Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere blod-testis barriere integritet ved at indsprøjte inulin-FITC i testiklerne. Dette er en effektiv i vivo metode til at studere blod-testis barriere integritet, der kan være kompromitteret af genetiske og miljømæssige elementer.
Abstract
Spermatogenesen er udvikling af spermatogonia til modne sædceller i testiklerne seminiferous tubules. Denne proces understøttes af Sertoli celler vejkryds på blod-testis barriere (BTB), som er den strammeste væv barriere i selve pattedyr og udskiller seminiferous epitel i to rum, en basal og en adluminal. I BTB skaber en unik mikromiljø for kønsceller i meiose jeg / II og til udvikling af postmeiotiske spermatider til sædceller via spermiogenesis. Her, beskriver vi en pålidelig analyse til at overvåge BTB integritet af musen testiklerne i vivo. En intakt BTB blokerer diffusion af FITC-konjugeret inulin fra de basale til den apikale rum af de seminiferous tubules. Denne teknik egner sig til at studere gen kandidater, vira eller miljømæssige giftstoffer, der kan påvirke BTB funktion eller integritet, med en let procedure og en minimal krav på kirurgiske færdigheder i forhold til alternative metoder.
Introduction
Pattedyr spermatogenesen betragtes som en meget struktureret proces, som omfatter spermatogonial selvfornyelse og differentiering gennem spermatocytes i haploide sædceller via mitose og meiose spermiogenesis, hvorunder dramatiske biokemiske og morfologiske ændringer sker. Udvikle kønsceller transporteres gradvis fra bunden af den seminiferous tubulus mod lumen. Denne proces er reguleret af celle-celle kontakter mellem kimceller og Sertoli celler1,2. Tilstødende Sertoli celler danner den BTB, der ligger i nærheden af bunden af de seminiferous tubuli. I BTB opdeler fysisk epitel i en basal og et adluminal rum. Gennemførelsesstadier VIII - IX af epitel cyklus, overføre preleptotene/leptotene spermatocytes fra de basale rum på tværs af BTB, ind i adluminal rum3. Derfor, BTB funktion er at give en immunoprivileged mikromiljø for færdiggørelsen af meiose og spermiogenesis4,5,6. I modsætning til andre blod-væv barrierer (f.eks, blod - hjerne barrieren), der kun består af stram vejkryds (TJs), er BTB dannet af fire forskellige vejkryds (TJs ektoplasmiske specialer, gap vejkryds og mellemliggende glødetråd-baseret desmosomes) mellem Sertoli celler1,7.
Mange undersøgelser har brugt genmodificerede mus, virusinfektioner og miljømæssige giftstoffer til at undersøge mekanismerne for BTB integritet7,8,9. BTB forstyrrelser inducerer nedsat spermatogenese og subfertilitet eller infertilitet. Da BTB dannelse og integritet er blevet bekræftet at være påvirket af kontakter mellem Sertoli celler8, en in vitro- model baseret på primær kultur af isolerede Sertoli celler har været anvendt til BTB undersøgelse. Denne model kan ikke nøjagtigt efterligne BTB dynamics in vivo. Derudover er ingen sådan fælles kultur af kønsceller med Sertoli celler blevet oprettet som at afspejle alle relevante strukturelle og funktionelle komponenter af BTB10,11.
I almindelighed, er i vivo BTB integritet assays typisk baseret på små molekyler, såsom EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin og FITC-konjugeret inulinsirup (inulin-FITC). Normalt, er diffusion af biotin eller inulin-FITC fra de basale rum blokeret af BTB struktur. Derfor, vi er i stand til at bruge denne metode til at vurdere omfanget af BTB skade sammenlignet med kontrolgruppen. Mens BTB kan blive kompromitteret med visse typer af stimuli, såsom behandling med cadmium chlorid (CdCl2)12, bliver BTB tilgængelige for små molekyler, som i sidste ende kommer ind i adluminal rum som indikatorer.
En tidlig i vivo BTB integritet analyse indebærer injektion af biotin eller inulin-FITC i halsfedt, som indebærer kirurgi, og er invasiv, kompliceret og tidskrævende. Desuden som reporter stoffer diffuse gennem hele kroppen via omsætning, er den lokale koncentration af biotin eller inulin-FITC i seminiferous tubules begrænset. Derudover kan systemisk eksponering fremkalde immun reaktioner. Her præsenterer vi en enkel og effektiv i vivo BTB integritet assay muliggør direkte injektion af en lille alikvot af inulin-FITC i interstitium af en testis. Brug af fluorescerende mærkning metode, er farvning processen praktisk, som sekundære antistoffer ikke er påkrævet. Her er processen med fluorescerende farvestof indtastning testiklerne visualiseret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle udført dyreforsøg er blevet godkendt af udvalgets Nanjing medicinske universitet. Mandlige C57BL/6 mus blev holdt under kontrollerede lysperiode betingelser og blev leveret med mad og vand.
