Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Blut-Hoden-Schranke Integrität durch Einspritzen von Inulin-FITC in Hoden zu beurteilen. Dies ist eine effiziente in Vivo -Methode, um die Blut-Hoden-Schranke Integrität zu studieren, die durch genetische und umweltbedingte Elemente beeinträchtigt werden kann.
Abstract
Spermatogenese ist die Entwicklung von Spermatogonien zu reifen Spermien in den seminiferous Röhrchen der Hoden. Dieser Prozess wird von Sertoli Zelle Kreuzungen an der Blut-Hoden-Schranke (BTB), unterstützt die engste Gewebe-Barriere im Säugetier-Körper und trennt die seminiferous Epithel in zwei Kammern, eine basale und eine Adluminal. Die BTB schafft eine einzigartige Mikroumgebung für Keimzellen in Meiose ich / II und für die Entwicklung der postmeiotic Spermatids in Spermien über Spermiogenesis. Hier beschreiben wir eine zuverlässige Assays zur Überwachung der BTB Integrität der Maus Hoden in Vivo. Eine intakte BTB blockiert die Diffusion der FITC konjugiert Inulin aus der basalen zum apikalen Fach von seminiferous Röhrchen. Diese Technik eignet sich für das Studium gen Kandidaten, Viren oder Umweltgifte, die BTB Funktion oder Integrität, ein einfaches Verfahren und eine minimale Anforderung von chirurgischen Fähigkeiten im Vergleich zu alternativen Methoden beeinflussen können.
Introduction
Säugetier-Spermatogenese wird einen sehr strukturierten Prozess betrachtet, der spermatogonial Selbsterneuerung und Differenzierung durch Spermatozyten in haploide Spermien über Mitose und Meiose Spermiogenesis, während die dramatischen umfasst biochemische und morphologische Veränderungen auftreten. Entwickelnden Keimzellen werden schrittweise von der Basis von seminiferous Röhrchen in Richtung Lumen transportiert. Dieser Prozess wird durch Zell-Zell-Kontakte zwischen den Keimzellen und Sertoli-Zellen1,2geregelt. Benachbarte Sertoli-Zellen bilden die BTB, die nahe der Unterseite von seminiferous Röhrchen befindet. Die BTB teilt physisch das Epithel in eine basale und ein Adluminal Fach. In Phasen VIII - IX des Kreislaufs epithelialen migrieren Preleptotene/Leptotän Spermatozyten aus der basalen Fächer auf der BTB, Eingabe der Adluminal Fächer3. Daher soll die Funktion der BTB eine Immunabwehr Mikroumgebung für den Abschluss der Meiose und Spermiogenesis4,5,6. Im Gegensatz zu anderen Gewebeprobe Barrieren (z.B., Blut - Hirn-Schranke), die nur von tight Junctions (TJs) bestehen, bildet die BTB vier verschiedene Kreuzungen (TJs ectoplasmic Spezialisierungen, Gap Junctions und Intermediate Filament-basierte Desmosomes) zwischen den Sertoli-Zellen1,7.
Viele Studien haben genetisch veränderte Mäuse, Virus-Infektionen und Umweltgifte verwendet, um die Mechanismen von BTB Integrität7,8,9zu untersuchen. Die BTB-Störung induziert eingeschränkter Spermatogenese und Subfertilität oder Unfruchtbarkeit. Da die BTB Bildung und Integrität bestätigt wurden Kontakte zwischen den Sertoli-Zellen8betroffen zu sein, hat eine in-vitro- Modell basierend auf Primärkultur von isolierten Sertoli-Zellen verwendet worden für BTB-Studie. Dieses Modell kann nicht jedoch genau BTB Dynamik in Vivoimitieren. Darüber hinaus wurde keine solche Kokulturen von Keimzellen mit Sertoli-Zellen in der Lage, alle relevante strukturelle und funktionelle Komponenten der BTB10,11reflektieren gegründet.
Im Allgemeinen basieren in der Regel in Vivo BTB Integrität Assays auf kleinen Molekülen, wie EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin und FITC konjugiert Inulin (Inulin-FITC). Normalerweise wird die Diffusion von Biotin oder Inulin-FITC aus dem basalen Fach von BTB Struktur blockiert. Daher sind wir in der Lage, diese Methode zu verwenden, um zu prüfen, inwieweit der BTB Schaden im Vergleich zu Kontrollgruppen. Während bestimmte Reize, wie Behandlung mit Cadmium Chlorid (CdCl2)12, BTB kompromittiert werden kann wird BTB für kleine Moleküle, die schließlich das Adluminal Fach als Indikatoren geben Sie zugänglich.
