Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול הקפאה של סעיף רקמת מוח מחיות מרובים כחלופה ייעול עיבוד המוח יחיד. זה מפחית את השתנות מכתימים במהלך אימונוהיסטוכימיה, מפחית את הזמן cryosectioning והדמיה.
Abstract
היסטולוגיה אימונוהיסטוכימיה שיטות שגרתיות של ניתוח כדי להמחיש אנטומיה מיקרוסקופיים, בתרגום חלבונים בתוך רקמה ביולוגית בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. מדעי המוח, כמו גם למגוון רחב של תחומים מדעיים אחרים, טכניקות אלו משמשים. אימונוהיסטוכימיה יכול להיעשות על שקופית רכוב רקמות או מקטעים לתרשים. הכנת דוגמאות רכוב שקופיות הוא תהליך אינטנסיבי זמן. פרוטוקול הבאים עבור טכניקה, קרא את Megabrain, מופחת לוקחים את הזמן כדי cryosection ו הר רקמת המוח על ידי 90% על-ידי שילוב המוחות מרובים לתוך בלוק קפוא יחיד. יתר על כן, טכניקה זו הקטינה השתנות ראיתי בין מכתים סיבובים, במחקר פתולוגיה גדולים. הטכניקה הנוכחי הותאם לשימוש רקמת המוח מכרסמים בניתוחים immunohistochemical במורד הזרם; עם זאת, ניתן להחיל אותה על תחומים מדעיים שונים, להשתמש cryosectioning.
Introduction
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול שיטה, אשר נקרא Megabrain, פותח על מנת cryosection מכרסם מרובים המוח במקביל להליכי immunohistochemical במורד הזרם. Megabrain מאפשר הייצור של שקופיות יחיד המכיל רקמות מחיות מרובים. טכניקה זו מוטבה לחתוך קטעים הילתית ההמיספרות עכברים בוגרים 9, או 5 מבוגרים. המוח מלא, בו זמנית. לכן, הטכניקה ישימה ביותר ללימודי immunohistochemical גדולים או ניתוחים אחרים שנעשה על רקמת המוח רכוב שקופיות מתוך קבוצה גדולה של בעלי חיים.
אימונוהיסטוכימיה כרוכה בשימוש של נוגדנים ספציפיים נגד חלבונים לעניין להבין ולאפיין שלהם ביטוי ושינויים סלולר רקמות ספציפיות1,2,3. השימוש אימונוהיסטוכימיה נפוצה במחקר מדעי המוח, בין דיסציפלינות מדעיות אחרים, מסייע בהבנה תאית ומולקולרית של המוח4. מחקרים רחבי היקף שכללו חיות רבות ומקטעים המוח יכול להיות אינטנסיבי בזמן והן משאבים. ככזה, יש תירוץ רבת מאחורי התפתחות Megabrain: כדי לצמצם את זמן בילה cryosectioning, הרכבה, צביעת רקמות, תוך שימוש כתוצאה מכך ריאגנטים פחות. יתר על כן, היכולת לייעל את התהליך כתם המוח מרובים באותו סיבוב מסייע להקל על חלק של השונות בין מכתים אצוות, מגבלה של אימונוהיסטוכימיה3. בנוסף, חלוקתה של Megabrain היא אלטרנטיבה חיסכון בזמן חלוקתה בודדים המוח מכרסמים קפוא ומאפשר השוואה מהירה של רקמות בין חיות או אפילו קבוצות הטיפול על ידי טכניקות במיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הטכניקה Megabrain מוטבה באמצעות המוח כולו, hemisected זכר בוגר C57Bl6 עכברים5, חולדות ספראג-Dawley לנוער, למבוגרים חולדות ספראג-Dawley שהיו transcardially perfused עם 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עקב 4% paraformaldehyde6. ניתן להשיג תוצאות דומות של זנים אחרים של עכבר, חולדה, משני המינים, בגילאים שונים. המחקר כדי להפיק נתונים עבור כתב יד זה משמש חולדות ספראג-Dawley לנוער, אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת אריזונה ועל שימוש הוועדה, חיות ניסוי היו מטופלים לפי את המדריך עבור טיפול של ואת השימוש של מעבדה בעלי חיים7.
