Summary
यहाँ, हम एक timesaving एक दिमाग प्रसंस्करण के लिए विकल्प के रूप में कई जानवरों से फ्रीज और अनुभाग मस्तिष्क ऊतक के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद. यह immunohistochemistry के दौरान धुंधला परिवर्तनशीलता कम कर देता है और समय cryosectioning और इमेजिंग कम कर देता है ।
Abstract
प्रोटोकॉल और immunohistochemistry सूक्ष्म शरीर रचना और जैविक ऊतक के भीतर स्थानीयकरण प्रोटीन कल्पना करने के लिए विश्लेषण के नियमित तरीके हैं । तंत्रिका विज्ञान में, साथ ही अंय वैज्ञानिक क्षेत्रों के ढेर सारे, इन तकनीकों का इस्तेमाल कर रहे हैं । Immunohistochemistry स्लाइड घुड़सवार ऊतक या मुक्त अस्थायी वर्गों पर किया जा सकता है । स्लाइड-माउंटेड नमूनों को तैयार करना एक समय गहन प्रक्रिया है । एक तकनीक के लिए निंनलिखित प्रोटोकॉल, Megabrain कहा जाता है, cryosection और माउंट मस्तिष्क ऊतक के लिए लिया समय कम से ९०% तक एक जमे हुए ब्लॉक में कई दिमाग के संयोजन से । इसके अलावा, इस तकनीक को धुंधला दौर के बीच देखा परिवर्तनशीलता कम, एक बड़े histochemical अध्ययन में । वर्तमान तकनीक बहाव immunohistochemical विश्लेषण में कुतर मस्तिष्क ऊतक का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया गया है; हालांकि, यह विभिंन वैज्ञानिक क्षेत्रों है कि cryosectioning का उपयोग करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
यहां, हम एक उपंयास विधि है, जो हम Megabrain कॉल के लिए प्रोटोकॉल वर्तमान, बहाव immunohistochemical प्रक्रियाओं के लिए एक साथ कई कुतर दिमाग cryosection विकसित । एक Megabrain कई जानवरों से ऊतक युक्त एकल स्लाइड के उत्पादन के लिए अनुमति देता है. इस तकनीक को 9 वयस्क चूहे गोलार्द्धों, या 5 वयस्क पूर्ण दिमाग से राज्याभिषेक वर्गों में कटौती करने के लिए अनुकूलित किया गया है, एक साथ । इसलिए, तकनीक जानवरों के एक बड़े पलटन से स्लाइड पर घुड़सवार मस्तिष्क ऊतक पर किया बड़े immunohistochemical अध्ययन या अन्य विश्लेषण में सबसे अधिक लागू है ।
Immunohistochemistry विशिष्ट एंटीबॉडी के हित के प्रोटीन के खिलाफ निर्देश को समझते है और विशिष्ट ऊतक1,2,3में उनकी अभिव्यक्ति और सेलुलर परिवर्तन विशेषताएं के उपयोग शामिल है । immunohistochemistry का उपयोग तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में प्रचलित है, अंय वैज्ञानिक विषयों के बीच, सेलुलर और4मस्तिष्क की आणविक समझ में सहायता । बड़े पैमाने पर कई जानवरों और मस्तिष्क वर्गों को शामिल अध्ययन संसाधन और गहन समय दोनों हो सकता है । इस तरह के रूप में, वहां Megabrain के विकास के पीछे एक बहुमुखी तर्क है: समय को कम cryosectioning खर्च, बढ़ते, और धुंधला ऊतक, जबकि फलस्वरूप कम एजेंट का उपयोग कर । इसके अलावा, इस प्रक्रिया को कारगर बनाने की क्षमता और एक ही दौर में कई दिमाग दाग को धुंधला बैचों,3immunohistochemistry की एक सीमा के बीच परिवर्तनशीलता के कुछ कम करने में मदद करता है । इसके अलावा, एक Megabrain खोदी एक समय व्यक्तिगत जमे हुए कुतर दिमाग अनुभाग के लिए विकल्प की बचत है और सूक्ष्म तकनीकों द्वारा पशुओं या यहां तक कि उपचार समूहों के बीच ऊतक की तेजी से तुलना के लिए अनुमति देता है ।
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Protocol
Megabrain तकनीक पुरुष वयस्क C57Bl6 चूहों5, किशोर Sprague-Dawley चूहों से पूरे और hemisected दिमाग का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है, और वयस्क Sprague-Dawley चूहों कि 1x फॉस्फेट के साथ transcardially perfused थे बफर खारा (पंजाब) ने इसके बाद बाय 4% paraformaldehyde6. इसी तरह के परिणाम माउस और चूहे के अंय उपभेदों में पूरा किया जा सकता है, दोनों लिंगों में और विभिंन उंर में । अध्ययन इस पांडुलिपि के लिए डेटा उत्पंन किशोर Sprague-Dawley चूहों का इस्तेमाल किया और एरिजोना संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था, और प्रायोगिक जानवरों की देखभाल और प्रयोगशाला के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार परवाह थे पशु7.
