Summary
ここでは、凍結し、単一脳の処理時間を節約する代わりとして複数の動物から脳組織をセクション プロトコルを提案します。これは免疫組織化学的に染色変動を減少し、時間セクショニングとイメージングを減少します。
Abstract
組織および免疫組織化学は、顕微解剖学を視覚化し、生体組織内の蛋白質を集中解析のルーチンの方法です。他の科学分野の茄多と同様、神経科学、これらのテクニックを使用します。スライド マウント組織または浮遊セクションに対する免疫組織化学を行うことができます。スライド マウントのサンプルを準備して、時間集中的なプロセスです。Megabrain と呼ばれるテクニックの次のプロトコルは、単一の冷凍ブロックに複数の脳を組み合わせることで最大 90 %cryosection とマウントの脳組織へ搬送時間を短縮しました。さらに、この手法は大規模な組織化学的研究でのラウンドを染色の間見られる変動を削減しました。現在のテクニックは、下流の免疫組織化学的解析で齧歯動物の脳組織を使用するために最適化されていますただし、セクショニングを使用する別の科学的なフィールドに適用できます。
Introduction
ここでは、cryosection 複数齧歯動物脳同時に下流の免疫組織化学的手順を開発した Megabrain と呼ばれる手法のプロトコルを提案する.Megabrain は、複数の動物からのティッシュを含んでいる 1 つのスライドの生産が可能です。この手法は、9 の成体ラット半球または 5 の成人における脳からコロナ セクションを同時にカットする最適化されています。したがって、手法は大規模な免疫組織化学的研究や動物の大規模コホートからスライド マウントの脳組織に行う他の分析に最も適切です。
免疫組織化学には理解し、彼らの表情と特定の組織1,2,3の細胞変化を特徴付ける興味の蛋白質に対して指示される抗体の使用が含まれます。免疫組織化学的の使用は神経科学研究では、脳の4の細胞・分子の理解で助ける他の科学分野の間で流行。多くの動物との脳のセクションを含む大規模な研究は、リソースと時間がかかることができます。など、多面的な根拠、Megabrain の開発がある: セクショニング、マウント、およびその結果以下の試薬を使用しながら、組織を染色を過ごした時間を短縮します。さらに、プロセスを合理化し、同じ複数の脳を染色する能力のラウンド バッチ、免疫組織化学3の制限を染色性変動のいくつかを軽減するのに役立ちます。さらに、Megabrain を区分個別冷凍げっ歯類脳を断面に時間節約代替および動物やでも、試験治療グループ間の組織の迅速な比較により顕微鏡検査の技術。
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Protocol
Megabrain 技術は、男性成人 C57Bl6 マウス5、若年ラット、およびリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 続いて x 1 と transcardially をした大人の Sprague-dawley ラットから hemisected と全体の脳を使用して最適化されています4% パラホルムアルデヒド6。マウスおよびラット、男女や年齢の他の系統と同様の結果を実現できます。この原稿のデータを生成する研究若年ラットを使用し、アリゾナ大学機関動物のケアと使用委員会によって承認された、実験動物のケアのためのガイドおよび実験室の使用によると介抱され動物7。
1. 灌流脳に対する凍害保護作用
- 次成功 transcardial 潅流6は動物から完全な脳6、8を収集し、後 24 時間 PBS で 4% のパラホルムアルデヒドの 25 mL バイアルに置くことで解決。
注意: パラホルムアルデヒドは有毒な組織の定着剤;取り扱いに注意。その濃度と化学の発煙のフードの中のボリュームを識別する具体的にはラベルの付いた廃棄物コンテナーにパラホルムアルデヒドを転送し、化学廃棄物の化学物質安全性または正しく破棄されるまでキャビネットの店訓練を受けた技術者。 - 発煙のフードの 24 時間が経過した後は、ヘラを使って 4% パラホルムアルデヒドから脳を削除します。脳がバイアル (約 24 時間) の底に沈むまで、1 x 含有トリス緩衝生理食塩水 (TBS) で 15% ショ糖液約 20 mL のバイアルに脳を転送します。
- 次に、脳は、バイアル (約 24-48 h) の底に沈むまで脳を 1 x TBS で 30% ショ糖液約 20 mL のバイアルに転送します。
2. 脳の凍結
- ドライアイスの氷のバケツのベッドの上 500 mL ガラス製ビーカーを置きます。イソペンタン (2 メチル-ブタン) の 300-400 mL をガラスのビーカーに注ぐ。