Ein frühe in Vivo BTB Integrität Assay wird Biotin oder Inulin-FITC in die Halsschlagader, die Chirurgie umfasst, und ist invasiv, kompliziert und zeitaufwändig. Außerdem, wie Reporter Stoffe durch den ganzen Körper über den Blutkreislauf diffundieren, beschränkt sich die lokale Konzentration von Biotin oder Inulin-FITC in seminiferous Röhrchen. Darüber hinaus kann systemische Exposition Immunreaktionen auslösen. Hier präsentieren wir Ihnen einen einfache und effektive in Vivo BTB Integrität Assay ermöglicht direkten Einspritzung von einer kleinen aliquoten Inulin-FITC in das Interstitium ein Hoden. Die fluoreszierenden Kennzeichnung Methode verwenden, ist die Färbung Prozess praktisch, da sekundäre Antikörper nicht erforderlich sind. Hier wird der Prozess der Fluoreszenzfarbstoff Eintritt in den Hoden visualisiert.
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Protocol
Alle durchgeführten Tierversuche wurden von der Nanjing Medical University-Ausschuss genehmigt. Männliche C57BL/6 Mäusen wurden unter kontrollierter Photoperiode Bedingungen gehalten und waren mit Nahrung und Wasser versorgt.
1. Vorbereitungen
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Mikroinjektion Kapillaren
- Verwenden Sie Mikroinjektion Kapillaren bzw. mit einem Außendurchmesser, innere Dimeter und Länge von 1,0 mm, 0,8 mm und 10,0 cm.
- Ziehen Sie Glaskapillaren mit einem Kapillar Abzieher (Abbildung 1A). Testen Sie und passen Sie die Einstellungen abhängig von der Kapillare Puller-Maschine, die verwendet wird.
- Brechen Sie die Pipettenspitzen mit der Pinzette verwenden, um die Kapillaren mit einem 50 µm Durchmesser an der Spitze zu erhalten.
Hinweis: Die Tipps möglicherweise zu lang, um den Hoden zu durchdringen. - Schärfen Sie die Spitze in einem 30°-Winkel mithilfe einer Mikropipette Beyeler (Abbildung 1).
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Reagenzien
- Bereiten Sie 1 % Pentobarbital-Natrium: Natrium Pentobarbital 100 mg in 10 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Schritt 2.3.3) auflösen.
- 10 mg/mL Inulin-FITC vorbereiten: Auflösen von Inulin-FITC 1 mg in 100 μl PBS (Schritt 2.1.6).
- Bereiten Sie 4 % Paraformaldehyd: Auflösen von Paraformaldehyd (PFA) 4 g in 100 mL PBS (Schritt 2.3.3).
- 30 % Saccharose vorbereiten: Saccharose 3 g in 10 mL PBS (Schritt 2.3.4) auflösen.
- 0,1 % Cadmium Chlorid vorbereiten: Auflösen von Cadmium Chlorid 10 mg in 10 mL PBS (Schritt 2.1.1).
(2) Methoden
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Anästhesie und Presurgery Vorbereitung
- 8 Wochen alten C57BL/6 männliche Mäuse wiegen und die erforderliche Dosis von CdCl2zu berechnen. Eine Gruppe von Mäusen zu behandeln (n = 3) mit CdCl2 (5 mg/kg b.w., i.p.) für 3-d vor der Operation. Eine weitere Gruppe von 8 Wochen alten C57BL/6 männliche Mäuse zu behandeln (n = 3) mit PBS als Kontrolle.
- Führen Sie Operation unter aseptischen Bedingungen mithilfe sterile Spritze, Nadel, Schere und Zange aus.
- Anästhesie Arbeitslösung frisch zubereiten. Die erforderliche Dosis von Anästhesie ist 70 mg Pentobarbital-Natrium/kg Körpergewicht. Im Durchschnitt wiegt ein Erwachsener C57BL/6 Mäuse im Alter von 8 Wochen ~ 25 g, das entspricht 175 μL der 1 %-Pentobarbital-Natrium (1,75 mg / Maus).
Hinweis: Das Natrium Pentobarbital wird in sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) aufgelöst. Die Lösung wird filtriert von 0,22 Umm Filtereinheit vor der Verwendung. - Reinigen Sie den Bereich für die Chirurgie mit 75 % Ethanol und die Fläche mit einem sauberen Tuch Handtuch.
- Schalten Sie den Thermostat Heizung und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C.
