Summary
여기, 선물이 동결 하 고 처리 한 두뇌를 절약해 주는 대신 여러 동물에서 뇌 조직 섹션 프로토콜. 이 immunohistochemistry 동안 얼룩 가변성을 감소 시키고 감소 시간 cryosectioning 및 이미징.
Abstract
조직학 및 immunohistochemistry 현미경 해부학 시각화 및 지역화 생물 조직 내의 단백질 분석의 일상적인 방법이 있습니다. 신경 과학, 뿐만 아니라 다른 과학 분야의 과다,이 기술은 사용 됩니다. Immunohistochemistry는 슬라이드 마운트 조직 또는 부동성 섹션에서 수행할 수 있습니다. 샘플 슬라이드 마운트 준비 시간 집중적인 과정 이다. 다음 프로토콜 기법, Megabrain에 대 한 단일 냉동된 블록으로 여러 두뇌를 결합 하 여 최대 90%까지에 의해 cryosection 및 마운트 뇌 조직에 걸린 시간 감소. 또한,이 기술은 큰 조직화 학적인 학문에서 라운드를 얼룩 사이 본 다양성 감소. 현재 기술에 맞게 최적화 된 설치류 뇌 조직을 사용 하 여 다운스트림 immunohistochemical 분석; 그러나, cryosectioning 사용 하는 다른 과학 분야에 적용할 수 있습니다.
Introduction
여기, 우리 소설 방법, 우리는 전화 Megabrain, cryosection 여러 설치류 다운스트림 immunohistochemical 절차에 대 한 동시에 두뇌 개발에 대 한 프로토콜을 제시. Megabrain는 여러 동물에서 조직을 포함 하는 단일 슬라이드의 생산 수 있습니다. 이 기술은 9 성인 쥐 반구, 또는 5 성인 전체 두뇌에서 코로나 섹션을 동시에 최적화 되었습니다. 따라서, 기술은 가장 큰 immunohistochemical 연구 또는 동물의 대규모 코 호트에서 슬라이드 탑재 뇌 조직에서 수행 하는 다른 분석에 적용 됩니다.
Immunohistochemistry 이해 하 고 그들의 표현과 특정 조직1,2,3세포 변화 특성 관심사의 단백질에 대하여 지시 하는 특정 항 체의 사용을 포함. Immunohistochemistry의 사용은 뇌4의 세포 및 분자 이해에 은닉, 다른 과학 분야 중 신경 과학 연구에서 널리 퍼지다. 많은 동물 및 뇌 섹션을 포함 하는 대규모 연구 자원 및 시간 집중 될 수 있습니다. 따라서, 개발 된 Megabrain의 다각적인 근거 있다: 시간을 줄이기 위해 cryosectioning, 장착, 그리고 결과적으로 더 적은 시 약을 사용 하는 동안 조직, 얼룩을 보냈다. 또한, 프로세스를 간소화 하 고 얼룩 같은 여러 두뇌의 수 라운드 배치, immunohistochemistry3의 한계를 얼룩 사이 가변성의 일부를 완화 하는 데 도움이. 또한,는 Megabrain 단면 단면 개별 냉동된 설치류 두뇌에 시간 절약 대안 이다 하며 동물이 나 심지어 치료 그룹 사이 조직의 빠른 비교를 위해 현미경 검사 법 기술로
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Protocol
Megabrain 기술은 남성 성인 C57Bl6 마우스5, 청소년 Sprague-Dawley 쥐, 및 transcardially 다음 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 끼얹는다 했다 성인 Sprague-Dawley 쥐에서 hemisected 및 전체 두뇌를 사용 하 여 최적화 된 4% paraformaldehyde6으로. 유사한 결과 쥐와 쥐, 남녀 모두에서 그리고 다른 연령대의 다른 긴장에 수행할 수 있습니다. 이 원고에 대 한 데이터를 생성 하는 연구 청소년 Sprague-Dawley 쥐를 사용 하 고 아리조나 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 되었다 실험 동물 관리에 대 한 가이드 및 실험실 사용에 따라 치료를 받았다 동물7.
1입니다. Cryoprotection 끼얹는다 두뇌의
- 다음 성공적인 transcardial 관류6, 동물에서 전체 뇌6,8 을 수집 하 고 24 시간에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde 25 mL 유리병에 배치 하 여 수정 후.