1. Perfused दिमाग का Cryoprotection
- सफल transcardial छिड़काव6के बाद, 24 घंटे के लिए पंजाब में 4% paraformaldehyde की एक 25 मिलीलीटर की शीशी में रखने से पूर्ण मस्तिष्क6,8 जानवरों और पोस्ट-फिक्स से इकट्ठा ।
चेतावनी: Paraformaldehyde एक विषाक्त ऊतक निर्धारण है; देखभाल के साथ संभाल । एक विशेष रूप से लेबल अपशिष्ट कंटेनर कि एक रासायनिक धुएं हुड के अंदर अपनी एकाग्रता और मात्रा की पहचान करता है और फिर रासायनिक अपशिष्ट कैबिनेट में स्टोर जब तक रासायनिक सुरक्षा या ठीक से प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा निपटारा में paraformaldehyde स्थानांतरण । - के बाद 24 ज बीता है, एक धुएं डाकू में, 4% paraformaldehyde से दिमाग को हटाने के एक रंग का उपयोग कर । (लगभग 24 ज) शीशी के नीचे करने के लिए मस्तिष्क डूब जब तक 1x Tris-बफर खारा (टीबीएस) में 15% सुक्रोज समाधान के लगभग 20 मिलीलीटर की एक शीशी में मस्तिष्क स्थानांतरण ।
- इस के बाद, मस्तिष्क एक शीशी में 30% सुक्रोज समाधान के लगभग 20 मिलीलीटर का हस्तांतरण 1x टीबीएस में, जब तक मस्तिष्क की शीशी के नीचे करने के लिए डूब (लगभग 24-48 एच) ।
2. ब्रेन फ्रीज
- एक बर्फ की बाल्टी में सूखी बर्फ के एक बिस्तर पर एक ५०० मिलीलीटर ग्लास चोंच रखें । कांच के चोंच में 300-400 मिलीलीटर isopentane (2 मिथाइल-ब्यूटेन) डाल दें ।
- isopentane के तापमान-४५ ° c और-५० ° c के बीच तक पहुँचने के लिए अनुमति दें । बारीकी से निगरानी और एक थर्मामीटर के साथ इस तापमान रेंज बनाए रखने, यह प्रक्रिया भर में लगातार रखते हुए । सुनिश्चित करें कि तापमान रीडिंग समाधान के बीच से लिया जाता है, और नहीं जबकि नीचे या चोंच के पक्ष को छूने ।
- benchtop पर, एक डिस्पोजेबल embedding मोल्ड भरें (सामग्री की सूची देखें) लगभग 1/2 इष्टतम काटने तापमान से भरा (OCT; सामग्री की तालिकादेखें) यौगिक । सुनिश्चित करें कि अक्टूबर में कोई हवाई बुलबुले हैं । किसी भी हवा के बुलबुले उन्हें एक रंग या सुई के साथ हटा रहे हैं ।
-
एक रंग के साथ 30% सुक्रोज की शीशी से पहले मस्तिष्क निकालें । इस बिंदु पर, या तो दिमाग पूरे या hemisect, अध्ययन डिजाइन के आधार पर फ्रीज ।
- hemisected दिमाग के लिए, एक नया उस्तरा ब्लेड का उपयोग करने के लिए ऊतक के माध्यम से एक साफ कटौती करने के लिए गोलार्द्धों अलग । यदि अध्ययन के लिए आवश्यक नहीं है, तो इस स्तर पर सेरिबैलम और घ्राण बल्ब निकालें । यदि सेरिबैलम अध्ययन के लिए आवश्यक है, यह मस्तिष्क के पीछे अंत में एक फ्लैट क्षेत्र में कटौती करने के लिए सीधे मोल्ड में खड़े मस्तिष्क सहायता का सुझाव दिया है । यदि अध्ययन केवल एक स्थानीयकृत क्षेत्र से ऊतक की आवश्यकता है, एक मूषक मस्तिष्क मैट्रिक्स ज्ञात निर्देशांक के आधार पर मस्तिष्क ब्लॉक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता.
