Zuständen der Monocyte Rekrutierung Kaskade zu machen. Darüber hinaus ist es auch wichtig, eine Endpunktanalyse konfokalen Mikroskopie durchzuführen, um die globalen Trends beobachtet die Phasenkontrast-Mikroskopie zu bestätigen. So bietet die direkte Nutzung der konfokalen Mikroskopie Monocyte Rekrutierung unter Strömung untersuchen klare Ergebnisse über den tatsächlichen Seelenwanderung Stand der erfassten Monozyten.

Eines der Engpässe bei der Rekrutierung von Leukozyten Ausführung Tests unter Strom und mit dem Phasenkontrast-Mikroskop ist der Zeitaufwand um die Analyse durchzuführen und einzelne Zellen von der Aufnahme an Seelenwanderung durch Zell-Zell-Kreuzung verfolgen. Automatisierung einer solchen Analyse ist möglich aber schwierig wegen Phasenkontrast-Ähnlichkeiten zwischen Krabbeln und transmigrated Monozyten durchzuführen. Hier zeigen wir mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie, dass Monocyte Seelenwanderung war begleitet von einem Abbruch der Endothelzellen, die Färbung in der basalen Ebene entspricht die Form des transmigrated Monozyten unter HUVECS. Diese Positionierung bestätigte die orthogonale Projektion. Der Übergang der Monocyte Lokalisierung ist ausschließlich zwischen Zell-Zell Verbindungen bezeichnend für eine Seelenwanderung parazellulär aufgetreten. Dies steht im Einklang mit unseren vorherigen Daten, die zeigten, dass unter Strömung in-vitro-Monozyten ausschließlich über parazellulär Route mit HUVECS3,18transmigrate. Ergänzend die vorgeschlagene Methode ist es hier möglich, nicht blockierende Antikörper gegen Knoten Proteine wie VE-Cadherin, Marmeladen oder PECAM1 zu verwenden, um die möglichen Standorte der Monocyte Seelenwanderung (parazellulär vs. transzelluläre) Bild. Wir haben bestätigt, dass die schwarzen Formen rund um die Monocyte-Kerne sind eine robuste Eigenschaft der transmigrated Zellen und ein einfaches Ereignis, das von der Software erkannt werden kann. Obwohl hier eine manuelle Zelle Zählsystem nachgewiesen wird, ist die schwarze Form Bildung um den Leukozyten Kern ein Kriterium, das verwendet werden könnte, um Leukozyten Seelenwanderung in automatisierte Analyse, spart eine Menge Zeit zu definieren. Wir arbeiten derzeit an der Entwicklung einer automatisierten Anwendung für eine solche Analyse.

In der Studie von Leukozyten Rekrutierung wurden zuvor Fluoreszenz und konfokalen Mikroskopie verwendet. Allerdings dienten sie nicht, die Einstellung von verschiedenen Subpopulationen gleichzeitig zu untersuchen. Hier schlagen wir eine Modalität der konfokalen Mikroskopie verwenden, um die Rekrutierung von Leukozyten Subtypen gleichzeitig in der gleichen Mikroumgebung zu studieren. Wir zeigen, dass die konfokale Mikroskopie verwendet werden kann, um die wandernden Verhaltensweisen von verschiedenen Monocyte Subpopulationen gleichzeitig zu untersuchen. Als Beispiel haben wir CD16-Ausdruck verwendet, zur Unterscheidung zwischen Proangiogenic und nicht-angiogenen Monozyten um die Seelenwanderung Kapazität von zwei Subpopulationen in verschiedenen entzündlichen Kontexten zu studieren. Einklang mit unserer jüngsten Publikation, mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie-Modalität, wir haben gezeigt, dass die Seelenwanderung bei CD16+ Monozyten war niedriger, wenn die Endothelzellen monomolekularen Film nur durch TNF3angeregt wurde. Die Kombination von TNF und VEGFA führte jedoch zu einem Anstieg der Seelenwanderung Proangiogenic Monozyten. Die Seelenwanderung war ähnlich hoch für nicht-angiogenen CD16– Monozyten unter beiden entzündlichen Erkrankungen. Wir haben bisher gezeigt, dass keine wesentlichen Auswirkungen auf Seelenwanderung, Monocyte Färbung mit dem Anti-CD16-Antikörper nicht anwesend bestätigt dies durch die Analyse der unbeschrifteten Monozyten nach der Seelenwanderung Assay mit konfokalen Mikroskopie3. Für neue Leukozyten Subtypen oder Antikörper verwendet, um sie zu markieren, muss jedoch die Kennzeichnung Wirkung beurteilt werden. Mit dieser Methode können bis zu drei verschiedene Populationen von Leukozyten gleichzeitig untersucht werden. Dies könnte Subpopulationen, die funktionell unterschiedliche oder ähnliche immun Zelltypen. Obwohl der Schwerpunkt hier auf Monocyte Seelenwanderung, können weitere Schritte ihrer Einstellung auch von dieser Methode, einschließlich der Zelle Verhalten vor Seelenwanderung, z. B. erfassen und migrantisch Direktionalität analysiert werden. Post-Seelenwanderung Veranstaltungen wie abluminalen Aufbewahrung und umgekehrte Seelenwanderung können auch für die verschiedenen Leukozyten Bevölkerung als Erweiterung dieser Methode untersucht werden. Eine Einschränkung ist die schlechte Erkennung der Färbung in der dunkelrote Kanal im Zeitraffer Bildgebung sowie einige Wandergruppen die Fluoreszenz-Signale, die die Z-Stapel-Auflösung zu reduzieren. Dies bezog sich vor allem auf das Instrument für die konfokale Bildgebung verwendet. Die Verwendung von Bild Dekonvolution konnte schließlich dazu beitragen, die Bildqualität verbessern und ermöglichen weitere Analyse der verschiedenen Schritte der Leukozyten-Rekrutierung.