주의: Paraformaldehyde은 독성 조직 정착 제; 관심을가지고 처리 합니다. 농도 화학 증기 두건 안쪽 볼륨을 식별 하는 구체적으로 레이블이 지정 된 폐기물 컨테이너로 paraformaldehyde 전송 및 저장소 캐비닛 화학 안전 하거나 제대로 처분 될 때까지 화학 폐기물에 직원을 훈련 하는 다음. - 증기 두건에서 24 시간 경과한 후 주걱을 사용 하 여 4 %paraformaldehyde 머리를 제거 합니다. 뇌 (약 24 h) 유리병의 바닥에 싱크 될 때까지 1 x Tris 버퍼 염 분 (TBS)에서 15% 자당 해결책의 약 20 mL의 유리병으로 두뇌를 전송 합니다.
- 뇌 (약 24-48 h) 유리병의 바닥에 싱크 될 때까지, 1 x TBS에서 30% 자당 해결책의 약 20 mL의 유리병에 두뇌를 전송 합니다.
2. 뇌 동결
- 드라이 아이스는 얼음 양동이에 침대에 500 mL 유리 비 커를 놓습니다. Isopentane (2 메 틸-부탄)의 300-400 mL 유리 비 커에 붓으십시오.
- -45 ° C와-50 ° C 사이 도달 isopentane의 온도가 밀접 하 게 모니터 하 고 그것을 유지 하는 절차를 통해 일정 한 온도계로이 온도 범위를 유지. 온도 판독 솔루션, 그리고 하단 또는 비 커의 측면을 감동 하는 동안 하지 중간에서 가져옵니다 확인 하십시오.
- 벤치탑에 채우기 포함 형 일회용 (자료 목록 참조) 최적의 절삭 온도의 약 1/2 전체 (OCT; 참조 테이블의 자료) 화합물. OCT에서 아무 공기 방울 인지 확인 합니다. 어떤 기포 주걱 또는 바늘 제거 경우에.
-
주걱으로 30% 자당의 유리병에서 첫 번째 뇌를 제거 합니다. 이 시점에서, 하나는 두뇌 전체 또는 hemisect, 연구 설계에 따라 고정.
- Hemisected 두뇌 반구를 분리 하기 위하여 조직을 통해 깨끗 한 컷을 만들기 위해 새로운 면도날을 사용 합니다. 연구에 대 한 필요 하지 않은 경우이 단계에서 소 뇌 및 후 각 전구를 제거 합니다. 소 뇌 연구에 대 한 필요, 그것은 금형에서 똑바로 서에서 뇌를 돕기 위해 두뇌의 뒤 끝에 평면 영역을 잘라 좋습니다. 연구만 필요한 경우 지역화 된 지역에서 조직, 알려진된 좌표에 따라 뇌를 차단 하는 설치류 두뇌 매트릭스를 사용할 수 있습니다.
- 두뇌 시스템 이름을 지정 하는 숫자를 제공 합니다. 그림 1과 같이 다이어그램을 그립니다. 첫 번째 뇌의 위치 2, 위치 1 두뇌 동결 된 방향의 빠른 식별에 도움을 빈 공간으로 두고 있는 Megabrain 형에 배치의 번호를 작성 합니다.
- 위치 1에 배치 하는 두뇌를 데리 using 무딘 집게 또는 핀셋. 첫 번째 위쪽으로 향하게 잘라 면 뇌를 방향을 정하십시오. 그것은 의미 하지 독립적으로 때까지 그것의 위치를 조정 하는 핀셋을 사용 하 여 적절 한 위치에 OCT로 뇌에 낮은.
- 2.3-2.5 위치 3-10에에서 동결을 나머지 두뇌/반구에 대 한 단계를 반복 합니다. 두뇌/반구 대칭 레이아웃에 배치 하지 마십시오.
- Megabrain 금형에서 모든 9 머리를 검토 합니다. 두뇌를 독립적으로 서는, 일단 바르고 올바르게 지향 oct ( 그림 2B에서 같이), 더 많은 10 월 금형에 (때까지 추가 두뇌 위에 덮여 있다). 다시, OCT에서 볼 수 없는 기포 인지 확인 합니다.
- 집게는 집게 할 하지 될 부분에 빠져들 OCT (그림 3A) 보장 형의 모서리를 사용 합니다. Isopentane (-45 ° C-50 ° C ~)으로 금형을 낮은 주의 형 수준을 유지 하 되 되도록 바닥의 세 번째 금형 빠져들. 잡고 여기 표면 및 조직 (그림 3B)에서 상승 하는 OCT에서 모든 거품을 허용 하도록.