- दिमाग एक संख्यात्मक नामकरण प्रणाली दे । चित्र 1में दिखाए गए अनुसार आरेख आरेखित करना । पहले मस्तिष्क की संख्या लिखें 2 स्थिति में Megabrain मोल्ड में रखा जा करने के लिए, एक रिक्त स्थान के रूप में उन्मुखीकरण में दिमाग जमे हुए थे की त्वरित पहचान में सहायता करने के लिए स्थिति 1 जा.
- कुंद संदंश या चिमटी का उपयोग करना, मस्तिष्क लेने के लिए स्थिति 1 में रखा जाएगा । पक्ष के साथ मस्तिष्क ओरिएंट पहले ऊपर की ओर का सामना करना पड़ कटौती हो । उचित स्थान में OCT में मस्तिष्क को कम, चिमटी का उपयोग करने के लिए अपनी स्थिति को समायोजित जब तक यह स्वतंत्र रूप से खड़ा है ।
- दोहराएं कदम 2.3 – 2.5 शेष दिमाग/गोलार्द्धों पदों में जमे हुए करने के लिए 3 – 10 । एक सममित लेआउट में स्थिति दिमाग/गोलार्द्धों से बचें ।
- समीक्षा Megabrain मोल्ड में सभी 9 दिमाग । एक बार दिमाग स्वतंत्र रूप से खड़े हैं, ईमानदार, और सही ढंग से oct में उंमुख (जैसा कि चित्र बीमें दिखाया गया है), मोल्ड करने के लिए और अधिक OCT जोड़ने (जब तक दिमाग के ऊपर कवर कर रहे हैं) । फिर, सुनिश्चित करें कि OCT में कोई दिखाई हवा बुलबुले हैं ।
- संदंश का उपयोग करने के लिए मोल्ड के कोने पकड़, संदंश को सुनिश्चित करने के आंशिक रूप से अक्टूबर में जलमग्न नहीं हो (3 एआंकड़ा) । मोल्ड स्तर रखने के लिए सावधान किया जा रहा है, isopentane में मोल्ड कम (-४५ ° c करने के लिए-50 ° c) ताकि मोल्ड के नीचे तीसरे जलमग्न है । इसे यहां पकड़ो अक्टूबर में किसी भी बुलबुले की अनुमति के लिए सतह को जंम और दूर ऊतक (चित्र बी) से ।
- 30 एस के बाद, isopentane और संदंश से रिलीज में पूरे सांचे में ढालना कम, Megabrain छोड़ने के लिए ंयूनतम 3 मिनट (आंकड़ा 3सी) के लिए जलमग्न । सुनिश्चित करें कि मोल्ड स्तर रखा है, तो दिमाग ईमानदार और equidistant (चित्रा 3 डी) रहते हैं ।
- 3 मिनट के बाद, isopentane से जमे हुए, OCT एंबेडेड दिमाग (चित्रा 3E) युक्त मोल्ड को दूर करने के लिए संदंश का उपयोग करें ।
- तुरंत, एल्यूमीनियम पंनी में ढालना और इसकी सामग्री लपेटो और पशु संख्या या Megabrain पहचान के साथ लेबल । जमे हुए Megabrain को संयम से स्पर्श करें ताकि ऊतक गल जाने से बच सके ।
- इस Megabrain अब एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित किया जा सकता है और 24 घंटे की एक ंयूनतम के लिए संग्रहीत ।
नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है और cryosectioning जगह लेता है जब तक Megabrain जम संग्रहीत किया जा सकता है.