Um die Rekrutierung von Leukozyten unter optimalen Bedingungen zu untersuchen, ist es wichtig, den Aktivierungsstatus der Endothelzellen Monolage zu überprüfen. In der Tat führt eine mangelhafte Aktivierung von Endothelzellen zu einem weltweiten Rückgang der Monocyte Adhäsion und Seelenwanderung. Endothelialer Zellaktivierung kann überprüft werden, indem Sie die Expression der Adhäsionsmoleküle auf Endothelzellen Oberfläche wie ICAM1 und VCAM1 zu analysieren. Das Maß dieser Adhäsion Moleküle erhöht werden müssen, im Vergleich zu unstimulierte Endothelzellen. Wenn keine Änderung in diese endothelialen Adhäsionsmoleküle nachweisbar ist, kann der kultivierten HUVECS in Betracht gezogen werden nicht aktiviert. Die Expression der Adhäsionsmoleküle Beurteilung kann eine gute quantitative Kontrolle zwischen verschiedenen Experimenten mit der gleichen Charge von HUVECS darstellen. Die Expression dieser Adhäsion Moleküle kann jedoch auch zwischen verschiedenen Primärkultur der Endothelzellen, die Begrenzung der Berücksichtigung einer globalen Schwelle ICAM1 oder VCAM1 variieren. Die Veränderung in Form von vaskuläre Endothelzellen wie HUVECS ist auch ein guter Indikator für deren Aktivierung. Diese letztere Änderung im Phänotyp ermöglicht eine schnelle und qualitative Bewertung der HUVECS Aktivierung. Jedoch möglicherweise die Analyse der Adhäsionsmoleküle eine bessere Wahl für mikrovaskuläre Zellen, die größere Formänderung bei Aktivierung mit inflammatorischen Zytokinen nicht angezeigt.

Für mechanistische Studien können relevante negative Kontrollen der Monocyte Seelenwanderung mit Antikörper gegen endothelialen Adhäsionsmoleküle wie ICAM1, VCAM1 oder auf Leukozyten Oberfläche wie Leukozyten Funktion-assoziierte Antigen (LFA)-1 durchgeführt werden. Die Verwendung von entsprechenden Negativkontrolle ist essentiell für solche mechanistischen Studie in Monozyten als sie Fc-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche zum Ausdruck bringen. Die Reinheit der Monozyten nach Isolierung ist auch wichtig, um Verunreinigungen durch andere Leukozyten-Bevölkerung und einer Unterschätzung der Rate der Monocyte Seelenwanderung zu vermeiden. Ein weiterer kritischer Parameter ist die Temperatur, das bei 37 ° C für alle Assays eingestellt werden, um sicherzustellen, dass alle experimentelle Beobachtungen relevant sind und dementsprechend zu menschlichen in-Vivo Zelle des Menschenhandels zu übersetzen muss.

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Disclosures

Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Paul Bradfield Manuskript lesen und Feedbacks. A. S. erhielt finanziellen Unterstützung von der Sir Jules Thorn gemeinnützige Overseas Trust reg.,

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture Flasks 75 cm2 TPP 90076 Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4 IBIDI 80606
Centrifuge Tubes 15 mL TPP 191015
Centrifuge Tubes 50 mL TPP 191050
Collagen G Biochrom L 7213 For coating of cell culture flasks
Gelatin Sigma-Aldrich 1393 For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
3-Way Stopcocks BIO-RAD 7328103
penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL AMIMED 4-02F00-H
Collagenase type 1 Worthington LS004216
Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes GIBCO 22340020
Bovine Albumin Fraction V ThermoFisher 15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg Millipore 02-102
Heparin Sodium Sigma-Aldrich H3149RT
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H6909
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O APPLICHEM A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC Miltenyi Biotech 130-100-713 AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE Miltenyi Biotech 130-110-807 AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC Miltenyi Biotech 130-107-016 AB_2653263
BD Accuri C6 Plus BD Bioscience
µ-Slide I Luer IBIDI 80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) ThermoFisher C2925
Recombinant human TNFα Peprotech 300-01A
Recombinant human VEGFA Peprotech 100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump KF Technology NE-1000
Ficoll Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE Miltenyi Biotech 130-110-519 AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human Miltenyi Biotech 130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE Miltenyi Biotech 130-106-762 AB_2655403
LS columns Miltenyi Biotech 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech 130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate ThermoFisher H1399
Silicone tubing IBIDI 10841
Elbow Luer Connector IBIDI 10802
Female Luer Lock Coupler IBIDI 10823
Luer Lock Connector Female IBIDI 10825
In-line Luer Injection Port IBIDI 10820
Ar1 confocal microscope Nikon
40x objective Nikon 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software NIH

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References

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