- -45 ° C と-50 ° C の間に到達するイソペンタンの温度を許可します。密接に監視し、温度計、それをプロシージャ全体で一定に保つこの温度範囲を維持します。温度の測定値が下またはビーカーの側面に触れる中ではなく、ソリューションの中間から取られるを確認します。
- ベンチトップ、埋め込み型使い捨てを埋める (材料リスト参照) 最適な切削温度の約 1/2 フル (10 月;材料の表を参照してください) 化合物します。OCT で気泡がないことを確認します。ある場合任意の気泡はヘラや針でそれらを削除します。
-
30% ショ糖のバイアルから最初の脳をヘラで削除します。この時点で、いずれかの凍結脳全体または研究デザインに応じて、hemisect。
- Hemisected 脳の半球を分離するのに組織をきれいにカットするのに新しいかみそりの刃を使用します。研究のため必須ではない場合は、この段階で小脳および嗅球を削除します。小脳は、調査のため必要がある場合は、金型にまっすぐ立って脳を支援するために脳の後部の端に平らな面をカットすることをお勧めします。研究には、ローカライズされた領域から組織のみ必要とする場合は、既知の座標に基づく脳をブロックする齧歯動物の脳行列を使用できます。
- 脳の命名システム数値を与えます。図 1に示すように図を描きます。位置 2、脳が凍結された方向の迅速な特定を支援するための空白文字として位置 1 を残しての Megabrain 型に配置する最初の脳の数を記述します。
- 1 の位置に配置する脳鈍い鉗子かピンセットを使用して、ピックアップします。最初上向きカットする側の脳に合わせます。下の適切な場所で、10 月に脳、それまでその位置を調整するピンセットを使用して独立して立っています。
- 2.3 〜 2.5 残りの脳/半球を 3-10 の位置に固定するための手順を繰り返します。左右対称レイアウトでの脳/半球の配置は避けてください。
- Megabrain 金型のすべての 9 の脳を確認します。一度脳が独立して立っている、直立物および正しい方向 (図 2 bに示すように)、10 月のより 10 月までに追加金型 (脳の上部を覆われている)。また、OCT で目に見える気泡がないことを確認します。
- 鉗子はないなって部分的に冠水した (図 3 a) 10 月に確保する、金型のコーナーを保持するのに鉗子を使用します。イソペンタン (-45 ° C ~-50 ° C) に金型を低い金型レベルを維持するように注意しながら、下の 3 番目が金型に水没します。ここで表面と組織 (図 3 b) から上昇し 10 月に任意の気泡をように保持します。
- 30 後 s、低い少なくとも 3 分 (図 3) イソペンタン、鉗子、Megabrain を残してからのリリースに全体の金型が冠水しました。脳のまま直立と等距離にあるのでカビがレベルを維持ようにする (図 3 D)。
- 3 分後、イソペンタンから脳 (図 3E) 埋め込みを使用する 10 月、冷凍を含む金型を削除する鉗子。
- すぐに、金型とその内容をアルミホイルで包んでと動物の番号または Megabrain 識別ラベルします。冷凍 Megabrain を組織を避けるためにできるだけ控えめにタッチします。
- この Megabrain は今-20 ° C のフリーザーに転送し、24 時間の最小値を格納できます。
注: プロトコルがここで一時停止にすることができます、凍結セクショニングが行われるまで、Megabrain を格納できます。
3. クリオスタットの区分のため、Megabrain の準備
- -19 ° c、クライオスタットのキャビネットの温度を設定します。続行する前にこの温度に達したかどうかを確認します。断面中、-18 ° C と-20 ° C の間にキャビネットの温度が保たれていることを確認します。
- -20 ° C のフリーザーから、Megabrain を取るし、クリオスタットに入れます。また、クリオスタットに適切なサイズの 2 つの細い先端絵筆チャックを配置します。クリオスタットの温度に来て、少なくとも 15 分用クライオスタットで、Megabrain とチャックの両方を残します。
- 適切にラベルは Megabrain 識別番号、スライド番号をスライドします。これらのスライドをスライド暖かい (35-45 ° C) に置きます。
- アルミ箔から Megabrain の包みを開けます。縦型 (図 4 a) から 10 月のブロックを簡単に除去できるように金型の手抜きをするのにかみそりの刃を使用します。
- 10 月の薄層 (約 3 mm 厚) をチャックに分配します。
- すぐに、指と OCT の最小限の接触、望まれる方向に、チャックに、Megabrain を配置します。融解を最小限に抑える大きな鉗子をこの手順の使用もできます。Megabrain をセクション、開始する前に完全にフリーズする 10 月を許可するように 15-20 分用クライオスタットでチャックを搭載しました。