3. Cryostat पर धारा लगाने के लिए Megabrain की तैयारी
- cryostat के लिए-19 डिग्री सेल्सियस के कैबिनेट तापमान सेट करें । सुनिश्चित करें कि यह तापमान जारी रखने से पहले पहुंच गया है । पूरे अनुभाग में, यह सुनिश्चित करें कि कैबिनेट तापमान-18 डिग्री सेल्सियस और-20 डिग्री सेल्सियस के बीच रहता है ।
- -20 ° c फ्रीजर से Megabrain ले लो और यह cryostat में जगह है । इसके अलावा, उपयुक्त आकार आयामों के एक चक जगह है, और दो पतली cryostat में इत्तला दे दी तूलिका । cryostat में Megabrain और चक दोनों को छोड़ दें ताकि cryostat के तापमान पर आने के लिए कम से 15 मिनट का समय निकल जाए ।
- Megabrain पहचान संख्या और स्लाइड संख्या के साथ उचित रूप से स्लाइड लेबल करें । एक स्लाइड गर्म (35-45 डिग्री सेल्सियस) पर इन स्लाइड रखना ।
- एल्यूमीनियम पंनी से Megabrain खोलना । एक उस्तरा ब्लेड का प्रयोग करने के लिए खड़ी मोल्ड के कोनों में कटौती करने के लिए मोल्ड (चित्रा 4a) से अक्टूबर के ब्लॉक के आसान हटाने की अनुमति ।
- एक पतली परत वितरण (लगभग 3 मिमी मोटी) अक्टूबर के चक पर ।
- जल्दी, उंगलियों और OCT के बीच ंयूनतम संपर्क के साथ, चक पर Megabrain जगह, अभिविंयास में वांछित । इस स्टेप के लिए बड़े संदंश का भी इस्तेमाल किया जा सकता है जो गल को कम करें । अनुभाग के लिए शुरू करने से पहले, 15 के लिए cryostat में Megabrain घुड़सवार चक छोड़-20 मिनट के लिए OCT पूरी तरह से फ्रीज करने की अनुमति ।
- एक बार oct के आधार परत जम गया है, एक 2 मिमी Megabrain के पक्षों के आसपास मोटी परत OCT लागू करते है और इस चक पर पक्षों से नीचे चलाने के लिए अनुमति देते हैं । इस चक करने के लिए Megabrain सुरक्षित मदद करता है । फिर से, जारी रखने से पहले, 15 के लिए cryostat में Megabrain घुड़सवार चक छोड़-20 मिनट के लिए OCT फ्रीज अनुमति देते हैं ।
- एक उस्तरा ब्लेड का प्रयोग करें पक्ष या चक (चित्रा 4B) के नीचे से किसी भी अतिरिक्त अक्टूबर को हटा दें ।
4. Cryosectioning द Megabrain
- शुरू करने से पहले यह सुनिश्चित करें कि एक चोंच वाला कम से 20 एमएल 1x पंजाबियों से युक्त हो ।
- चक स्थिति, Megabrain के साथ घुड़सवार, cryostat पर चक सिर में (चित्रा 4B) ।
- वांछित मोटाई में कटौती करने के लिए cryostat सेट करें । वर्तमान पद्धति 10 µm के लिए ५० µm वर्गों के लिए अनुकूलित किया गया है ।
- अक्तूबर और ऊतक के रूप में ऊतक संग्रह (चित्र 4c) के लिए वांछित मस्तिष्क क्षेत्र तक पहुंचने की आवश्यकता ट्रिम कर दीजिए ।
- जब ऊतक इकट्ठा करने के लिए तैयार है, विरोधी रोल प्लेट कम जब तक यह मंच पर टिकी हुई है और एक ही अनुभाग लेने के लिए cryostat संभाल बारी है । धीरे से विरोधी रोल प्लेट लिफ्ट, सावधान किया जा रहा है कि खोदी Megabrain विरोधी रोल प्लेट से जुड़ा नहीं है और मंच आंकड़ा 4dसे गिर नहीं है) ।
- धीरे जब तक यह cryostat मंच (चित्रा 5) पर फ्लैट झूठ बोल रही है Megabrain अनुभाग unrolle करने के लिए तूलिका का उपयोग करें । (यदि आवश्यक हो, अक्टूबर फ्लैट के लिए रोलिंग को रोकने के लिए तूलिका का उपयोग पकड़) ।
- स्लाइड को गर्म करने से स्लाइड निकालें और अनुभाग को स्लाइड पर स्टिक करने की अनुमति देने वाले चरण पर स्लाइड, लेबल-ओर नीचे, Megabrain अनुभाग पर होवर करें ।
- जल्दी से स्लाइड पर प्रत्येक ऊतक अनुभाग के लिए 1x पंजाबियों की एक बूंद लागू करते है और इन बाहर शुष्क करने की अनुमति नहीं है जब तक वे फ्लैट ब्रश किया गया है (४.९ कदम देखें) ।