1. præparater
-
Mikroinjektion kapillærer
- Bruge mikroinjektion kapillærer med en ydre diameter, indre dimeter og 1,0 mm, 0,8 mm og 10,0 cm, længde henholdsvis.
- Trække glas kapillærer med en kapillær puller (figur 1A). Teste og justere indstillinger afhængigt af kapillar puller maskinen, der bliver brugt.
- Bryde pipette tips med pincet til at bruge til at hente kapillærer 50 µm diameter på spidsen.
Bemærk: Tips kan være for lang til at trænge ind i testiklerne. - Skærpe aflæsse i en vinkel på 30° ved hjælp af en mikropipette beveler (figur 1 c).
-
Reagenser
- Forberede 1% pentobarbital natrium: Opløs pentobarbital natrium 100 mg i 10 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (trin 2.3.3).
- Forberede 10 mg/mL inulin-FITC: opløses inulin-FITC 1 mg i 100 μL af PBS (trin 2.1.6).
- Forbered 4% PARAFORMALDEHYD: opløses PARAFORMALDEHYD (PFA) 4 g i 100 mL PBS (trin 2.3.3).
- Forberede 30% saccharose: opløses saccharose 3 g i 10 mL PBS (trin 2.3.4).
- Forberede 0,1% cadmium klorid: opløses cadmium chlorid 10 mg i 10 mL PBS (trin 2.1.1).
2. metoder
-
Anæstesi og presurgery forberedelse
- Vejer 8-uge-forhenværende C57BL/6 mandlige mus og beregne den nødvendige dosis af CdCl2. Behandling af en gruppe af mus (n = 3) med CdCl2 (5 mg/kg b.w., i.p.) for 3 d før operationen. Behandler en anden gruppe af 8-uge-forhenværende C57BL/6 mandlige mus (n = 3) med PBS som kontrol.
- Udføre kirurgi under aseptiske forhold ved hjælp af steril sprøjte, nål, saks og pincet.
- Forberede bedøvelse brugsopløsning frisk. Den nødvendige dosis af anæstesi er 70 mg pentobarbital natrium/kg kropsvægt. I gennemsnit, vejer en voksen C57BL/6 mus på 8 uger gammel ~ 25 g, hvilket svarer til 175 μL af 1% pentobarbital natrium (1,75 mg / mus).
Bemærk: Pentobarbital natrium opløses i sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Løsningen er filtreret af 0,22 um filterenhed før de bruges. - Rens området for kirurgi med 75% ethanol og dække området med en ren væv håndklæde.
- Tænd den Termostatiske varmelegeme og justere temperaturen til 37 ° C.
- Forberede inulin-FITC brugsopløsning (10 mg/mL) på dagen for operationen.
-
Kirurgisk procedure
- Vejer 8-uge-forhenværende C57BL/6 mandlige mus og beregne den nødvendige dosis af anæstesi.
- Udføre en intraperitoneal injektion med pentobarbital natrium ved hjælp af 1 mL steril sprøjte. Hold musen i et rent bur.
- Observere øje refleks reaktion og vejrtrækningsmønster af musen til at bekræfte, at det er under fuld bedøvelse.
Bemærk: Normalt 10-15 min nødvendig er, indtil musen er dybt bedøvede, med en total mangel på tå knivspids svar og vedligeholdelse af langsom, støt vejrtrækning. - Flytte musen til området drift og dække sit øje område med en fugtig silkepapir at undgå tørhed under anæstesi (figur 2A).
- Barbere sit abdominal hår med en barbermaskine og desinficere området kirurgi med 75% ethanol.
- Med skarpe saks, lave en 1 cm hud snit over de preputial kirtler til at udsætte den abdominale væg. Løft den abdominale væg med lille pincet og gøre en 0,5-cm indsnit at eksponere bughulen (figur 2B).
- Bruge pincet til at søge efter fedtpuder omkring epididymis og testiklerne. Træk forsigtigt de fedtpuder til at afsløre den vedlagte testis klart (figur 2 c og 2D). Normalt, operere på en testis ad gangen.
Bemærk: Undgå at berøre fedtpuder og testiklerne med hænderne. - Placer en papir (9 cm i diameter) under fedtpuder og testiklerne (figur 2 c).
- Tilføre mikroinjektion pipette inulin-FITC og slutte den til micromanipulator enheden (fig. 1 d). Forsigtigt indsætte mikroinjektion pipette under tunica albuginea og indlæse alt af 20 μL af inulin-FITC i interstitium af testiklerne (figur 2E og 2F).