- 30 후 s, 낮은 isopentane는 Megabrain를 떠나 집게에서 방출에 전체 금형 빠져들 적어도 3 분 (그림 3C). 그래서 두뇌 유지 직 립 하 고 동일한 금형 수준 유지 되도록 (그림 3D).
- 3 분 후 사용 10 월 냉동, 포함 된 몰드를 제거 하는 집게는 isopentane에서 두뇌 (그림 3E)를 포함합니다.
- 즉시, 금형 및 그 내용을 알루미늄 호 일에 포장 및 동물 숫자 또는 Megabrain 식별 레이블. 직물을 녹고 방지 하려면 가능한 한 아껴 언된 Megabrain을 터치 합니다.
- 이 Megabrain 이제는-20 ° C 냉동 고로 전송 하 고 24 h의 최소 저장 수 있습니다.
참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 하 고는 Megabrain cryosectioning 수행 될 때까지 냉동 저장 될 수 있다.
3. 준비 하 고 있는 Megabrain는 Cryostat에 단면에 대 한
- -19 ° c는 cryostat의 캐비닛 온도 설정 계속 하기 전에이 온도 도달할 다는 것을 확인 하십시오. 단면, 전체 캐비닛 온도-18 ℃와-20 ° C 사이 유지 하는 것을 확인합니다
- -20 ° C 냉동 고에서는 Megabrain를가지고 고는 cryostat에 배치. 또한,는 cryostat에 적절 한 크기 차원 및 두 개의 얇은 끝된 페인트 용의 척을 놓습니다. Cryostat는 cryostat의 온도에 서 적어도 15 분 동안에 Megabrain와는 척을 남겨 주세요.
- Megabrain 식별 번호와 슬라이드 번호 슬라이드를 레이블을 적절 하 게. 이러한 슬라이드 슬라이드 따뜻한 (35-45 ° C)에 누워.
- 알루미늄 호 일에서 Megabrain 풀 면도날을 사용 하 여 수직 형 (그림 4A)에서 10 월의 블록의 쉬운 제거를 허용 하도록 금형의 모서리를 잘라.
- 10 월의 얇은 층 (대략 3 밀리미터 두꺼운)는 척에 분배.
- 신속 하 게, 손가락 및 OCT 사이의 최소한의 접촉으로 원하는 방향에 척에는 Megabrain를 놓습니다. 셉 해빙을 최소화 하기 위해이 단계에 대 한 사용할 수 있습니다. 섹션, 두고는 Megabrain를 시작 하기 전에 완전히 동결 OCT 있도록 15-20 분 동안 cryostat에서 척을 탑재.
- 일단 10 월의 기본 레이어, 냉동는 Megabrain의 측의 주위에 10 월 2 m m 두꺼운 레이어를 적용 하 고 물림 쇠에 측면에서 실행이. 안전 물림 쇠를 Megabrain 수 있습니다. 다시, 계속 하기 전에 동결 OCT 있도록 15-20 분 동안 cryostat에 탑재 Megabrain 척을 둡니다.
- 면도날을 사용 하 여 모든 초과 10 월 척 (그림 4B)의 하단 또는 측면에서 제거.
4입니다. Cryosectioning는 Megabrain
- 시작 하기 전에, 최소한 20 mL 1 x PBS를 포함 하는 비 커 액세스할 수 인지 확인 합니다.
- 척, Megabrain, cryostat (그림 4B)에 척 머리에 탑재 위치.
- 원하는 두께에서 잘라 cryostat을 설정 합니다. 현재 방법론은 10 µ m 50 µ m 섹션에 대해 최적화 되었습니다.
- 트림 OCT 및 조직 조직 컬렉션 (그림 4C)에 대 한 원하는 뇌 영역에 도달 하는 데 필요한.
- 때 조직 수집, 안티 롤 접시까지 단계에 달려있다 낮은 고 cryostat 단일 섹션을 준비. 천천히 들어 sectioned Megabrain 안티 롤 플레이트에 연결 되어 있지와 무대 그림 4D가 되지 않습니다 조심 안티 롤 접시에서).
- 부드럽게 페인트 용을 사용 하 여 (그림 5A) cryostat 무대에 평평 거짓말까지 Megabrain 섹션을 풀 다. (필요한 경우, 개최 OCT 롤링을 방지 하기 위해 페인트 용을 사용 하 여 평면).
- 따뜻한 슬라이드에서 슬라이드를 제거 하 고 슬라이드, 슬라이드에 충실 하려면 섹션을 허용 하는 무대에서 Megabrain 섹션, 레이블 면 가져가.