1. Cryoprotection של המוח Perfused
- זלוף הבאים מוצלח transcardial6, לאסוף את המוח מלא6,8 מחיות ותקן פוסט על-ידי הצבת לתוך בקבוקון 25 מ של paraformaldehyde 4% ב- PBS במשך 24 שעות ביממה.
זהירות: Paraformaldehyde היא מקבע רקמות רעילים; . לטפל. העברת paraformaldehyde לתוך מיכל פסולת במיוחד שכותרתו שמזהה את ריכוז ונפח בתוך ברדס fume כימי, בחנות פסולת כימית בארון עד מסולק על ידי כימיקלים או כראוי אימן את כוח האדם. - לאחר 24 שעות חלף, בשכונה fume, הסר את המוח paraformaldehyde 4% בעזרת מרית. להעביר את המוח לתוך בקבוקון של 20 מ של 15% סוכרוז פתרון 1 x באגירה טריס מלוחים (TBS) עד המוח שוקע לתחתית המבחנה (כ- 24 שעות).
- בעקבות זאת, להעביר את המוח בקבוקון של 20 מ של 30% סוכרוז פתרון 1 x TBS, עד המוח שוקע לתחתית המבחנה (כ 24-48 שעות).
2. המוח לקפוא
- במקום גביע זכוכית 500 מ"ל על מצע קרח יבש ב דלי קרח. שופכים 300 – 400 מ של איזופנטאן (2 מתיל-בוטאן) לתוך כוס זכוכית.
- לאפשר את הטמפרטורה של איזופנטאן להגיע בין-45 ° C ל-50 מעלות צלזיוס. מקרוב לפקח ולשמור על טווח טמפרטורות הזה עם מד חום, נשאר קבוע לאורך כל ההליך. ודא כי הטמפרטורה נלקחים מהאמצע של הפתרון, לא תוך נגיעה לתחתית או לצד של כשהספל.
- -Benchtop, למלא חד פעמי הטבעה עובש (ראה רשימה) כ- 1/2 מלא של האופטימלית חיתוך טמפרטורה (אוקטובר; ראה טבלה של חומרים) מורכבים. ודא כי ישנם אין בועות אוויר ב- OCT. אם יש בועות אוויר להסיר אותם עם מרית או מחט.
-
הסר את המוח הראשון הבקבוקון של 30% סוכרוז עם מרית. בשלב זה, או להקפיא את המוח כולו או hemisect, בהתאם לעיצוב המחקר.
- Hemisected מוח, להשתמש סכין גילוח חדש לעשות חתך נקי דרך רקמות כדי להפריד את ההמיספרות. אם לא נדרש לצורך המחקר, הסר את המוח ואת הריח נורות בשלב זה. אם המוח הקטן נחוצה לצורך המחקר, הוא הציע לחתוך אזור שטוח בקצה האחורי של המוח, כדי לסייע המוח עומד ישר על העובש. אם המחקר דורש רק רקמה מאזור המותאמות לשפות אחרות, מטריצה מכרסמים המוח יכול לשמש כדי לחסום את המוח על סמך הציון הידועה.
- תן את המוח כערך מספרי שמות המערכת. צייר דיאגרמה כמוצג באיור1. לכתוב את המספר של המוח הראשון שהוצב כייר Megabrain בעמדה 2, עוזב את עמדה 1 כרווח כדי לסייע בזיהוי מהיר של הכיוון שבו המוח היו קפואים.
- בעזרת מלקחיים בוטה או פינצטה, לאסוף את המוח כדי להציב בעמדה 1. אוריינט המוח עם הצד לחתוך את הראשון כלפי מעלה. . תוריד את המוח לתוך OCT מיקום המתאים, באמצעות את הפינצטה כדי לכוונן את המיקום שלה עד שהוא מייצג באופן עצמאי.