Bemærk: Trykkes omhyggeligt mikroinjektion pipette for at undgå at flytte den. - Overvåge bevægelse af inulin-FITC i testiklerne (fig. 2 g).
- Straks satte testiklerne tilbage ind i bughulen efter afslutningen af injektion.
- Gentag fremgangsmåden på de kontralaterale testis. Denne testiklerne er injiceret med 20 μL af PBS som en kontrol.
- Lukke huden med en kirurgisk sutur og flytte musen til en varme pude af en termostatisk varmelegeme (figur 1B). Administrere en dosis af 1 mg af smertestillende (buprenorphin) pr 1 kg legemsvægt via subkutan injektion.
-
Høst testiklerne og frosne sektioner forberedelse
- 40 min efter injektionen, aflive den modtagende mus af cervikal dislokation ifølge dyrs pleje og bruge retningslinjer.
- Brug et par skarpe saks til at indsamle testiklerne. Placere testiklerne i 1 mL iskold PBS til at fjerne enhver blod forurening.
- Fix testiklerne i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) ved 4 ° C i 12-24 h. kassere 4% PFA og vask væv 3 x med 1,5 mL 1% PBS ved stuetemperatur.
- Dehydrere væv i 30% saccharose natten over. Sætte testiklerne i rammen indlejring og dække væv med optimal opskæring temperatur sammensatte (OLT). Efter OLT er frosset, fylde indlejring rammen med OCT, således at hele testiklerne kan dækkes med OCT.
- Skær 5 μm tykt, frosne tværsnit af testiklerne i et kryostaten ved-20 ° C og lad dem overholde objektglas.
Bemærk: Genindfrysning indlejrede væv i tøris kan øge stivhed til opskæring.
-
Billede rekvisition
- Placer dias i en fugtig kasse. Varm dias ved stuetemperatur i 10 min.
- Vaske i afsnit 3 x med Tris-bufferet saltvand (TBS) ved stuetemperatur.
- Lufttørre i 5 min. i mørke. Aftørre enhver resterende TBS med støv-fri papir.
- Dække tværsnit med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Sted det inverterede coverslip på et objektglas.
- Erhverve billeder ved hjælp af en Konfokal mikroskop. Ialt 20 X forstørrelse er normalt tilstrækkelig til påvisning af den smukt fluorescerende signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den eksperimentelle set-up til at udføre BTB integritet assay er vist i figur 1. Trække og skærpe mikroinjektion kapillærer med en kapillær aftrækker og mikropipette beveler, henholdsvis (figur 1A og 1 C). Termostatisk varmelegeme og udstyr til mikroinjektion er illustreret i figur 1B og 1 D.
Figur 2 viser nogle af de vigtigste skridt til injektion af inulin-FITC. Brug saks til at gøre en lille snit efter musen har gennemgået en komplet bedøvelse (figur 2A og 2B). Musen testiklerne er udsat og injiceres med fluorescerende farvestof ved hjælp af en mikroinjektion pipette (figur 2 c - 2 G).
Figur 3 viser typiske billeder af en undersøgelse for at vurdere BTB integritet baseret på en i vivo assay. Mus i CdCl2-behandling gruppe er indsprøjtet med en akut dosis af CdCl2 (5 mg/kg b.w., i.p.) i 3 dage. Diffusion af inulin-FITC fra de basale rum er blokeret af BTB struktur i kontrolgruppen, mens BTB konstruktion er ødelagt og inulin (grøn fluorescens) passager i den apikale rum af seminiferous epitel i CdCl2 -behandling gruppe. Hvid linjesegmenter angiver den afstand tilbagelagt af inulin fra basalmembranen (figur 3A). Omfanget af BTB skader er afhængig af afstanden. For en elliptisk lumen er radius gennemsnittet af den korteste og længste afstand fra de basale rum til midten af tubulus. Vi bruger sådant et forhold som et indeks af omfang af skaden, BTB:
Her Dinulinsirup er den afstand, som inulin fra basal rum og DRadius er radius af det samme seminiferous tubulus (figur 3B). Den intakte BTB i Rictorfl / + mus blokerer diffusion af inulinsirup på tværs af barriere til at indtaste den apikale rum. Derimod har Rictorcko mus en kompromitteret BTB tillader inulinsirup diffusion (figur 3 c).