- 신속 하 게 슬라이드에 각 조직 섹션을 1 x PBS의 한 방울을 적용 하 고이 닦 았을 그들이 평면 때까지 건조를 허용 하지 않습니다 (단계 4.9 참조).
- 1 x PBS에 잘 끝된 붓을 사용 하 여 조직에 어떤 거품 밖으로 솔 질 하 고 그래서 (그림 5B) 슬라이드에 평평 거짓말 조직 전개. 알아서 하지 뇌 섹션의 위치를 변경 하 고 따라서 다른 조직 섹션에 상대적 위치를 잃게. 눈물을 피하기 위해 주의 조직을 조작 합니다. 계속 슬라이드의 가장자리 떨어져 뇌 섹션 주변 공간은 coverslip 및 일부 얼룩 프로토콜에 PAP 펜 응용 프로그램에 필요한.
- 따뜻한 고 건조 45 분 커버 조직에 정착에서 먼지를 방지 하기 위해 필요에 따라 슬라이드 뒤에 슬라이드를 놓습니다. 일단 건조, 추가 사용까지-80 ° c에 슬라이드를 저장 합니다.
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Representative Results
이 절차에 긍정적인 최종 결과 거품 또는 동결 된 방향에서 눈물 없이 슬라이드에 있는 조직. 조직 섹션 OCT에서 뇌와 그림 1에서 시연으로 좋은 표기법의 좋은 배치로 인 떨어져 고 쉽게 식별 분포 균등 하 게 됩니다. 뇌 조직의 비슷한 나이의 동물에서 수집 된 고 조직 OCT에 맞춘 제대로 된 슬라이드에서 수집 하는 섹션 동물 사이 뇌 영역의 비교 수 있도록 비슷한 코로나 비행기를 나타내야 합니다. 조직은 고정, 최소한 동결 유물으로는 H & E 얼룩9cryoprotection 품질 평가 하기 위해 밖으로 수행할 수 있습니다. 그림 6에 표시 된 얼룩과 같이 Immunohistochemistry 밖으로 수행할 수 있습니다.
그림 1: 제안된 Megabrain 레이아웃의 대표적인 다이어그램. 9 다른 동물에서 파생 된 조직의 위치 표기법을 표시 됩니다. 번호 시스템은 설계와 같이; 그러나, 모든 번호 매기기 시스템을 사용할 수 있습니다. 'X' 조직 얼 방향을 명확 하 게 표시 하도록 빈 공간 대표 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 잘못 하 고 정확 하 게 위치 머리 형에. (A) 뇌 반구 상단과 측면에서 10 월에 제대로 정렬. 상단 및 측면에서 10 월에 (B) 잘 정렬 된 두뇌 반구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3:의 뇌 동결 단계. (A) Megabrain-45 ° C isopentane에 빠져들 되 고 전에. Isopentane에 빠져들 때에 Megabrain를 (B) (C) Megabrain는 완전히 isopentane에 침수. (D) Megabrain isopentane,으로 하향 조정 되는 두뇌 시연 직 립 하 고이 과정에서 서로 등거리를 유지 한다. 임베딩 몰드에서 (E) 냉동 A Megabrain. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 중요 한 단계는 Megabrain 절단에. (A) Megabrain cryostat에 금형을 포함에서 제거 되 고. (B) 척 Megabrain와 함께 탑재. (C) Megabrain 손질. (D) Megabrain cryostat 단계에 섹션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 사전 및 사후 탑재 Megabrain 섹션. (A) 냉동 Megabrain cryostat 스테이지 (40 µ m) 섹션. (B) 유리 슬라이드 Megabrain 조직으로 탑재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: Iba1와 Megabrain 슬라이드의 Immunohistochemistry 스테인드. (A) 조직 연구에서 다른 두뇌 사이 얼룩 유니폼 Megbrain 쇼에서 찍은. (B) 20 배 현미경 이미지 각 탑재 된 두뇌의 somatosensory 배럴 필드 (S1BF) 피 질 영역에서 가져온, 칼슘-바인딩 어댑터 분자 1 (Iba1)를 이온화 일관성을 보여주는 사이 두뇌 microglia의 얼룩. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
그것은 고려 되어야 한다이 절차 동안에 그는 Megabrain와 그 주변 온도 지속적으로 모니터링 해야 녹고 고 다시 조직의 동결을 방지 하기 위해. 뇌만 제거할 수 있습니다-20 ° C 냉동 고에서 최대를 3 번으로 때마다 그것을 건드리지 cryostat 따뜻한 변동 온도, 조직에에서 녹아서 왼쪽과 refreezes, 텍스처 및 비정상적인 조직의 무결성10같은 젤리를 일으키는. 따라서, 그것은 Megabrain를 모두 한 번에 잘라 최적입니다.