- Inulin-FITC funktionierende Lösung (10 mg/mL) am Tag der Operation vorzubereiten.
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Chirurgischer Eingriff
- 8 Wochen alten C57BL/6 männliche Mäuse wiegen und die erforderliche Dosis von Anästhesie zu berechnen.
- Führen Sie eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium mit der 1-mL sterile Spritze. Halten Sie die Maustaste in einem sauberen Käfig.
- Beachten Sie die reflex Reaktion des Auges und Atemmuster der Maus zu bestätigen, dass es komplette Narkose ist.
Hinweis: In der Regel 10-15 min sind nötig, bis die Maus mit einen völligen Mangel an Zehe Prise Reaktion und Wartung von langsamen, stetigen Atmung tief betäubt ist. - Bewegen Sie die Maus auf das OP-Feld und decken Sie ihre Augenpartie mit einem feuchten Papiertuch zu Trockenheit während der Narkose (Abbildung 2A) zu vermeiden.
- Rasieren Sie seinen Bauch Haare mit einem Rasierer zu und desinfizieren Sie den OP-Bereich mit 75 % Ethanol.
- Machen Sie mit einer scharfen Schere einen Hautschnitt von 1 cm oberhalb der Präputial Drüsen, die Bauchdecke verfügbar zu machen. Heben der Bauchdecke mit kleinen Zangen und einem 0,5 cm Einschnitt, der Bauchhöhle (Abb. 2 b) verfügbar zu machen.
- Verwenden Sie Zange zur Fettpolster um die Nebenhoden und Hoden Suche. Ziehen Sie vorsichtig die Fettpolster heraus, um den beigefügten Hoden deutlich verfügbar zu machen (Abbildung 2 und 2D). In der Regel auf einem Hoden gleichzeitig betreiben.
Hinweis: Berühren Sie die Fettpolster und Hoden mit Händen. - Legen Sie eine Papier (9 cm Durchmesser) unter dem Fettpolster und Hoden (Abbildung 2).
- Injizieren Sie Inulin-FITC in einer Mikroinjektion Pipette und schließen Sie es an das defekte Gerät (Abbildung 1). Sanft legen Sie die Mikroinjektion Pipette unter der Tunica Albuginea und laden Sie insgesamt 20 μL der Inulin-FITC in das Interstitium der Hoden (Abb. 2E und 2F).
Hinweis: Drücken Sie vorsichtig die Mikroinjektion Pipette, um zu vermeiden, wenn Sie ihn bewegen. - Überwachen Sie die Bewegung der Inulin-FITC in den Hoden (Abbildung 2).
- Sofort setzen Sie die Hoden wieder in die Bauchhöhle nach Abschluss der Injektion.
- Wiederholen Sie den Vorgang auf der kontralateralen Hoden. Diese Hoden wird mit 20 μl PBS als Steuerelement injiziert.
- Schließen Sie die Haut mit einer chirurgischen Naht und bewegen Sie die Maus auf einem Wärmekissen eines thermostatischen Heizung (Abbildung 1 b). Verabreichen Sie eine Dosis von 1 mg Analgetikum (Buprenorphin) pro 1 kg Körpergewicht durch subkutane Injektion.
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Ernte der Hoden und Gefrierschnitte Vorbereitung
- 40 min nach der Injektion die Empfänger Maus durch zervikale Dislokation nach Tierbetreuung einschläfern und Richtlinien.
- Verwenden Sie ein paar der scharfen Schere um die Hoden zu sammeln. Legen Sie die Hoden in 1 mL eiskaltem PBS, Verunreinigungen Blut zu entfernen.
- Beheben den Hoden in 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei 4 ° C für 12-24 h. verwerfen die 4 % PFA und waschen das Gewebe 3 X mit 1,5 mL 1 % PBS bei Raumtemperatur.
- Das Gewebe in 30 % Saccharose über Nacht austrocknen. Den Hoden in der einbettenden Rahmen und bedecken Sie das Gewebe mit optimale Arbeitstemperatur zusammengesetzte (OCT). Nachdem das Office-Anpassungstool gesperrt ist, OCT füllen Sie einbetten Frame ein, so dass der ganze Hoden mit OCT abgedeckt werden kann.
- Schnitt 5 μm Dicke, gefrorene Querschnitte der Hoden in einem Kryostaten bei-20 ° C und lassen sie die Objektträger einhalten.
Hinweis: Reinigungserinnerung eingebetteten Gewebe in Trockeneis erhöht die Steifigkeit zum Schneiden.