Figur 1: udstyr til musen testikel interstitiel mikroinjektion. (A) træk glas kapillærer med en lodret kapillær puller. ()B) dette panel viser den Termostatiske varmelegeme. (C) tips skærpes ved hjælp af mikropipette beveler. (D) enheden for mikroinjektion omfatter en mikroinjektion pumpe og et stereo mikroskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative billeder af en i vivo testikel interstitiel mikroinjektion procedure i en mus. (A) dette panel viser fjernelse af abdominal hår af en barbermaskine. (B) dette panel viser 0,5 cm bugvæggen snit til at udsætte bughulen. (C) Pull fedt puder til at afsløre den vedlagte testis klart. (D) dette panel viser placeringen af testiklerne og epididymis. (E) dette panel viser placeringen af mikroinjektion pipette. (F) Indsæt mikroinjektion pipette til interstitium i testiklerne. (G) dette panel viser en testiklerne med en vellykket indsprøjtning af interstitium i testiklerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: En undersøgelse for at vurdere BTB integritet baseret på en i vivo funktionelle analyse. Voksne mandlige mus (n = 3 i både behandling og kontrolgruppen) er behandlet med CdCl2 (5 mg/kg b.w., i.p.) i 3 dage (behandling gruppe) eller behandlet med PBS for 3 dage (kontrolgruppen). Inulin-FITC (grøn fluorescens) er i nærheden af bunden af den seminiferous tubulus i kontrolgruppen, mens inulin-FITC indleder en passage på tværs af BTB i gruppen CdCl2-behandling. (A) i dette panel hvid linjesegmenter angiver afstanden inulin-FITC invaderer. Skala barer er 20 μm. (B) Data fra BTB integritet assays er vist i denne histogrammet, som viser den afstand, som inulin (Dinulinsirup) vs radius af den samme tubulus (DRadius). Firs tubuli er tilfældigt udvalgt. P < 0,001 (Student's t-test). (C) BTB integritet er kompromitteret i testiklerne af Rictorcko mus. I Rictorcko mus tubuli trænger inulin dybt inde i seminiferous epitel, nå tubuli lumen. Skala barer er 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spermatogenesen foregår i seminiferous epitel og er en yderst bestilte og dynamisk proces, der styres af kønsceller og somatiske celler (f.eks. Sertoli celler)13. BTB-struktur, der er fremstillet af Sertolicellerne, opdeler seminiferous epitel i en basal og en apikale rum. Udviklingen af meiotiske og haploide kønsceller opstår i den apikale rum, som danner en immunologisk barriere14.
Funktionen BTB kan blive kompromitteret af giftige stoffer eller som følge af defekter i gener involveret i dannelsen af celle vejkryds, fører til mandlig infertilitet. For at undersøge BTB integritet, efterligner en in vitro- Sertoli celle kultur system er blevet etableret, der er i stand til at danne funktionelle epitel der nøje BTB i vivo15. Denne in vitro- system giver en simpel model til at studere den struktur og funktion af Sertoli celler vejkryds. Men Sertolicellerne isoleret fra testiklerne og kulturperler i vitro er begrænset med hensyn til dyrenes alder og celle tæthed15,16. Derudover overvåget renheden af Sertolicellerne og tilstedeværelsen af ultrastructures efterligner BTB funktioner skal være17. Vigtigere, BTB struktur og integritet også kræve interaktioner mellem kimceller og Sertoli celler, som fremgår af undersøgelser af Kim-celle-specifikke null mutant mus med BTB defekter10,18,19. Således, at skabe en fælles kultur af kønsceller med Sertoli celler in vitro for formålet med recapitulating alle afgørende i vivo funktion af BTB forbliver udfordrende11,20.
Denne protokol beskriver en metode til vurdering af BTB integritet i vivo ved at indsprøjte inulin-FITC, som blev ændret fra en procedure ved Chen et al. 21. protokollen beskriver anæstesi af mandlige mus, eksponering af bughulen, mikroinjektion af farvestof i interstitium i testiklerne, høst testiklerne og skære dem i frosne sektioner og erhvervelse af billeder. For en vellykket afslutning, skal flere trin bemærkes. For det første, det er vigtigt at bruge en passende dosis af anæstesi, fordi alvorligt dyb anæstesi kan medføre døden. Også, længden af spidsen af injektion kapillær bør ikke være for lang; ellers, pipetten ikke kan trænge igennem testiklerne.
Den procedure, der er præsenteret her kan udnyttes til at analysere vira, kemiske giftstoffer eller kandidat proteiner involveret i reguleringen af BTB rolle. Denne analyse er følsomme, pålidelige og tilgængelige til at overvåge BTB integritet in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den nationale nøgle R & D Program i Kina (2016YFA0500902), National Natural Science Foundation of China (31471228, 31771653), Jiangsu Science Foundation for fremtrædende unge akademikere (BK20150047), naturvidenskabelige Grundlæggelsen af Jiangsu provinsen (BK20140897, 14KJA180005) og den innovations- og iværksætterevner Program af Jiangsu-provinsen til K.Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
References
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
- Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).
- Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
- Fijak, M., Meinhardt, A.
- O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue? Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
- Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
- Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
- Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
- Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
- Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
- Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
- Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
- Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
- Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis? Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
- Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).
- Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
- Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).