- एक ठीक इत्तला दे दी तूलिका का उपयोग करें बाहर ऊतक में किसी भी बुलबुले ब्रश और ऊतक प्रकट तो यह स्लाइड (चित्रा 5B) पर फ्लैट झूठ बोल रही है करने के लिए 1x पंजाब में डूबा हुआ है । ध्यान रखना मस्तिष्क वर्गों की स्थिति को बदलने के लिए नहीं है और इस तरह अन्य ऊतक वर्गों के लिए रिश्तेदार की स्थिति खो देते हैं । आंसू से बचने के लिए देखभाल के साथ ऊतक हेरफेर । मस्तिष्क वर्गों स्लाइड के किनारों से दूर रखें, के रूप में परिधीय अंतरिक्ष कुछ धुंधला प्रोटोकॉल में एक coverslip और पीएपी पेन आवेदन के लिए आवश्यक है ।
- स्लाइड गर्म और ४५ मिनट के लिए सूखी स्लाइड पर वापस प्लेस के रूप में ऊतक पर बसने से धूल को रोकने की जरूरत है । एक बार सूखी, में स्लाइड की दुकान पर-८० ° c आगे का उपयोग जब तक ।
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Representative Results
इस प्रक्रिया के लिए एक सकारात्मक अंत परिणाम ऊतक है कि स्लाइड पर फ्लैट है, कोई बुलबुले या आंसू के साथ, अभिविंयास जिसमें वे जमे हुए थे में है । ऊतक वर्गों समान रूप से स्थान पर है और आसानी से पहचाने अक्टूबर और अच्छा संकेतन में मस्तिष्क के अच्छे स्थान के कारण के रूप में 1 चित्रामें प्रदर्शन किया । यह मानते हुए कि मस्तिष्क ऊतक एक समान उम्र के जानवरों से एकत्र किया गया था, और ऊतक ठीक से OCT में गठबंधन किया गया था कि, एक स्लाइड पर एकत्र वर्गों एक समान राज्याभिषेक विमान का प्रतिनिधित्व करना चाहिए, जानवरों के बीच मस्तिष्क क्षेत्रों की तुलना की अनुमति. बशर्ते कि ऊतक अच्छी तरह से जम गया है, न्यूनतम फ्रीज विरूपण साक्ष्य के साथ, एच एंड ई दाग cryoprotection गुणवत्ता9का आकलन करने के लिए बाहर किया जा सकता है । Immunohistochemistry चित्रा 6में दिखाया धुंधला के साथ प्रदर्शन के रूप में किया जा सकता है ।
चित्र 1: सुझाए गए Megabrain लेआउट का प्रतिनिधि आरेख । यह 9 विभिंन जानवरों से व्युत्पंन ऊतक की स्थिति अंकन से पता चलता है । संख्या प्रणाली के रूप में प्रदर्शित किया गया है; हालांकि, किसी भी नंबरिंग सिस्टम का उपयोग किया जा सकता है । ' एक्स ' स्पष्ट रूप से अभिविन्यास जिसमें ऊतक जम गया था दिखाने के लिए डिज़ाइन किया गया रिक्त स्थान का प्रतिनिधि है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: गलत तरीके से और मोल्ड में सही ढंग से तैनात दिमाग । (क) मस्तिष्क गोलार्द्धों खराब ऊपर और पक्ष से अक्टूबर में गठबंधन । (ख) ऊपर और बगल से अक्टूबर में अच्छी तरह से संरेखित मस्तिष्क गोलार्द्धों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: मस्तिष्क ठंड के चरणों । (A) Megabrain में जलमग्न होने से पहले-४५ ° c isopentane. (ख) Megabrain जब isopentane में जलमग्न हो गया. (ग) isopentane में Megabrain पूरी तरह जलमग्न हो गया. (घ) Megabrain isopentane में कम किया जा रहा है, का प्रदर्शन है कि दिमाग ईमानदार और इस प्रक्रिया के दौरान एक दूसरे से equidistant रहना चाहिए । (ङ) एक एंबेडिंग मोल्ड में एक जमे हुए Megabrain । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: एक Megabrain काटने में महत्वपूर्ण चरणों । (A) cryostat में एंबेडिंग मोल्ड से निकाली जा रही Megabrain । (ख) चक Megabrain के साथ घुड़सवार । (ग) छंटनी Megabrain । (घ) cryostat मंच पर Megabrain खंड. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: पूर्व और बाद में घुड़सवार Megabrain अनुभाग । (अ) cryostat स्टेज पर फ्रोजन Megabrain सेक्शन (४० µm). (ख) Megabrain ऊतक के साथ घुड़सवार ग्लास स्लाइड । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6: Iba1 के साथ सना हुआ एक Megabrain स्लाइड का Immunohistochemistry. (क) एक Megbrain से लिया ऊतक एक अध्ययन में अलग दिमाग के बीच वर्दी धुंधला से पता चलता है । (ख) 20x सूक्ष्म somatosensory बैरल क्षेत्र (S1BF) प्रत्येक घुड़सवार मस्तिष्क के प्रांतस्था क्षेत्र से लिया छवियों, लगातार बढ़ कैल्शियम बाध्यकारी एडाप्टर अणु 1 (Iba1) दिमाग के बीच microglia के धुंधला दिखा । स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यह इस प्रक्रिया के दौरान विचार किया जाना चाहिए कि Megabrain और उसके आसपास के तापमान को लगातार और ऊतक के फिर से ठंड को रोकने के लिए निगरानी की जानी चाहिए । मस्तिष्क केवल से हटाया जा सकता है-20 ° c फ्रीजर करने के लिए 3 बार के रूप में हर बार यह छुआ है और cryostat में छोड़ दिया है, एक गर्म अस्थिरता तापमान के साथ, ऊतक गल और refreeze, बनावट और असामान्य ऊतक अखंडता10की तरह एक जेली के कारण. इसलिए, यह Megabrain सभी एक ही बार में कटौती करने के लिए इष्टतम है ।
ऊतक निर्धारण और cryoprotection इस प्रोटोकॉल के प्रमुख भागों बर्फ क्रिस्टल गठन को कम करने के लिए कर रहे हैं, बाहरी माइक्रोबियल विकास, और बंद करो एंजाइमी प्रतिक्रियाओं, जिससे ऊतक अखंडता के संरक्षण10। यदि दिमाग सुक्रोज के साथ cryoprotected नहीं कर रहे हैं, तो ऊतक के भीतर पानी ठंड की प्रक्रिया के दौरान बर्फ क्रिस्टल फार्म कर सकते हैं, जो टुकड़े के ऊतकों और कारण छेद के रूप में । हम टीबीएस में सुक्रोज के धारावाहिक कमजोर पड़ने का सुझाव है, दिमाग एक विस्तारित अवधि (48-72 घंटे) के लिए समान cryoprotection प्राप्त करने के लिए सीधे 30% सुक्रोज में रखा जा सकता है । हालांकि, यह अनुशंसा की जाती है कि सुक्रोज समाधान टीबीएस के साथ किए जाते हैं । इस तरह के पंजाब या पानी के उपयोग के रूप में बदलाव Megabrain और गरीब ऊतक गुणवत्ता के गरीब cryoprotection में परिणाम होगा । Haematoxylin और Eosin (एच एंड ई) दाग cryoprotection और फलस्वरूप फ्रीज विरूपण साक्ष्य11की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अच्छी ऊतक गुणवत्ता (न्यूनतम छेद के साथ) ऊतकवैज्ञानिक अध्ययन में आवश्यक है के रूप में छेद एंटीबॉडी के बंधन को बाधित कर सकते हैं के रूप में अच्छी तरह से ठीक प्रक्रियाओं के साथ कोशिकाओं की ऊतक अखंडता को कम करने, जो कुछ दाग के विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं. दिमाग के सममित स्थान से बचें, क्योंकि यह भ्रम पैदा कर सकता है जब से प्रत्येक मस्तिष्क प्राप्त किया गया था जो जानवर की पहचान करने की कोशिश कर रहा ।
वर्तमान तकनीक राज्याभिषेक वर्गों के लिए अनुकूलित किया गया है; हालांकि, यह आसानी से sagittal और अनुप्रस्थ वर्गों में कटौती अनुकूलित किया जा सकता है । इन संशोधनों को काटने २.७ के माध्यम से २.५ कदम में मस्तिष्क प्लेसमेंट के उचित भिंनता की आवश्यकता होगी । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन रूपांतरों दिमाग है कि एक एंबेडिंग मोल्ड में फिट कर सकते है की संख्या कम हो सकती है ।
इस तकनीक का एक महत्वपूर्ण संशोधन स्थान संख्या 1 में रिक्त स्थान है (जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है) । इस अंतरिक्ष Megabrain अभिविन्यास की आसान पहचान की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और इसलिए प्रत्येक मस्तिष्क के साथ जुड़े जानवर की पहचान.