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Bild-Suchauftrag
- Legen Sie die Folien in einer befeuchteten Box. Die Folien bei Raumtemperatur für 10 min warm.
- Waschen Sie die Abschnitte 3 X mit Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) bei Raumtemperatur.
- An der Luft trocknen Sie für 5 min in der Dunkelheit. Wischen Sie alle verbleibenden TBS mit staubfreien Papier.
- Decken Sie die Querschnitte mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI). Ort der invertierten Deckglas auf einen Objektträger.
- Abrufen von Bildern mit einem konfokalen Mikroskop. Insgesamt 20 X Vergrößerung ist in der Regel ausreichend für die Erkennung der hell Fluoreszenzsignal.
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Representative Results
Der Versuchsaufbau für die Durchführung der BTB-Integrität-Assay ist in Abbildung 1dargestellt. Ziehen und Mikroinjektion Kapillaren mit einer Kapillare Puller und Mikropipette Beyeler, bzw. zu schärfen (Abb. 1A und 1 C). Der Thermostat Heizung und Ausrüstung für die Mikroinjektion sind in Abbildung 1 b und 1Ddargestellt.
Abbildung 2 zeigt einige der wichtigsten Schritte für die Injektion von Inulin-FITC. Mit einer Schere um einen kleinen Schnitt zu machen, nachdem die Maus komplette Anästhesie (Abb. 2A und 2 b) unterzogen wurde. Die Maus-Hoden ausgesetzt und mit fluoreszierenden Farbstoff mit einer Mikroinjektion Pipette (Abb. 2 - 2 G) injiziert.
Abbildung 3 zeigt typische Bilder von einer Studie, die die BTB-Integrität basierend auf ein in-Vivo -Test zu bewerten. Die Mäuse in der CdCl-2-Behandlungsgruppe werden mit einer akuten Dosis von CdCl2 (5 mg/kg b.w., i.p.) für 3 Tage injiziert. Die Diffusion von Inulin-FITC aus dem basalen Fach wird von BTB-Struktur in der Kontrollgruppe, während die BTB-Bau beschädigt ist und Inulin (grüne Fluoreszenz) Passagen in der apikalen Fach seminiferous Epithel in CdCl2 blockiert -Behandlungsgruppe. Weiße Linien zeigen die zurückgelegte Strecke durch das Inulin aus der Basalmembran (Abb. 3A). Das Ausmaß der BTB Schäden richtet sich nach der Entfernung. Für eine elliptische Lumen ist der Radius der Durchschnitt der die kürzeste und die längste Strecke aus dem basalen Fach in der Mitte des der Röhrchen. Wir verwenden dieses Verhältnis als Index für das Ausmaß des Schadens BTB:
Hier DInulin wird die zurückgelegte Strecke durch Inulin aus basalen Fach und DRadius ist der Radius des gleichen seminiferous Röhrchen (Abb. 3 b). Die intakte BTB in Rictorfl / + Mäusen blockiert die Diffusion von Inulin durch die Schranke der apikale Fach eingeben. Im Gegensatz dazu haben RictorCko Mäuse einen kompromittierten BTB schönem Inulin Diffusion (Abbildung 3).
Abbildung 1: Ausrüstung für die Maus Hoden interstitielle Mikroinjektion. (A) ziehen Glas Kapillaren mit einem vertikalen Kapillare Abzieher. (B) dieses Panel zeigt die Thermostat-Heizung. (C) die Spitzen sind geschärft mit Mikropipette Beyeler. (D) die Einheit für die Mikroinjektion umfasst eine Mikroinjektion Pumpe und ein Stereo-Mikroskop. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder für ein in-Vivo Hoden interstitielle Mikroinjektion in eine Maus. (A) dieses Panel zeigt die Haarentfernung Bauch durch einen Rasierer. (B) dieses Panel zeigt den Bauchdecke 0,5 cm Schnitt der Bauchhöhle aussetzen. (C) ziehen Sie das Fett pads aus den beigefügten Hoden deutlich aussetzen. (D) dieses Panel zeigt die Position der Hoden und Nebenhoden. (E) dieses Panel zeigt die Position der Mikroinjektion Pipette. (F) Einsatzes der Mikroinjektion Pipette in das Interstitium der Hoden. (G) dieses Panel zeigt ein Hoden mit einem erfolgreichen Injektion in das Interstitium der Hoden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Eine Studie zur Bewertung der BTB-Integrität basierend auf einem in Vivo funktionelle Assay. Erwachsene männliche Mäuse (n = 3 in der Behandlungsgruppe und der Kontrollgruppe) mit CdCl2 (5 mg/kg b.w., i.p.) für 3 Tage (Behandlungsgruppe) behandelt oder mit