조직 고정 및 cryoprotection을 얼음 결정 형성을 최소화, 줄이고 외부 미생물 성장, 효소 반응, 조직의 무결성10을 보존 함으로써 중지이 프로토콜의 핵심 부분입니다. 두뇌 자당과 cryoprotected 하지 않습니다, 다음 조직 내의 물 과정에서 동결 조직 분쇄기 고 구멍 형태에 있는 얼음 결정 형성할 수 있다. TBS에서 자당의 직렬 희석이 좋습니다, 그러나 두뇌 유사한 cryoprotection를 달성 하기 위해 오랜된 기간 (48-72 시간)에 대 한 30% 자당에 직접 배치할 수 있습니다. 그러나, 그것은 좋습니다 자당 솔루션 tbs. 유사 PBS 사용 하 여 같은 만들어집니다 또는 물 Megabrain 및 빈약한 조직 품질의 가난한 cryoprotection 귀 착될 것 이다. Haematoxylin와 오신 (H & E) 얼룩 cryoprotection 및 필연적인 동결 유물11의 품질을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. (최소한의 구멍)을 가진 좋은 조직 품질 구멍 약간 얼룩의 분석에 영향을 미칠 수 있는 좋은 프로세스와 셀의 조직의 무결성을 줄일 뿐만 아니라 항 체의 바인딩을 혼란 시킬 수 있다 조직학 연구에 필수적입니다. 각 뇌를 얻어 온 동물을 식별 하려고 할 때이 혼란을 일으킬 수로 두뇌의 대칭 배치를 하지 마십시오.
현재 기술에 맞게 최적화 된 코로나 섹션; 그러나, 그것은 쉽게 화살 및 가로 섹션을 적용할 수 있습니다. 이러한 절단 수정 단계 2.7 통해 2.5 게재 위치 뇌의 적절 한 변화를 요구할 것 이다. 그것은 이러한 적응 포함 한 금형에 들어갈 수 있는 두뇌의 수를 줄일 수 있습니다 주목 해야한다.
이 기술의 주요 수정 위치 번호 1 ( 그림 1에서 같이)에 빈 공간입니다. 이 우주는 Megabrain 방향 쉽게 식별을 허용 하 고 따라서 각 뇌와 관련 된 동물 식별 설계 되었습니다.
이 기술은 조직의 동결 하는 Megabrain에서 동시에 잘라 동물의 많은 수에서 있도록 수정 되었습니다. 설치류 두뇌의 크기는 성별, 나이 및 종에 따라서; 금형에 맞게 두뇌의 수는 달라질 수 있습니다. 별도 Megabrains로 다양 한 연령, 남녀, 또는 치료 그룹을 분리 하는 권고 하지 않습니다. 이 크기 균일 하도록 할 수 있습니다, 하지만 그것은 또한 늘어납니다 편견과 주관 영상 및 분석 하는 동안. 또한, 나 이/성별 그룹 사이 얼룩 불일치도 이어질 수 있는 모든 프로토콜에 immunohistochemistry 동안 슬라이드 사이의 피할 수 없는 차이입니다.
직사각형, 큰 척은 Megabrain 뒤에 증가 지원을 제공 하는 원형 한 대신 사용 되었다.
형과 그 내용을 10 월 형에 단 수 뇌의 그것 보다 더 큰 볼륨의 했다, 더 많은 시간 isopentane는에 두뇌 동결 해야 했다. 시행 착오를 통해 좋은 동결 품질 (3.5 분)를 제공 하는 시간의 길이 결정 했다. Megabrain 더 이상; isopentane에 남아 있을 수 있습니다. 그러나, 온도-45 ° C ~ 크래킹을 피하기 위해-50 ° C의 범위에서 유지 해야 OCT.
Megabrain 슬라이드에 조직의 많은 별도 조각으로 조직을 건조 하 고 결과적으로 솔 질 단계 동안 더 취 성이 될 수 있다 가능 하다. 이 문제를 방지 하기 위해 PBS의 드롭 그것은 밖으로 닦 았 때까지 축축한 유지 각 개인의 두뇌 부분에 넣어 되어야 합니다.