इस तकनीक को जानवरों की एक बड़ी संख्या में जमे हुए है और Megabrain में एक साथ कटौती करने के लिए ऊतक की अनुमति के लिए संशोधित किया गया है । मूषक मस्तिष्क का आकार सेक्स, आयु और प्रजातियों पर इसलिए निर्भर है; दिमाग की संख्या है कि मोल्ड में फिट भिंन हो सकते हैं । यह अलग Megabrains में विभिंन उंर, लिंगों, या उपचार समूहों पृथक करने की सलाह नहीं है । हालांकि इस आकार एकरूपता सुनिश्चित कर सकते हैं, यह भी पूर्वाग्रह और इमेजिंग और विश्लेषण के दौरान मनोवाद वृद्धि हो सकती है । इसके अलावा, किसी भी प्रोटोकॉल में immunohistochemistry के दौरान स्लाइड्स के बीच अपरिहार्य विचरण है, जो उम्र के बीच धुंधला करने के लिए नेतृत्व कर सकता है/
एक आयताकार, बड़ा चक इस्तेमाल किया गया था, एक परिपत्र एक है, जो Megabrain के पीछे वृद्धि की सहायता प्रदान की जगह ।
मोल्ड और उसकी सामग्री के रूप में एक अक्टूबर मोल्ड में एक विलक्षण मस्तिष्क की तुलना में एक बड़ी मात्रा के थे, और अधिक समय isopentane में मस्तिष्क फ्रीज करने के लिए आवश्यक था । परीक्षण और त्रुटि के माध्यम से, अच्छा फ्रीज गुणवत्ता प्रदान की है कि समय की लंबाई (३.५ मिनट) निर्धारित किया गया था । Megabrain को isopentane में अधिक समय तक छोड़ा जा सकता है; हालांकि, तापमान अक्टूबर खुर से बचने के लिए-४५ ° c-50 ° c की सीमा में रहना चाहिए ।
के रूप में वहां कई Megabrain स्लाइड पर ऊतक के अलग टुकड़े कर रहे हैं, यह संभव है कि ऊतक बाहर शुष्क और फलस्वरूप ब्रशिंग कदम के दौरान और अधिक भंगुर हो सकता है । इस मुद्दे का मुकाबला करने के लिए, पंजाब की एक बूंद प्रत्येक व्यक्ति के मस्तिष्क अनुभाग पर रखा जाना चाहिए इसे नम रखने के लिए जब तक यह बाहर धकेल दिया है ।
मस्तिष्क hemisecting की तकनीक, एक अध्ययन है जिसमें यह आवश्यक है के लिए, अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । जब मस्तिष्क hemisecting, यह महत्वपूर्ण है कि यह bisection ठीक किया है सुनिश्चित करने के लिए सभी मस्तिष्क क्षेत्रों सही गोलार्द्ध के साथ बरकरार हैं । यदि सेरिबैलम या घ्राण बल्बों का अध्ययन प्रासंगिक नहीं है तो उन्हें हटाया जा सकता है । इस ' अतिरिक्त ' ऊतक हटाने ऊतक है कि छंटनी की आवश्यकता होगी की मात्रा को कम कर देता है जब cryosectioning । सेरिबैलम हटाने के दिमाग को ठंड से पहले OCT में और अधिक आसानी से खड़े करने के लिए अनुमति देता है ।
ब्रश करते समय, ऊतक अनुभागों को स्लाइड के किनारे से दूर रखें । यह पीएपी पेन, एक hydrophobic बाधा की एक पंक्ति के लिए कमरे की अनुमति देता है, ऊतक है, जो कुछ immunohistochemistry प्रोटोकॉल की आवश्यकता है चारों ओर । इसके अतिरिक्त, अंतरिक्ष coverslip के लिए की जरूरत है ।
अगर Megabrain जमने के दौरान गोलार्द्ध/ब्रेन गिर जाता है या झुका रहता है, तो सेक्शन सह-प्लानर नहीं होंगे । एक समान परिणाम अगर एक मस्तिष्क एक ही Megabrain में दूसरों की तुलना में बड़ा हो सकता है । इस पर काबू पाने के लिए, और अधिक स्लाइड जहां मस्तिष्क (ओं) में प्रश्न के हित के उपयुक्त क्षेत्र में है दाग के लिए चुना जा सकता है ।
इस तकनीक की एक सीमा के रूप में ऊतक के सभी अक्टूबर के एक ब्लॉक में जमे हुए है; अगर वहां तकनीकी त्रुटि है, जैसे एक बुरा एक गलत तापमान के कारण फ्रीज के रूप में, तो कई जानवरों से ऊतक प्रभावित हो जाएगा (5-9 पशु दिमाग के बजाय सिर्फ 1) । यह एक समस्या के अधिक है जब पूर्ण मस्तिष्क का उपयोग कर और नहीं hemisected वर्गों, क्योंकि शेष गोलार्द्ध जम सकता है और अकेले खोदी वांछित वर्गों को प्राप्त करने के लिए.