PBS für 3 Tage (Kontrollgruppe) behandelt werden. Inulin-FITC (grüne Fluoreszenz) befindet sich in der Nähe der Basis von seminiferous Röhrchen in der Kontrollgruppe, Inulin-FITC eine Passage über die BTB in der CdCl2-behandelten Gruppe initiiert. (A) In diesem Bereich weiße Liniensegmente anzuzeigen Abstand Inulin-FITC dringt. Der Maßstabsbalken sind 20 μm. (B) Daten aus der BTB-Integrität-Assays sind in diesem Histogramm gezeigt die die zurückgelegte Strecke durch Inulin (DInulin) vs. zeigen den Radius des gleichen Röhrchen (DRadius). Achtzig Tubuli werden zufällig ausgewählt. P < 0,001 (der Student t-test). (C) die BTB Integrität ist in Hoden RictorCko Mäuse gefährdet. In RictorCko Maus Tubuli dringt das Inulin tief in die seminiferous Epithel, das Röhrchen Lumen erreichen. Der Maßstabsbalken sind 50 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Spermatogenese findet in seminiferous Epithel und ist ein hoch geordneten und dynamischen Prozess, die Keimzellen und somatischen Zellen unterliegt (z. B. Sertoli-Zellen)13. Die BTB-Struktur, die durch die Sertoli-Zellen aufgebaut ist, teilt die seminiferous Epithel in eine basale und eine apikale Fach. Die Entwicklung der meiotischen und haploiden Keimzellen erfolgt in der apikalen Fach bildet eine immunologische Barriere14.
Die BTB-Funktion kann durch Giftstoffe oder Defekte in Genen beteiligt an der Gründung der Zelle Kreuzungen, führt zu Unfruchtbarkeit beeinträchtigt werden. Um BTB Integrität zu prüfen, imitiert ein in-vitro- Sertoli Zellkultursystem etabliert hat, die bilden funktionelle Epithel, die eng vermag der BTB in Vivo15. Dieses in-vitro- System bietet ein einfaches Modell zur Untersuchung der Struktur und Funktion der Sertoli Zelle Kreuzungen. Jedoch Sertoli-Zellen von Hoden isoliert und kultiviert in Vitro beschränken sich in Bezug auf Tiere Alter und Zelle Dichte15,16. Darüber hinaus überwacht die Reinheit der Sertoli-Zellen und das Vorhandensein von Feinstrukturen imitiert BTB-Funktionen werden müssen17. Noch wichtiger ist, BTB Struktur und Integrität erfordern auch Interaktionen zwischen den Keimzellen und Sertoli-Zellen, wie aus Studien der Keim-zellspezifische null mutierte Mäuse mit BTB Mängel10,18,19. So Zellen erstellen eine Kokulturen von Keimzellen mit Sertoli in Vitro für der Zweck der Rekapitulation alle entscheidenden in Vivo -Funktion der BTB herausfordernde11,20bleibt.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Beurteilung BTB Integrität in Vivo durch die Injektion von Inulin-FITC, die aus einer Prozedur von Chen Et Al. geändert wurde 21. das Protokoll beschreibt die Anästhesie des männlichen Mäusen, die Exposition von der Bauchhöhle, die Mikroinjektion von Farbstoff in das Interstitium der Hoden, Ernte der Hoden und Einschneiden Gefrierschnitte und dem Erwerb von Bildern. Für einen erfolgreichen Abschluss mehrere Schritte hinzuweisen. Erstens ist es wichtig, eine angemessene Dosis der Anästhesie, verwenden, da stark Tiefe Narkose Tod verursachen kann. Die Länge von der Spitze der Kapillare Injektion sollte auch nicht zu lang sein; Andernfalls kann nicht die Pipette die Hoden eindringen.
Die hier vorgestellten Verfahren kann genutzt werden, für die Analyse der Rolle von Viren, chemische Giftstoffe oder Kandidat Proteinen beteiligt an der Regulation des BTB. Dieser Test ist empfindlich, zuverlässige und zugänglich, BTB Integrität in Vivozu überwachen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der nationalen Schlüssel R & D Program of China (2016YFA0500902), der National Natural Science Foundation of China (31471228, 31771653), der Jiangsu Science Foundation Distinguished jungen Gelehrten (BK20150047), die Naturwissenschaft unterstützt. Gründung der Provinz Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) und dem innovativen und unternehmerischen Programm der Provinz Jiangsu, K.Z
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
References
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