- 10 月の基本レイヤーを凍結している、Megabrain の側面のまわり 10 月 2 mm の厚い層を適用、チャックに側面からダウンを実行するこれを許可します。これはチャックに Megabrain をセキュリティ保護に役立ちます。もう一度前に、凍結する 10 月を許可するように 15-20 分用クライオスタットのマウント Megabrain チャックを残します。
- 側面または底面のチャック (図 4 b) から任意の余分な 10 月を削除するのにには、かみそりの刃を使用します。
4. セクショニング、Megabrain
- 始める前に、少なくとも 20 mL の 1x PBS を含むビーカーがアクセスできることを確認します。
- クライオスタット (図 4 b) のチャックの頭の中に、Megabrain を搭載、チャックを位置します。
- 所望の厚さにカットするクライオスタットを設定します。現在の方法は、10 μ m 50 μ m のセクションからに最適化されています。
- トリム OCT と組織組織コレクション (図 4) に必要な脳の領域に到達するため必要に応じて。
- 組織を収集する準備ができたら、ステージ上に置きますアンチロール プレートを下げるし、1 つのセクションを取るのクライオスタット ハンドルを回します。ゆっくりと持ち上げます断面 Megabrain がアンチロール プレートに接続されていないとステージ図 4オフに該当しないように注意しながら、アンチロール プレート)。
- フラット (図 5 a) クライオスタット ステージ上にあるまで、Megabrain セクションをアンロールするペイント ブラシを慎重に使ってください。(必要な場合保持する OCT フラット ローリングを防ぐためにペイント ブラシを使用して)。
- 暖かいスライドからスライドを削除、スライド、ラベル面を下、セクションのスライドに固執をするステージに Megabrain のセクションの上をホバーします。
- すぐに各組織切片スライドに 1 × PBS のドロップを適用し、これらを彼らはフラット起毛されているまで乾燥を許可しない (4.9 の手順を参照してください)。
- 組織のすべての泡をブラシとそれはスライド (図 5 b) の上に平らに横たわっているので、ティッシュを展開 1 × PBS 中に浸漬微細先端絵筆を使用します。脳断面の位置を変更し、従って他のティッシュ セクションに対する相対位置を失うように注意します。涙を避けるために注意して組織を操作します。スライドの端から脳セクションそのまま coverslip といくつかのプロトコルを汚すで PAP ペン アプリケーション用周辺のスペースが必要。
- 暖かいと 45 分カバー ティッシュに沈降からほこりを防ぐために必要に応じて乾燥、バック スライドにスライドを配置します。一度乾燥し、さらに使用するまで-80 ° c でスライドを格納します。
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Representative Results
このプロシージャに肯定的な結果は、泡や涙、凍結された向きでない、スライドにある組織です。切片は、OCT で脳と図 1に示すよう良い表記の良い配置のため離れてしやすい等間隔です。脳組織は同じような年齢の動物から採取したと、組織は OCT に合っていると仮定すると、スライドの収集のセクションは似たようなコロナの平面は、動物の脳の比較を許可するを表す必要があります。組織は最小限凍結アーティファクトでも、凍結していること H & E 染色はに対する凍害保護作用品質9を評価するために実施することができます。免疫組織化学は、染色の図 6に示すように遂行することができます。
図 1: 推奨 Megabrain レイアウトの代表的なダイアグラム。これは 9 の異なる動物由来組織の位置表記を示しています。数システムは設計されています、示される;ただし、任意の番号付けシステムを使用する場合があります。'X' は、空白組織が凍っていた方向を明確に表示するように設計の代表です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 正しくと正しく配置金型で脳。(A) 脳の半球上部と側面から 10 月の悪い配置。10 月の上部と側面からの (B) 配向脳半球。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 脳の凍結の段階。(A) Megabrain-45 ° C イソペンタンで水没すること前に。(B) Megabrain イソペンタンで冠水したとき。(C) Megabrain はイソペンタンで完全に水没。(D) の Megabrain のイソペンタンに低下されている脳が直立し、この過程で互いに等距離をとどまるべきであることを示します。埋め込み型の (E) 固定 Megabrain。