Summary

Eine In-Vivo -Methode, um die Maus Blut-Hoden-Schranke Integrität zu studieren

Published: December 02, 2018
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Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Blut-Hoden-Schranke Integrität durch Einspritzen von Inulin-FITC in Hoden zu beurteilen. Dies ist eine effiziente in Vivo -Methode, um die Blut-Hoden-Schranke Integrität zu studieren, die durch genetische und umweltbedingte Elemente beeinträchtigt werden kann.

Abstract

Spermatogenese ist die Entwicklung von Spermatogonien zu reifen Spermien in den seminiferous Röhrchen der Hoden. Dieser Prozess wird von Sertoli Zelle Kreuzungen an der Blut-Hoden-Schranke (BTB), unterstützt die engste Gewebe-Barriere im Säugetier-Körper und trennt die seminiferous Epithel in zwei Kammern, eine basale und eine Adluminal. Die BTB schafft eine einzigartige Mikroumgebung für Keimzellen in Meiose ich / II und für die Entwicklung der postmeiotic Spermatids in Spermien über Spermiogenesis. Hier beschreiben wir eine zuverlässige Assays zur Überwachung der BTB Integrität der Maus Hoden in Vivo. Eine intakte BTB blockiert die Diffusion der FITC konjugiert Inulin aus der basalen zum apikalen Fach von seminiferous Röhrchen. Diese Technik eignet sich für das Studium gen Kandidaten, Viren oder Umweltgifte, die BTB Funktion oder Integrität, ein einfaches Verfahren und eine minimale Anforderung von chirurgischen Fähigkeiten im Vergleich zu alternativen Methoden beeinflussen können.

Introduction

Säugetier-Spermatogenese wird einen sehr strukturierten Prozess betrachtet, der spermatogonial Selbsterneuerung und Differenzierung durch Spermatozyten in haploide Spermien über Mitose und Meiose Spermiogenesis, während die dramatischen umfasst biochemische und morphologische Veränderungen auftreten. Entwickelnden Keimzellen werden schrittweise von der Basis von seminiferous Röhrchen in Richtung Lumen transportiert. Dieser Prozess wird durch Zell-Zell-Kontakte zwischen den Keimzellen und Sertoli-Zellen1,2geregelt. Benachbarte Sertoli-Zellen bilden die BTB, die nahe der Unterseite von seminiferous Röhrchen befindet. Die BTB teilt physisch das Epithel in eine basale und ein Adluminal Fach. In Phasen VIII – IX des Kreislaufs epithelialen migrieren Preleptotene/Leptotän Spermatozyten aus der basalen Fächer auf der BTB, Eingabe der Adluminal Fächer3. Daher soll die Funktion der BTB eine Immunabwehr Mikroumgebung für den Abschluss der Meiose und Spermiogenesis4,5,6. Im Gegensatz zu anderen Gewebeprobe Barrieren (z.B., Blut – Hirn-Schranke), die nur von tight Junctions (TJs) bestehen, bildet die BTB vier verschiedene Kreuzungen (TJs ectoplasmic Spezialisierungen, Gap Junctions und Intermediate Filament-basierte Desmosomes) zwischen den Sertoli-Zellen1,7.

Viele Studien haben genetisch veränderte Mäuse, Virus-Infektionen und Umweltgifte verwendet, um die Mechanismen von BTB Integrität7,8,9zu untersuchen. Die BTB-Störung induziert eingeschränkter Spermatogenese und Subfertilität oder Unfruchtbarkeit. Da die BTB Bildung und Integrität bestätigt wurden Kontakte zwischen den Sertoli-Zellen8betroffen zu sein, hat eine in-vitro- Modell basierend auf Primärkultur von isolierten Sertoli-Zellen verwendet worden für BTB-Studie. Dieses Modell kann nicht jedoch genau BTB Dynamik in Vivoimitieren. Darüber hinaus wurde keine solche Kokulturen von Keimzellen mit Sertoli-Zellen in der Lage, alle relevante strukturelle und funktionelle Komponenten der BTB10,11reflektieren gegründet.

Im Allgemeinen basieren in der Regel in Vivo BTB Integrität Assays auf kleinen Molekülen, wie EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin und FITC konjugiert Inulin (Inulin-FITC). Normalerweise wird die Diffusion von Biotin oder Inulin-FITC aus dem basalen Fach von BTB Struktur blockiert. Daher sind wir in der Lage, diese Methode zu verwenden, um zu prüfen, inwieweit der BTB Schaden im Vergleich zu Kontrollgruppen. Während bestimmte Reize, wie Behandlung mit Cadmium Chlorid (CdCl2)12, BTB kompromittiert werden kann wird BTB für kleine Moleküle, die schließlich das Adluminal Fach als Indikatoren geben Sie zugänglich.