- חזור על שלבים 2.3-2.5 עבור המוח/ההמיספרות הנותרים יוקפא בעמדות 3 – 10. להימנע מיקום המוח/ההמיספרות בפריסה אוסטרית.
- סקור כל המוח 9 ב כייר Megabrain. ברגע השכל עומדים באופן עצמאי, זקוף, מכוון כהלכה ב- OCT (כפי שמוצג באיור 2B), להוסיף עוד OCT העובש (עד מכוסים העליון של המוח). . שוב, להבטיח כי אין בועות אוויר גלוי ב- OCT.
- השתמש המלקחיים להחזיק את הפינה של העובש, הבטחת שהמלקחיים לא להיות חלקית שקוע ב- OCT (איור 3 א). נזהר לשמור על רמת עובש, להוריד את התבנית לתוך איזופנטאן (-45 ° C ל-50 ° C) כך התחתון השלישי של העובש שקוע. . תעצרו כאן כדי לאפשר בועות ב- OCT כדי לעלות אל פני השטח מן הרקמה (איור 3B)
- לאחר 30 s, התחתון התבנית כולה לתוך איזופנטאן ואת שחרור המלקחיים, עוזב את Megabrain מתחת למים למשך לפחות 3 דקות (איור 3C). להבטיח שעובש נשמרת רמה, אז המוח תישאר זקוף, קו מקביל (דמות תלת-ממד).
- אחרי 3 דק ', שימוש המלקחיים כדי להסיר את התבנית המכילה את הקפוא, OCT מוטבע המוח (איור 3E) מ איזופנטאן.
- . מיד, לעטוף את התבנית והתוכן שלה בנייר אלומיניום עם מדבקה עם מספרים בעלי חיים או זיהוי Megabrain. מגע של Megabrain קפוא בצמצום ככל האפשר כדי להימנע מפשיר את הרקמה.
- Megabrain זה יכול להיות עכשיו הועבר מקפיא-20 ° C, מאוחסנים למשך תקופה מינימלית של 24 שעות.
הערה: פרוטוקול אפשר לעצור כאן, Megabrain ניתן לאחסן קפוא עד cryosectioning מתקיים.
3. הכנת Megabrain את חלוקתה על Cryostat
- הגדר את הטמפרטורה הקבינט של cryostat-19 מעלות צלזיוס. ודא שאת החום הגיע לפני שתמשיך. ברחבי חלוקתה, להבטיח כי הטמפרטורה ארון נשאר בין-18 ° C ו-20 ° C.
- . קח את Megabrain מהמקפיא-20 ° C ולמקם אותו לתוך cryostat. כמו כן, למקם של צ'אק של הממדים בגודל המתאים, ואת שני מכחולים משופעת דק cryostat. השאירו cryostat למשך 15 דקות לפחות לבוא עד הטמפרטורה של cryostat גם את Megabrain וגם את הצ'אק.
- בהתאם תווית שקופיות עם מספר מזהה של Megabrain, מספר השקופית. שכב שקופיות אלה על שקופית חמים (35 – 45 ° C).
- לפתוח את Megabrain של האלומיניום. השימוש סכין גילוח לחתוך פינות התבנית כדי לאפשר הסרה קלה של גוש של OCT מתוך העובש (איור 4A) אנכית.
- לוותר על שכבה דקה (בערך בעובי 3 מ מ) של OCT על גבי הצ'אק.
- מהר, עם קשר מינימלי בין האצבעות OCT, מניחים את Megabrain על הצ'אק, בכיוון הרצוי. מלקחיים גדול יכול לשמש גם עבור שלב זה כדי למזער את מפשיר. לפני הפעלת סעיף, לעזוב את Megabrain רכוב צ'אק ב cryostat למשך 15-20 דקות לאפשר ב- OCT כדי להקפיא לחלוטין.
