Summary
ここでは、精巣にイヌリン FITC を注入して血液精巣関門の整合性を評価するためのプロトコルを提案する.遺伝と環境要素によって危険にさらされることができます血液精巣関門の整合性を研究するため生体内で効率的な方法です。
Abstract
精子は、精巣の精細管で成熟した精子に精巣の開発です。このプロセスは、哺乳類の体に厳しい組織障壁であり 2 つのコンパートメント、基部と、adluminal に精上皮を分離血液精巣関門 (BTB) でセルトリ細胞によってサポートされます。BTB 減数分裂における生殖細胞のユニークな微小環境を作成します私/II と精子形成を介して精子に postmeiotic 細胞の開発のため。ここでは、マウス精巣体内の BTB の整合性を監視する信頼性の高いアッセイについて述べる。そのまま BTB 指示薬の頂のコンパートメントに基底からイヌリンを FITC 結合の拡散をブロックします。この手法は、候補遺伝子、ウイルス、または BTB 関数または簡単な手順と方法と比較して手術技能の最小限の要件との整合性に影響を与える可能性があります環境の毒性を勉強に適しています。
Introduction
哺乳類精子は精原自己複製と劇的な中半数体精子細胞分裂、減数分裂、精子形成、精母細胞を分化を含む高度に構造化されたプロセスと見なされます生化学的および形態学的変化が発生します。発展途上の生殖細胞は精細管内腔に向かっての基本から徐々 に転送されます。このプロセスは、生殖細胞、セルトリ細胞1,2間細胞細胞の接触によって規制されています。隣接するセルトリ細胞は精細管の基地の近くに位置する BTB を形成します。物理的に、BTB は、上皮を基部と adluminal のコンパートメントに分割します。段階 VIII ・ IX 上皮サイクルの基底のコンパートメントから preleptotene/leptotene を精母細胞は adluminal コンパートメント3に入る、BTB の間で移行します。したがって、BTB の機能は、減数分裂と精子形成の4,5,6の完了した immunoprivileged の微小環境を提供することです。その他血液-組織の障壁 (例えば血液脳関門) タイトな接合 (TJs) だけで構成されるのとは異なり、BTB は 4 つの異なる接合 (TJs、心霊の特殊化、ギャップ結合および中間フィラメント ベースによって形成されます。デスモゾーム) セルトリ間細胞1,7。
多くの研究は、BTB 整合性7,8,9のメカニズムを調査するため、遺伝子組み換えマウス、ウイルス感染、環境有害物質を使用しています。BTB 中断障害精子と受精率低下や不妊を誘発します。孤立したセルトリ細胞の初代培養に基づく体外モデルを使用されていますので BTB 形成と整合性は、セルトリ細胞8間の接触の影響を受ける確認されている、BTB スタディの。ただし、このモデルは、BTB 動態の生体内を模倣することはできません正確に。また、セルトリ細胞と生殖細胞のような共同の文化は確立されていない BTB10,11のすべての関連する構造・機能コンポーネントを反映することができます。
一般に、生体内でBTB 整合性の試金は通常 EZ リンク スルホ-NHS-LC-ビオチンと FITC 結合イヌリン (イヌリン FITC) などの小さな分子に基づいています。通常、ビオチンまたは基底のコンパートメントからイヌリン FITC の拡散は、BTB 構造によってブロックされます。したがって、我々 はコントロール群と比較して BTB 損傷の程度を評価するためにこのメソッドを使用することができます。BTB は、BTB カドミウム塩化 (CdCl2)12、治療などの刺激の特定の種類の危険にさらされることができます最終的に指標として adluminal コンパートメントを入力する小分子にアクセス可能になります。
BTB 整合性アッセイ体内初期ビオチンまたはイヌリン FITC を侵襲的な複雑で時間のかかるを外科では、頚静脈に注入することが含まれます。その上、記者物質は循環を介して全身を通って拡散、ビオチンまたは精細管でイヌリン FITC の局所濃度は限られる。また、全身の露出は免疫反応を引き起こす可能性があります。シンプルで効果的な体内BTB 整合性試金、精巣の間質にイヌリン FITC の小さい因数の直接注入を有効にするを紹介します。蛍光分類方法を使用して、染色のプロセスは便利な二次抗体は必要ないためです。ここでは、精巣に入る蛍光染料のプロセスを視覚化します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての行われた動物実験は、南京医科大学の委員会によって承認されています。男性の c57bl/6 マウス制御日長条件下で保管された、食料と水と供給されました。
1. 準備
-
マイクロインジェクション毛細血管
- 外径、内側径 10.0 cm、0.8 mm、1.0 mm の長さとマイクロインジェクション毛細血管をそれぞれ使用します。
- キャピラリーの引き手 (図 1 a) にガラス管を引き出します。テストし、使用されている毛細血管の引き手マシンに応じて設定を調整します。
- ピペット チップを先端に 50 μ m 径の毛細血管を取得に使用する鉗子で破る。
注: ヒントは精巣を貫通するには長すぎる可能性があります。 - マイクロ ピペットの面取り機 (図 1) を使用して、30 ° の角度で先端をシャープに。