Ein frühe in Vivo BTB Integrität Assay wird Biotin oder Inulin-FITC in die Halsschlagader, die Chirurgie umfasst, und ist invasiv, kompliziert und zeitaufwändig. Außerdem, wie Reporter Stoffe durch den ganzen Körper über den Blutkreislauf diffundieren, beschränkt sich die lokale Konzentration von Biotin oder Inulin-FITC in seminiferous Röhrchen. Darüber hinaus kann systemische Exposition Immunreaktionen auslösen. Hier präsentieren wir Ihnen einen einfache und effektive in Vivo BTB Integrität Assay ermöglicht direkten Einspritzung von einer kleinen aliquoten Inulin-FITC in das Interstitium ein Hoden. Die fluoreszierenden Kennzeichnung Methode verwenden, ist die Färbung Prozess praktisch, da sekundäre Antikörper nicht erforderlich sind. Hier wird der Prozess der Fluoreszenzfarbstoff Eintritt in den Hoden visualisiert.

Protocol

Alle durchgeführten Tierversuche wurden von der Nanjing Medical University-Ausschuss genehmigt. Männliche C57BL/6 Mäusen wurden unter kontrollierter Photoperiode Bedingungen gehalten und waren mit Nahrung und Wasser versorgt. 1. Vorbereitungen Mikroinjektion Kapillaren Verwenden Sie Mikroinjektion Kapillaren bzw. mit einem Außendurchmesser, innere Dimeter und Länge von 1,0 mm, 0,8 mm und 10,0 cm. Ziehen Sie Glaskapillaren mit einem Kapillar…

Representative Results

Der Versuchsaufbau für die Durchführung der BTB-Integrität-Assay ist in Abbildung 1dargestellt. Ziehen und Mikroinjektion Kapillaren mit einer Kapillare Puller und Mikropipette Beyeler, bzw. zu schärfen (Abb. 1A und 1 C). Der Thermostat Heizung und Ausrüstung für die Mikroinjektion sind in Abbildung 1 b und 1Ddargestellt. <p class="jove_content" fo:keep-tog…

Discussion

Spermatogenese findet in seminiferous Epithel und ist ein hoch geordneten und dynamischen Prozess, die Keimzellen und somatischen Zellen unterliegt (z. B. Sertoli-Zellen)13. Die BTB-Struktur, die durch die Sertoli-Zellen aufgebaut ist, teilt die seminiferous Epithel in eine basale und eine apikale Fach. Die Entwicklung der meiotischen und haploiden Keimzellen erfolgt in der apikalen Fach bildet eine immunologische Barriere14.

Di…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der nationalen Schlüssel R & D Program of China (2016YFA0500902), der National Natural Science Foundation of China (31471228, 31771653), der Jiangsu Science Foundation Distinguished jungen Gelehrten (BK20150047), die Naturwissenschaft unterstützt. Gründung der Provinz Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) und dem innovativen und unternehmerischen Programm der Provinz Jiangsu, K.Z

Materials

Capillary puller  SUTTER INSTRUMENT (USA) P-97
10x PBS Hyclone (USA) SH30258.01 dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma (USA) F6057
Adhesion microscope slides CITOGLAS (China) 80312-3161
Cadmium chloride Sigma (USA) 655198-5G
Confocal microscope Zeiss (Germany) LSM700
Dust-free paper Kimberly-Clark (USA) 34120
Inulin-FITC Sigma (USA) F3272
Microinjection capillaries Zhengtianyi (China) BJ-40 1.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette beveler NARISHIGE (JAPAN) EG-400
OCT SAKURA (JAPAN) 4583
Paraformaldehyde Sigma (USA) P6148
Pentobarbital sodium Merck (Germany) P11011
Shaver  Yashen (China)
Stereo microscope Nikon (JAPAN) SMZ1000
Sucrose  Sangon Biotech (China) A610498
Surgical instruments Stronger (China) scissors, forceps, needle holder
Syringe KDL (China) 20163150518 0.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heater KELL (Nanjing, China) KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M Tris Sangon Biotech (China) A600194
1.37 M Nacl Sangon Biotech (China) A610476

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Cite This Article
Liu, M., Zhu, C., Bai, S., Li, X., Fu, K., Ye, L., Zheng, K. An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity. J. Vis. Exp. (142), e58512, doi:10.3791/58512 (2018).

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