- כאשר שכבת הבסיס של OCT קפוא, למרוח שכבה בעובי 2 מ מ OCT בצדדים של Megabrain ולאפשר זה לדרוס הצדדים על גבי הצ'אק. פעולה זו מסייעת להבטיח את Megabrain לצ'אק... שוב, לפני שתמשיך, להשאיר את צ'אק Megabrain רכוב ב cryostat למשך 15-20 דקות לאפשר ב- OCT כדי להקפיא.
- השתמש סכין גילוח כדי להסיר OCT עודף מכל הצדדים או בתחתית הצ'אק (איור 4B).
4. Cryosectioning Megabrain
- לפני שתתחיל, ודא גביע המכיל לפחות 20 מ ל 1 x PBS נגישה.
- מקם את הצ'אק, רכוב עם Megabrain, אל ראשו של צ'אק-cryostat (איור 4B).
- הגדר את cryostat לחתוך על העובי הרצוי. המתודולוגיה הנוכחי כבר מותאם ל- 10 מיקרומטר 50 מיקרומטר למקטעים.
- לקצץ OCT ורקמות לפי הצורך כדי להגיע אל האזור במוח הרצוי עבור אוסף רקמה (איור 4C).
- כאשר אתה מוכן לאסוף את רקמות, הורידו את הצלחת גליל נגד עד שתוצב על הבמה ולהפוך את ידית cryostat לקחת קטע בודד. הרם לאט מהצלחת אנטי-רול, להיות זהיר כי Megabrain משרטוטי לא מחובר לצלחת אנטי-רול, לא ליפול על הבמה דמות 4D).
- השתמש בעדינות את מכחולים כדי לבטל את הסיכום המקטע Megabrain עד הוא שוכב שטוח על הבמה cryostat (איור 5A). (אם יש צורך, להחזיק את ה-OCT שטוח באמצעות מכחולים כדי למנוע גלגול).
- הסר שקופיות משקופית החמים ותציב את השקופית, לצד תווית למטה, מעל המקטע Megabrain על הבמה ומאפשר את המקטע לדבוק השקופית.
- להחיל טיפה של PBS 1 x על כל סעיף הרקמה בשקופית ובמהירות אל תאפשר אלה להתייבש. עד שהם יש כבר מוברש שטוח (ראה שלב 4.9).
- השתמש בסדר משופעת במכחול טבול 1 x PBS לצחצח את בועות בתוך הרקמה, נפרשים הרקמה אז הוא שוכב שטוח על השקופית (איור 5B). לטפל לא כדי לשנות את המיקום של הסעיפים המוח, ובכך לאבד את המיקום היחסי על המקטעים רקמות אחרות. לתפעל את הרקמות בזהירות כדי להימנע דמעות. לשמור חלקים במוח הרחק לקצוות השקופית, כמו שטח היקפי נדרש עבור coverslip ו- PAP היישום עט בפרוטוקולים מסוימים מוכתמים.
- מקם את השקופית חזרה אל השקופית חם ויבש במשך 45 דקות הכיסוי לפי הצורך כדי למנוע אבק ליישב על הרקמה. לאחר יבש, אחסן את השקופיות ב-80 מעלות צלזיוס עד שימוש נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאה חיובית סיום הליך זה הוא רקמה שנמצאת על השקופית, ללא בועות או דמעות, הכיוון שבו הם קפאו. מקטעי רקמת רווח אחיד בנפרד, קל לזיהוי בשל מיקום טוב של המוח ב- OCT ואת בסימון טוב כפי שהוכח באיור1. בהנחה רקמת המוח נאסף מבעלי חיים בגיל דומה, וכי הרקמה היה מיושר כראוי ב- OCT, סעיפים שנאספו בשקופית אמור לייצג מטוס הילתית דומה, המאפשר השוואה של אזורים במוח בין בעלי חיים. ובלבד הרקמה קפוא, עם החפץ ההקפאה מינימלי, צביעת המטוקסילין -אאוזין יכול להתבצע כדי להעריך את איכות cryoprotection9. אימונוהיסטוכימיה יכול להתבצע כפי שמתואר עם ההכתמה באיור איור 6.