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 主な切削、Megabrain 段階。(A) Megabrain クライオスタットに金型を埋め込むから削除されています。(B) チャックは Megabrain を搭載しました。(C) は、Megabrain をトリミングされます。(D) Megabrain クライオスタット ステージ上のセクションします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 前およびポスト取付けられた Megabrain セクション。(A) 冷凍 Megabrain クライオスタット ステージ上の (40 μ m) のセクションします。(B) Megabrain 組織をスライド ガラス搭載します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: Megabrain スライドの免疫組織化学染色 Iba1 。(A) 組織染色の研究で脳は大きく異なる制服 Megbrain ショーから取られます。(B) 20 倍顕微鏡画像、各マウントされた脳の体性感覚バレル フィールド (S1BF) の皮質領域から取得した一貫性のあるを示すカルシウム結合アダプター分子 1 (Iba1) をイオン化脳のミクログリアの染色します。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
それは、融解と再組織の凍結を防ぐために、Megabrain とその周辺の温度を常に監視する必要があります、この手順で考慮必要があります。脳のみ削除できます-20 ° C のフリーザーからに 3 回としてたびにそれに触れると暖かい変動温度、組織と、クリオスタットの左を解凍し、refreezes、テクスチャや異常組織の完全性10のようなゼリーを引き起こしています。したがって、すべてを一度に、Megabrain の切削に最適です。
ティッシュの固定に対する凍害保護作用は、氷結晶の形成を最小限に抑えるため、外部の微生物の成長を減らすし、組織の整合性10はそのまま維持、酵素反応を停止するには、このプロトコルの主要部分。脳はショ糖と cryoprotected は、組織内の水は、組織を細断処理、フォームに穴を引き起こす凍結プロセス中に氷の結晶を形成できます。我々 は TBS でショ糖のシリアル希薄を示唆している、脳は類似に対する凍害保護作用を達成するために長時間 (48-72 時間) の 30% ショ糖に直接配置できます。ただし、蔗糖溶液は、PBS の使用など TBS. バリエーションで作られていますまたは水 Megabrain の貧しい人々 の組織の品質不良に対する凍害保護作用になることを強くお勧めします。ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色に対する凍害保護作用とそれに伴う凍結アーティファクト11の品質を評価するために使用できます。(最小限の穴) と良い組織の品質は、穴はいくつかの汚れの分析に影響を与えることができます罰金のプロセスと細胞性組織を減らすことと同様、抗体の結合を破壊できる、組織学的研究に不可欠です。それぞれの脳が得られた動物を識別することを試みるとき混乱が生じると脳の左右対称の配置は避けます。
現在の技術はコロナ セクションに最適化されていますただし、矢状面と横のセクションをカットに適応できます。これら切削修正手順 2.5 2.7 を通じて脳配置の適切なバリエーションが必要になります。これらの adaptions が埋め込み型の 1 つに合うことができる脳の数を減らすことができることに注意してください。
この技術のキー変更は位置番号 1 (図 1に示すように) の空白です。このスペースは Megabrain 方向の容易に識別できる、したがって、それぞれの脳に関連付けられている動物を識別する設計されています。
この手法は、凍結し、Megabrain で同時に切断動物の大きい数から組織を許可するように変更されています。齧歯動物の脳の大きさは性、年齢、種によって異なります。金型に合わせて脳の数によって異なります。別の Megabrains に年齢別、性別、または治療グループを分離することはお勧めしません。サイズ均一性を確保することができるこれが、イメージングおよび分析中に偏見と主観を増やすこともそれ。さらに、年齢/性別グループ間染色の矛盾につながる可能性があります任意のプロトコルにおける免疫組織化学の間に滑りの必然的な差異があります。
長方形の大きなチャックは、Megabrain の背後にあるサポートの強化を提供する円形の 1 つの代わりに使用されました。
金型とその内容で 10 月金型で特異な脳のそれよりも大きいボリュームより多くの時間は、イソペンタンで脳をフリーズする必要でした。試行錯誤は、良い凍結品質 (3.5 分) を提供される時間の長さが決定されました。長いイソペンタンで、Megabrain を残すことができます。しかし、温度が割れを避けるために-50 ° C に-45 ° C の範囲で滞在する必要があります、10 月。