-
試薬
- 1% ペントバルビ タール ナトリウムを準備: ペントバルビ タール ナトリウム 100 mg のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (ステップ 2.3.3) 10 mL に溶かします。
- 10 mg/mL イヌリン FITC を準備: イヌリン FITC 100 μ L の PBS (ステップ 2.1.6) で 1 mg を溶解します。
- 4% のパラホルムアルデヒドの準備: パラホルムアルデヒド (PFA) 4 g で 100 mL の PBS (ステップ 2.3.3) を解散。
- 30% ショ糖を準備: ショ糖 10 mL の PBS (手順 2.3.4) での 3 g を溶かします。
- 0.1% 塩化カドミウムを準備: 塩化カドミウム PBS (ステップ 2.1.1) 10 mL に 10 mg を溶解します。
2. 方法
-
麻酔と presurgery の準備
- 8 週齢の c57bl/6 男性マウスの重量を量るし、CdCl2の必要量を計算します。マウスのグループを扱う (n = 3) CdCl2 (キリアド プレステージ 5 mg/kg, i. p.) の術前に、3 d。8 週齢の c57bl/6 男性マウスの別のグループを扱う (n = 3) コントロールとして PBS の。
- 滅菌注射器、針、ハサミ、鉗子を使用して無菌条件下で手術を行います。
- 新鮮な麻酔作業ソリューションを準備します。麻酔の必要な線量は、ペントバルビ タール ナトリウム/kg 体重の 70 mg です。平均では、8 週齢で大人の c57bl/6 マウス 1% ペントバルビ タール ナトリウム (マウスあたり 1.75 mg) の 175 μ L に相当する 〜 25 グラムの重さ。
注: ペントバルビ タール ナトリウム滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に溶解しています。ソリューション 0.22 um フィルターが使用される前にフィルター ユニット。 - エタノール 75% と手術のための区域をきれいにしクリーンな組織タオルで領域をカバーします。
- サーモスタットのヒーターをオンにし、37 ° c. に温度を調整
- 手術の日にイヌリン FITC 作業ソリューション (10 mg/mL) を準備します。
-
手術の手順
- 8 週齢の c57bl/6 男性マウスの重量を量るし、麻酔の必要量を計算します。
- ペントバルビ タール ナトリウム 1 mL 滅菌注射器を使用しての腹腔内投与を行います。きれいなケージでマウスを維持します。
- 目の反射的な反応と完全な麻酔の下でことを確認するためにマウスの呼吸パターンを観察します。
注: 通常、10 〜 15 分必要なマウスを麻酔が深く、つま先ピンチ応答の完全な欠如と遅い、安定した呼吸のメンテナンスまで。 - 操作領域にマウスを移動し、麻酔 (図 2 a) 中の乾燥を避けるために湿ったティッシュ ペーパーでその眼の領域をカバーします。
- 髭剃りと、腹部の毛を剃る、75% エタノールと切開部を消毒してください。
- 鋭いハサミで腹壁を公開する包皮腺の上 1 cm 皮膚切開をします。小鉗子で腹壁を持ち上げて、0.5 cm 切開腹腔内 (図 2 b) を公開します。
- 精巣上体、精巣周囲脂肪パッドを検索する鉗子を使用します。添付の精巣を明確に公開する脂肪パッドを慎重に引き出します (図 2および2 D)。通常、一度に 1 つの精巣に動作します。
注: は、脂肪パッドと手で精巣には触れないでください。 - 脂肪パッドと精巣 (図 2) の下に紙 (直径 9 cm) を置きます。
- マイクロインジェクション ピペット注入イヌリン FITC とマイクロマニピュレーター ユニット (図 1) に接続します。優しく逃げず下マイクロインジェクション ピペットを挿入し、(図 2 eおよび2 f) 精巣の間質にイヌリン FITC の 20 μ L の合計を読み込みます。
注: は慎重に移動することを避けるためにマイクロインジェクション ピペットを押し下げます。 - (図 2) 精巣におけるイヌリン FITC の動きを監視します。
- ただちに精巣は腹腔内に注入完了後バックアップします。
- 対側精巣の手順を繰り返します。この精巣は、コントロールとして PBS の 20 μ L が注入されます。
- 手術用の縫合糸で皮膚を閉じて、サーモスタットのヒーター (図 1 b) の熱パッドにマウスを移動します。皮下注射で体重 1 kg あたりに鎮痛剤 (ブプレノルフィン) の 1 mg の投与します。
-
精巣と凍結切片作製を収穫
- 注入後 40 分動物のケアによると頚部転位によって受信者のマウスを安楽死させるし、ガイドラインを使用します。
- シャープはさみのペアを使用して、精巣を収集します。1 mL の血液汚染を削除する氷冷 PBS に精巣を配置します。
- 12-24 破棄のための 4 ° C で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の精巣を修正、4 %pfa と洗浄組織 3 1.5 ml 室温で 1 %pbs の x。
- 一晩 30% ショ糖で組織の水分を取り除きます。精巣を入れて埋め込みフレームとカバーの化合物の最適な切削温度と組織 (OCT)。OCT を冷凍すると、10 月に精巣全体を覆うことができるので、10 月に埋め込みフレームに入力します。