איור 1: תרשים נציג של פריסת Megabrain הציע. זה מראה הסימון עמדה של רקמות נגזר 9 בעלי חיים שונים. המערכת מספר מתוכננת כפי שמתואר; עם זאת, כל מערכת מספור עשוי לשמש. 'X' הינה נציגה של השטח הריק שנועדו בבירור את הכיוון שבו הוקפא הרקמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: שגויה ולא נכונה מוצבים המוח עובש. (א) המוח האונות לקוי מיושר ב אוקטובר מן העליון בצד. (B) מיושר היטב המוח האונות ב אוקטובר מן העליון בצד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שלבים של המוח קפוא. Megabrain (א) לפני במי איזופנטאן-45 ° C. Megabrain (B) כאשר שקועים איזופנטאן. (ג) Megabrain לגמרי שקועים איזופנטאן. (ד) Megabrain מורד את איזופנטאן, הממחיש את המוח צריך להישאר זקוף, קו מקביל אחד מהשני בתהליך זה. (E) Megabrain A קפוא בתוך תבנית להטבעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מפתח שלבים חיתוך Megabrain. Megabrain (א) המוסרת מלהטביע עובש ב- cryostat. צ'אק (B) רכוב עם Megabrain. (ג) חיתוך Megabrain. Megabrain (ד) בסעיף על הבמה cryostat. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: מראש וכן שלאחר הנטען בסעיף Megabrain. Megabrain קפוא (א) סעיף (40 מיקרומטר) על הבמה cryostat. (B) שקופיות זכוכית רכוב עם רקמות Megabrain. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: אימונוהיסטוכימיה של שקופית Megabrain מוכתם Iba1. (א) רקמה שנלקחו Megbrain מראה אחיד מכתים בין מוחות שונים במחקר. (B) 20 x מיקרוסקופיים תמונות שנלקחו אזור קליפת המגע חבית שדה (S1BF) כל המוח הנטען, מראה עקבי מיונן מולקולה סידן מחייב מתאם 1 (Iba1) כתמים מיקרוגלייה בין המוח. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה יש לקחת בחשבון במהלך הליך זה כי הטמפרטורה של Megabrain וסביבתו חייב להיות פיקוח מתמיד כדי למנוע מפשיר, הקפאה מחדש של הרקמה. המוח ניתן להסיר מהמקפיא-20 ° C עד כדי 3 פעמים כמו בכל פעם. אל תיגע, ב cryostat, עם תנודות טמפרטורה חמה יותר, הרקמה מפשירה על ימין ועל שמאל refreezes, גורם ריבה כמו מרקם של רקמה נורמלית שלמות10. לכן אופטימלית לחתוך את Megabrain בבת אחת.
קיבוע הרקמה cryoprotection חלקים מרכזיים של פרוטוקול זה כדי למזער את היווצרות גביש קרח, להקטין צמיחת חיידקים חיצוני להפסיק תגובות אנזימטיות, ובכך שמירה על תקינות רקמת10בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. אם המוח אינם cryoprotected עם סוכרוז, ואז מים בתוך רקמת שיכולים להיווצר גבישי קרח במהלך תהליך ההקפאה, אשר לגרוס את הרקמות ולגרום חורים לטופס. בעוד אנו מציעים דילולים טורי של סוכרוז ב- TBS, ניתן למקם את המוח ישירות ב- 30% סוכרוז לתקופה ממושכת (48-72 שעות) להשיג cryoprotection דומה. עם זאת, מומלץ כי הפתרונות סוכרוז עשויים עם TBS. וריאציות כגון השימוש של PBS או מים תגרום cryoprotection המסכן של Megabrain ושל איכות רקמת המסכן. Haematoxylin ו Eosin כתם (H & E) יכול לשמש כדי להעריך את איכות של cryoprotection, הקפאת הסוגר החפץ11. איכות רקמת טוב (עם חורים מינימלי) חיוני בלימודי היסטולוגית כמו החורים יכול לשבש את הכריכה של נוגדנים, כמו גם להפחית את תקינות רקמת תאים עם תהליכים בסדר, אשר יכולים להשפיע על הניתוח כמה כתמים. להימנע מיקום סימטרית של המוח, כמו זה יכול לגרום לבלבול בעת ניסיון לזהות את החיה אשר ממנו הושג כל המוח.