इस विधि के लिए एक और सीमा है कि जब cryostat को समायोजित करने के लिए Megabrain कटौती, एक सबसे फिट दृष्टिकोण लिया जाना चाहिए । यह सब दिमाग के कारण है एक दूसरे को थोड़ा अलग कोण पर जा रहा है, जबकि यह एक मुद्दा है जब एक विलक्षण जमे हुए मस्तिष्क अनुभाग नहीं है । इस के प्रभाव को सुनिश्चित करने के दिमाग ईमानदार और एक समान आकार के द्वारा ठंड के दौरान कम किया जा सकता है ।
ठंड दिमाग पर इस तकनीक का उपयोग करने का सबसे बड़ा लाभ में से एक विलक्षण है कि यह समग्र समय कम ठंड खर्च और ९०% तक दिमाग काटने, अगर 9 1 मस्तिष्क के रूप में एक ही गति से काटा जा रहा है । इस तकनीक के अंय प्रमुख लाभ यह है कि यह स्लाइड की एक छोटी संख्या है कि आवश्यक पशुओं से ऊतक शामिल करने की अनुमति देता है दाग । इससे immunohistochemical दाग की विश्वसनीयता और एकरूपता बढ़ जाती है, क्योंकि सभी स्लाइड्स एक ही दौर में दाग जाती हैं । वहां एक ही समय में दाग स्लाइड के बीच विसंगति हो सकती है, लेकिन एक Megabrain कई अध्ययन दिमाग की अनुमति के लिए एक ही स्लाइड पर प्रतिनिधित्व किया जा सकता है, इस प्रकार परिवर्तनशीलता को कम करने और विश्लेषण की वैधता में वृद्धि । लगातार धुंधला होने किसी भी ऊतकवैज्ञानिक अध्ययन में एक महत्वपूर्ण लाभ और इस तकनीक का उपयोग करने का एक प्रमुख महत्व है । अंत में, कम स्लाइड भी आपूर्ति लागत कम झेलना ।
इस तकनीक को आसानी से एक कुतर मस्तिष्क के sagittal वर्गों को काटने के लिए संशोधित किया जा सकता है । यह भी विभिंन पशु मॉडल और ऊतक के विभिंन प्रकार, जैसे मांसपेशियों या जिगर के नमूनों से ऊतक cryosectioning में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । प्रोटोकॉल के लिए रूपांतरों के लिए इस्तेमाल किया समाधान की राशि का अनुकूलन, cryostat ब्लेड का आकार/मंच, और एंबेडिंग मोल्ड की मात्रा सहित बनाया जाना होगा ।
इस तकनीक को भी मुक्त अस्थाई तकनीक है, जहां प्रोटोकॉल कदम ४.६ जब तक ही रहेगा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इस कदम पर, दिमाग अलग करने की आवश्यकता होगी और अलग प्लेट कुओं में उठा लिया दाग हो । अतिरिक्त देखभाल छंटाई प्रक्रिया में मस्तिष्क स्लाइस भ्रमित करने के लिए नहीं लिया जा करने की आवश्यकता होगी ।
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Disclosures
लेखकों ने कोई खुलासे नहीं किए हैं ।
Acknowledgments
PCH मिशन सहायता कोष इस पांडुलिपि में रिपोर्ट अनुसंधान का समर्थन किया । लेखकों के आंकड़े में इस्तेमाल किया छवियों को लेने के लिए डैनियल ग्रीफिथ शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) - white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
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