- -20 ° C でクライオスタットで精巣の 5 μ m 厚い、冷凍の断面を切り取ってスライド ガラスに付着させてください。
注: は莖ドライアイスで埋め込まれた組織切削の剛性が増加します。
-
画像依頼
- 加湿ボックスにスライドを配置します。室温で 10 分間スライドを温めます。
- セクション 3 を洗ってトリス緩衝生理食塩水 (TBS) 室温で x。
- 暗闇の中で 5 分間空気乾燥します。埃のない紙で任意の残留 TBS をふき取りなさい。
- 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と断面をカバーしてください。顕微鏡スライドの上逆 coverslip の場所。
- 共焦点の顕微鏡を使用して画像を取得します。20 倍の倍率の合計は、鮮やかな蛍光シグナルを検出だけで十分です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BTB 整合性分析を実行するための実験の設定を図 1に示します。プルし、キャピラリーの引き手とピペットの面取り機、マイクロインジェクション毛細血管をそれぞれシャープ (図 1 a 1 C)。サーモスタットのヒーター用マイクロインジェクション装置は、図 1 bと1 Dで示されます。
図 2イヌリン FITC のインジェクションの主要な手順が表示されます。はさみを使用して、マウス (図 2 aおよび2 b) 完全な麻酔を受けた後に小切開を行います。マウス精巣は露出され、マイクロインジェクション ピペット (図 2 - 2 G) を使用して蛍光色素を注入します。
図 3には、体内の分析に基づく BTB 整合性を評価する研究の典型的なイメージが表示されます。CdCl2マウス-治療群は 3 日間の CdCl2 (キリアド プレステージ 5 mg/kg, i. p.) の急性投与量が注入されます。基底のコンパートメントからイヌリン FITC の拡散は CdCl2 精上皮の根尖部のコンパートメントに BTB コントロール グループ、BTB の構造が破損している中でイヌリン (蛍光グリーン) 通路構造によってブロックされて-治療群。白のライン セグメントは、イヌリン基底膜 (図 3 a) から旅した距離を示します。BTB 損害の範囲は、距離によって決定されます。楕円形の管腔の半径は最短の平均値と尿細管のセンターに基底のコンパートメントからの最長の距離です。BTB 損害の程度の指標としてそのような比率を使用します。
ここで、Dイヌリンは基底のコンパートメントからイヌリンによる走行距離、D半径は同じ精細管 (図 3 b) の半径。そのまま BTB Rictorfl/+マウスは、根尖部のコンパートメントを入力する関門イヌリンの拡散をブロックします。対照的に、 Rictorckoマウス イヌリン拡散 (図 3) を許可する危険にさらされた BTB があります。
図 1: マウス精巣間質性マイクロインジェクション装置。(A) プル ガラス縦キャピラリー引き手と毛細血管。(B) このパネルは、サーモスタットのヒーターを示しています。(C) マイクロ ピペット面取り機を使用してヒントを研ぐ。マイクロインジェクションの単位 (D) では、インジェクション ポンプ、実体顕微鏡を含まれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: マウスの体内に精巣間質性マイクロインジェクション手続きの代表的なイメージです。(A) このパネルの髭剃りによって腹部の毛の除去を示しています。(B) このパネルは、0.5 cm 腹壁切開腹腔内を公開するを示しています。(C) プル脂肪を添付の精巣を明確に公開する埋め込みます。(D) このパネルは、精巣および精巣上体の位置を示しています。(E) このパネルは、マイクロインジェクション ピペットの位置を示しています。(F) は、精巣の間質にマイクロインジェクション ピペットを挿入します。(G) このパネルは、精巣の間注入成功と精巣を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: BTB の整合性を評価するための研究に基づいて体内機能アッセイ。大人の雄マウス (n = 3 治療群と対照群の両方で) CdCl2 (キリアド プレステージ 5 mg/kg, i. p.) で 3 日間 (治療群) の治療または PBS 3 日 (対照群) を処理しました。イヌリン FITC CdCl2 治療群で BTB 間通路を開始する一方、イヌリン FITC (蛍光グリーン) はコントロール グループで精細管の近くです。(A) このパネルで白のライン セグメントを示す距離イヌリン FITC が侵入します。スケール バーは、20 μ m です。BTB の整合性の試金から (B) のデータが表示されますこのヒストグラムでイヌリン (Dイヌリン)対によって走行距離を示す同じ尿細管 (D半径) の半径。80 の細管がランダムに選択されます。P 0.001 < (Student のt-テスト)。Rictorckoマウスの精巣では、(C)、BTB の整合性が損なわれます。Rictorckoマウス尿細管、イヌリンは、尿細管腔に到達、精上皮の奥深く浸透します。スケール バーは、50 μ m です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