Megabrain スライドの組織の多くの別の部分があるので、組織が乾燥でき、したがってブラッシング手順中より脆性になることが可能です。この問題に対処するためは、PBS のドロップをブラシまでそれを湿った保つに各々 の個々 の脳のセクションに置かれるべき。
Hemisecting の技術これは、必要な調査のため、脳は良い結果を得るために重要です。とき hemisecting 脳、この二分法がすべての脳領域がそのまま正しい半球を確実に正確に行われることが重要です。小脳や嗅球関連研究になっていない場合は、削除できます。ときにトリミングする必要がある組織の量を減らすこの '過剰' 組織を除去するセクショニング。小脳を削除すると、凍結前に 10 月でより容易に立つために脳ができます。
うち起毛されて、スライドの端からティッシュ セクションを保ちます。これにより PAP ペン、免疫組織化学・ プロトコルの要件は、組織を取り巻く、疎水性の障壁のラインのための部屋です。さらに、coverslip のスペースが必要です。
半球/脳の滝凍結 Megabrain の際のセクションには、共平面ができません。一つの脳が単一の Megabrain で他よりも大きいと、同様の結果につながります。これを克服するためには、問題の brain(s) が関心の適切な領域で、染色するさらにスライドを選択できます。
この手法の 1 つの制限は、すべて組織の冷凍; 10 月の 1 つのブロックで、します。悪い凍結による不適切な温度など、技術的なエラーがある場合、複数の動物からのティッシュになります (ちょうど 1 の代りに動物の脳を 5-9) に影響します。残りの半球を凍結し、断面単独希望のセクションを取得することができますので、完全な脳と hemisected セクションではなくを使用する場合、これは問題の詳細です。
このメソッドのもう一つの制限は、ときに、Megabrain をカットするクライオスタットを調整、最適アプローチが取られる必要がありますです。これは単独冷凍脳を断面の場合、これは問題ではないに対し、互いにわずかに異なる角度でされているすべての脳原因です。これの効果を確保することによって凍結中に最小化できる脳が直立し、同じようなサイズ。
単独脳を凍結上でのこの手法はそれが凍結費やされた時間全体を短縮を使用し、切削脳を 90%、9 は 1 脳と同じペースでカットされている場合の最大の利点の 1 つ。この手法の主な利点は、染色に必要な動物からのティッシュを含むスライド数が小さくできます。これはすべてのスライドが同じラウンドで黒ずんでいるので信頼性と免疫組織化学的染色の均一性を向上します。同時に染色スライド間の矛盾があることが、このように可変性を減らすと分析の有効性を増加、Megabrain が 1 つのスライドに表示するいくつかの研究脳を許可できます。一貫性のある染色の組織学的研究でこの技術を使用しての主要な意義の重要な利点です。最後に、少数のスライドは、調達コスト削減をも発生します。
この手法は、齧歯動物の脳の矢状断切断の簡単に変更でした。セクショニングから別の動物モデルとサンプルを筋肉や肝臓などの組織のさまざまな種類の組織での使用に適応させる可能性があります。プロトコルに adaptions と行われなければならない、ソリューションの量の最適化を含むを使用するクライオスタット ブレード/ステージのサイズと埋め込み型のボリューム。
この手法もありますフローティング技術の適応ステップ 4.6 まで同じプロトコルがままです。この手順では、脳を分離し、染色される個別の刷版の井戸に持ち上がる必要があります。余分なケアは、並べ替えのプロセスで脳スライスを混同しないように撮影する必要があります。
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Disclosures
著者の開示があります。
Acknowledgments
PCH ミッション サポート資金は、本稿で報告された研究をサポートしました。著者は、数字で使用されている画像を撮影のダニエル ・ グリフィスを感謝したいです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) - white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology? Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).
- Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
- Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).