Hemisecting의 기술 두뇌는 이것이 필요 하 고, 연구에 대 한 좋은 결과 얻기에 중대 하다.입니다. 때 hemisecting는 두뇌, 그것은 중요이 이등분 올바른 반구와 그대로 모든 뇌 영역을 보장 하기 위해 정확 하 게 이루어집니다. 만약 소 뇌 또는 후 각 전구 연구에 관련이 없습니다, 그들은 제거할 수 있습니다. 그 때 정돈 될 필요가 있을 것 이다 조직의 양을 줄여이 '과잉' 조직을 제거 cryosectioning. 소 뇌 제거 동결 하기 전에 OCT에서 더 쉽게 일어 머리 수 있습니다.
밖으로 솔 질 되 고, 슬라이드의 가장자리에서 조직 섹션 유지. 이로써 PAP 펜을 둘러싸고 일부 immunohistochemistry 프로토콜의 요구 사항은 조직의 소수 배리어의 라인을 위한 공간. 또한, 우주는 coverslip 필요 합니다.
반구/뇌 하거나 동결 Megabrain 동안 라 네, 하는 경우 다음 섹션 되지 않습니다 공동 대패 질. 유사한 결과 한 두뇌는 하나의 Megabrain에 다른 사람 보다 큰 경우 발생할 수 있습니다. 이것을 극복 하기 위해 더 많은 슬라이드 brain(s)에 관심의 적절 한 영역에 있는 얼룩을 선택할 수 있습니다.
이 기술의 한 가지 한계는 조직의 모든 10 월;의 한 블록에 냉동은 기술 오류 나쁜 고정 된 잘못 된 온도 같은 경우 여러 동물에서 조직 될 것 이다 (단지 1이 아니라 5-9 동물 두뇌) 영향을. 이것은 더 문제가 나머지 반구 냉동 고 원하는 섹션을 단독으로 구분 될 수 있기 때문에 전체 뇌 및 하지 hemisected 섹션을 사용 하는 경우.
이 방법에 또 다른 한계는 그는 Megabrain를 잘라 cryostat 조정할 때 가장 적합된 한 접근 방식을 촬영 해야 합니다. 이것은 서로 약간 다른 각도에서 되 고 모든 두뇌 반면 singularly 냉동된 뇌를 구분 하는 경우이 문제가 아니다. 함으로써 냉동 하는 동안 이것의 효과 최소화할 수 있습니다 두뇌는 직 립 하 고 비슷한 크기의.
사용 하 여이 기술을 유일 하 게 두뇌 동결에 그것 고정 소요 된 전체 시간을 단축 하 고 최대 90%까지, 9 1 두뇌 같은 속도로 절단 되는 경우 절단 머리의 가장 큰 장점 중 하나입니다. 이 기술은의 다른 주요 장점은 얼룩이 질에 필요한 동물에서 조직을 포함 하는 슬라이드의 더 작은 수입니다. 모든 슬라이드에 동일한 라운드 스테인드는 이후 안정성과 균일성 immunohistochemical 얼룩의 증가. 동시에 스테인드 슬라이드 사이 불일치 될 수 있지만 따라서 가변성을 감소 하 고 분석의 타당성을 증가 한 Megabrain 단일 슬라이드에 나타낼 여러 연구 두뇌를 허용할 수 있습니다. 일관 된 얼룩 장점은 모든 조직학 연구에이 기술을 사용 하 여의 주요 의미입니다. 마지막으로, 적은 슬라이드는 또한 낮은 공급 비용을 부담 한다.
이 기술은 설치류 두뇌의 절단 화살 섹션에 대 한 쉽게 수정 될 수 있습니다. 그것은 또한 cryosectioning 다른 동물 모델 및 조직, 근육 이나 간 샘플 등의 다른 종류에서 조직에서에서 사용 하기 위해 적응 수 있습니다. 프로토콜에 적응 했을 만들 수, 솔루션의 최적화를 포함 한 사용, cryostat 블레이드/무대의 크기와 포함 형의 볼륨.
이 기술은 또한 수 부동성 기술에 맞게 어디 프로토콜 그대로 일 것 이다 단계 4.6까지. 이 단계에서 두뇌 구분 되며 얼룩이 질을 별도 판 우물에 해제 할 것 이다. 추가 관리 정렬 과정에서 뇌 조각 혼동를 하지 않도록 해야 합니다.
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Disclosures
저자 아무 공개 있다.
Acknowledgments
PCH 임무 지원 자금 지원이 원고에 보고 된 연구. 저자는 다니엘 그리피스 그림에 사용 되는 이미지를 복용 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) - white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
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