精子は精上皮で起こる、生殖細胞と体細胞によって支配される高度順序でダイナミックなプロセス (例えば、セルトリ細胞)13。セルトリ細胞では, BTB 構造分割精上皮、基底部および根尖部のコンパートメント。減数分裂と半数体の生殖細胞の開発は、免疫学的障壁14を形成する根尖部のコンパートメントで発生します。
BTB 関数は毒性または男性不妊につながる細胞接合の形成に関与する遺伝子の欠陥が原因で起きます。BTB の整合性を調べるため体外セルトリ細胞培養系が確立されている密接にその形成上皮のことができる生体内でBTB15を模倣します。この生体外でシステムは、セルトリ細胞の機能と構造を研究するための単純なモデルを提供します。しかし、精巣由来セルトリ細胞と培養の in vitro動物年齢と細胞密度15,16に関して限られています。また、セルトリ細胞の純度と微細構造を模倣した BTB 機能する必要がありますの存在は、17を監視しました。もっと重要な BTB の構造との整合性も生殖細胞および生殖細胞特異 BTB 欠陥10,18,19null 変異マウスの研究から明らかなように、セルトリ細胞間の相互作用が必要です。したがって、BTB のすべての重要な体内機能の概説の目的状態のまま挑戦11,20体外の細胞セルトリと生殖細胞の共培養を作成します。
このプロトコル BTB 整合性体内イヌリン-FITC、陳らによってプロシージャから変更されたを注入することにより評価する方法を記述します。21。 プロトコルは雄マウス、腹腔内の露出、精巣、精巣を収穫し、画像の取得と冷凍のセクションにそれらを切断の間に染料のマイクロインジェクションの麻酔についての説明します。正常に完了のいくつかの手順を注意してください。深刻な深い麻酔は、死を引き起こす可能性がありますのでまず、麻酔科の適切な用量を使用することが重要です。また、注入キャピラリーの先端の長さが長すぎます。 できませんする必要があります。そうでなければ、ピペットは精巣を突き通すことができません。
ここに示す手順は、ウイルス、化学毒性物質または候補 BTB の調節に関与するタンパク質の役割を分析するために利用できます。この試金は敏感な信頼性、および BTB 整合性の体内を監視するアクセスです。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は著名な若い学者 (BK20150047)、自然科学の国立キー R & D 中国プログラム (2016YFA0500902)、国家自然科学基金、中国の (31471228、31771653)、江蘇省の科学技術振興財団によって支えられました。江蘇省 (BK20140897、14KJA180005) と K.Z. に江蘇省の革新的かつ起業家プログラムの基礎
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
References
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
- Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).
- Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
- Fijak, M., Meinhardt, A.
- O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue? Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
- Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
- Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
- Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
- Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
- Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
- Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
- Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
- Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
- Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis? Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
- Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).
- Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
- Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).