הטכניקה הנוכחי הותאם עבור מקטעים הילתית; עם זאת, זה בקלות ניתן להתאים לחתוך קטעים הסאגיטלי ואת רוחבי. לבצע שינויים אלה חיתוך ידרוש המתאים וריאציה של המוח ההשמה בשלבים 2.5 דרך 2.7. יצוין, כי adaptions אלה עשויה להפחית את המספר של המוח שיכול להיכנס אחד להטבעה.
שינוי המפתח של טכניקה זו היא השטח הריק בעמדה מס ' 1 (כפי שמוצג באיור1). שטח זה נועד לאפשר זיהוי קל כיוון Megabrain וזהה ולכן החיה המשויכים כל המוח.
טכניקה זו שונתה כדי לאפשר רקמה מתוך מספר גדול יותר של בעלי חיים כדי להיות קפוא, גזור בו זמנית Megabrain. בגודל מכרסם במוח ולכן תלוי מין, גיל, מין; המספר של המוחות להשתלב העובש יכול להשתנות. לא מומלץ הפרדת הגילים, המינים או קבוצות טיפול לתוך Megabrains נפרדים. למרות זאת יכול להבטיח אחידות גודל, זה עלול גם להגדיל דעה קדומה או הסובייקטיביות במהלך דימות וניתוח. בנוסף, יש סטיה הבלתי נמנע בין שקופיות במהלך אימונוהיסטוכימיה בפרוטוקול כלשהו, אשר יכול להוביל מכתימים חוסר עקביות בין קבוצות הגיל/המין.
צ'אק מלבני, גדול שימש, במקום אחד עגול, אשר סיפק תמיכה מוגברת מאחור Megabrain.
את התבנית והתוכן שלה היו של נפח גדול יותר מזה של מוח מיוחד במינו עובש OCT, יותר זמן נדרש כדי להקפיא את המוח ב איזופנטאן. באמצעות ניסוי וטעייה, נקבע את משך הזמן שסיפקו איכות טובה להקפיא (3.5 דקות). Megabrain ניתן להשאיר את איזופנטאן יותר; עם זאת, הטמפרטורה חייב להישאר בטווח של-45 ° C עד-50 ° C כדי למנוע סדיקה OCT.
ישנם הרבה חתיכות רקמה על השקופית Megabrain נפרדים, זה אפשרי כי רקמות יכול להתייבש, כתוצאה מכך הופכות פריכות יותר במהלך השלבים צחצוח. כדי להתמודד עם בעיה זו, צריך לשים טיפה של PBS על כל מקטע המוח בודדים כדי לשמור את זה לח, עד זה הינו מוברש החוצה.
הטכניקה של hemisecting המוח, עבור מחקר שבו פעולה זו נדרשת, חיוני להשגת תוצאות טובות. מתי hemisecting המוח, זה חשוב כי זה חוצה זווית נעשה בדיוק כדי להבטיח שכל המוח אזורים שלמים עם הכדור הנכון. אם המוח הקטן או הריח נורות אינן רלוונטיות למחקר, שניתן להסירם. הסרת רקמה 'עודף' זו מפחיתה את כמות רקמת יהיה צורך ייחתך בעת cryosectioning. הסרת המוח הקטן מאפשר את המוח לעמוד. בקלות רבה יותר ב- OCT לפני ההקפאה.
בזמן להיות מוברש החוצה, לשמור על הסעיפים רקמות מהקצה של השקופית. דבר זה מאפשר חדר עבור קו של PAP עט, מחסום הידרופוביות, להקיף את הרקמה, המהווה דרישה של פרוטוקולים אימונוהיסטוכימיה מסוימים. בנוסף, נדרש שטח עבור coverslip.
אם המוח/חצי הכדור נופל או מטה במהלך Megabrain קפוא, ואז הסעיפים לא יהיה שותף פלנר. תוצאה דומה יכול לגרום אם מח אחד גדול יותר, האחרים Megabrain יחיד. כדי להתגבר על זה, ניתן לבחור עוד שקופיות כתם איפה brain(s) המדובר על האזור המתאים עניין.
מגבלה אחת של טכניקה זו היא כל הרקמה מוקפא בבלוק אחד של אוקטובר; אם יש שגיאה טכנית, כגון רעה להקפיא בשל הטמפרטורה שגוי, ולאחר מכן הרקמה מחיות מרובים יהיה מושפע (5-9, בעלי מוחות במקום רק 1). זה יותר בעיה בעת שימוש מלא המוח ואת לא hemisected מקטעים, כיוון הכדור הנותר ניתן קפוא, למחלקה ביחידים כדי להשיג את המקטעים הרצויים.
מגבלה נוספת לשיטה זו היא כי בעת כוונון של cryostat לחתוך את Megabrain, גישה מיטבית יש לנקוט. זאת בשל כל המוח להיות בזווית שונה במקצת אחד למשנהו, ואילו זה לא מהווה בעיה כאשר חלוקתה מוח קפוא ומיוחדים. ניתן למזער את ההשפעות של זה במהלך קפוא על-ידי הבטחת המוחות זקוף ובמצב בגודל דומה.
אחד היתרונות הגדולים של שימוש בטכניקה זו על הקפאת מוח נדמו היא כי זה מקצר את הזמן הכולל בילה קפוא והמוח חיתוך על ידי עד 90%, אם 9 נקטעים בקצב כמו המוח 1. היתרון המפתח השני של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת מספר קטן יותר של שקופיות מכילות רקמת מהחיות הנדרש כדי להיות מוכתם. זה מגדיל את אמינות ואחידות של נוגדן, מאז כל השקופיות מוכתמים בסיבוב אותו. יכול להיות חוסר עקביות בין שקופיות צבעונית באותו זמן, אך Megabrain יכול לאפשר מספר מחקר המוח להיות מיוצג על שקופית בודדת, ובכך להפחית את השתנות והגברת את תוקפו של הניתוח. לאחר צביעת עקבית הוא יתרון מפתח בכל מחקר היסטולוגית, על החשיבות של השימוש בטכניקה זו. לבסוף, שקופיות פחות כרוכות גם עלויות האספקה נמוכות יותר.
טכניקה זו יכולה להיות שונה בקלות על חיתוך חלקים הסאגיטלי מוח מכרסמים. זה גם יכול להיות מותאם לשימוש cryosectioning הרקמה של מודלים בבעלי חיים שונים וסוגים שונים של רקמות, כגון דגימות שריר או הכבד. Adaptions בפרוטוקול חייב להתבצע, כולל אופטימיזציה של כמות פתרונות בשימוש, בגודל של cryostat הלהב/הבמה, ונפח להטבעה.
טכניקה זו יכול גם להיות מותאם טכניקות לתרשים, שבו הפרוטוקול יישאר על כנו עד שלב 4.6. בשלב זה, המוח צריך להיות מופרדים, הרים לתוך צלחת נפרדת בארות כדי להיות מוכתם. טיפול נוסף היה צריך להילקח לבלבל את פרוסות המוח בתהליך המיון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אין גילויים.
Acknowledgments
PCH המשימה תמיכה קרנות תמיכה המחקר דיווח בכתב היד. המחברים רוצה להודות דניאל גריפיתס לקחת את התמונות בשימוש הדמויות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) - white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology? Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).
- Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
- Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).
