Summary
Her presenterer vi en protokoll for å fryse og delen hjernevevet fra flere dyr som en tidsbesparende alternativ til behandling enkelt hjerner. Dette reduserer flekker variasjon i immunohistochemistry og reduserer tid og kryosnitt og bildebehandling.
Abstract
Histologi og immunohistochemistry er rutinemessig analysemetoder å visualisere mikroskopiske anatomi og lokalisere proteiner i biologisk vev. I nevrovitenskap, samt en mengde andre vitenskapelige områder brukes disse teknikkene. Immunohistochemistry kan gjøres på lysbilde montert vev eller frittflytende deler. Forbereder lysbilde montert prøver er en tid intensiv prosess. Følgende protokollen for et teknikk, kalt Megabrain, redusert tiden det tar å cryosection og mount hjernevev med opptil 90% ved å kombinere flere hjerner i en enkelt frosne blokk. Videre, denne teknikken redusert variasjon sett mellom flekker runder, i en stor histochemical studie. Gjeldende teknikken er optimalisert for bruk av gnager hjernevev i nedstrøms immunohistochemical analyser; men kan det brukes til forskjellige vitenskapelige felt som bruker og kryosnitt.
Introduction
Her presenterer vi protokoll for en ny metode, som vi kaller Megabrain, utviklet for å cryosection flere gnager hjerner samtidig for nedstrøms immunohistochemical prosedyrer. En Megabrain kan for produksjon av enkeltlysbilder som inneholder vev fra flere dyr. Denne teknikken er blitt optimert for å kutte framskaffet 9 voksen rotte halvkuler eller 5 voksne full hjernen, samtidig. Derfor er teknikken mest aktuelt i store immunohistochemical studier eller andre analyser gjort på lysbilde montert hjernevevet fra en stor kohort av dyr.
Immunohistochemistry innebærer bruk av spesifikke antistoffer rettet mot proteiner av interesse å forstå og karakterisere deres uttrykk og mobilnettet endringer i bestemte vev1,2,3. Bruk av immunohistochemistry er utbredt i nevrovitenskap forskning, blant andre vitenskapelige disipliner, hjelpe i mobilnettet og molekylære forståelsen av hjernen4. Store studier som involverer mange dyr og hjernen delene kan være både ressurser og tid intensiv. Som sådan, det er en mangefasettert begrunnelsen bak utviklingen av Megabrain: å redusere tid brukt og kryosnitt, montering og flekker vev, mens du bruker derfor mindre reagenser. Dessuten mulighet til å strømlinjeforme prosessen og flekken flere hjerner i samme runde bidrar til å lindre noen av variasjon mellom flekker bunker, en begrensning av immunohistochemistry3. I tillegg snitting en Megabrain er en tidsbesparende alternativ til snitting personlige frosne gnager hjerner og gir mulighet for rask sammenligning av vev mellom dyr eller selv behandlingsgrupper av mikroskopi teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Megabrain teknikken er optimalisert ved hjelp av hele og hemisected hjernen fra mannlig voksen C57Bl6 mus5, juvenile Sprague-Dawley rotter og voksen Sprague-Dawley rotter som var transcardially parfyme med 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) fulgt med 4% paraformaldehyde6. Lignende resultater kan oppnås i andre stammer av mus og rotten, i begge kjønn og på ulike aldersgrupper. Studien å generere data for dette manuskriptet brukt juvenile Sprague-Dawley rotter og ble godkjent av University of Arizona institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen, og forsøksdyr ble stelt i henhold til Guide For omsorgen og bruk av laboratorium Dyr7.
1. Cryoprotection Perfused hjerner
- Følgende vellykket transcardial perfusjon6, samle hele hjernen6,8 fra dyr og etter fikse ved å plassere i 25 mL ampuller med 4% paraformaldehyde i PBS 24 h.
FORSIKTIG: Paraformaldehyde er et giftig vev bindemiddel; håndteres med forsiktighet. Overføre paraformaldehyde til en spesielt merket avfallsbeholderen som identifiserer sin konsentrasjon og volum innenfor kjemisk avtrekksvifte butikken i kjemisk avfall skap til avhendet kjemisk sikkerhet eller riktig trent personell. - Etter 24 timer har gått, i avtrekksvifte, fjerne hjernen fra 4% paraformaldehyde ved hjelp av en slikkepott. Overføre hjernen til ampuller med ca 20 mL 15% sucrose løsning i 1 x Tris-bufret saltvann (SS) til hjernen synker til bunns av ampullen (ca 24 h).
- Denne overføre hjernen til ampuller med ca 20 mL 30% sucrose løsning i 1 x TBS, inntil hjernen synker til bunns av ampullen (ca 24-48 timer).
2. hjernen frysing
- Plass en 500 mL glass kanne på en seng av tørris i en isen bøtte. Hell 300-400 mL isopentane (2 metyl-butan) i glass begeret.
- Tillate temperaturen på isopentane nå mellom-45 ° C og 50 ° C. Nøye overvåke og vedlikeholde denne temperaturområde med et termometer, holder den konstant gjennom prosedyren. Kontroller at temperaturavlesninger er tatt fra midten av løsningen, og ikke mens berører bunnen eller siden av begeret.
- På Borstemmaskin, fyller et engangskamera innebygging mold (se materialer liste) ca 1/2 full av Optimal kutte temperatur (OCT; se Tabellen for materiale) sammensatte. Kontroller at det er ingen luftbobler i Tilpasningsverktøy for Office. Hvis det er noen luftbobler fjerne dem med en spatel og nål.
-
Fjern første hjernen fra ampullen av 30% sukrose med en slikkepott. På dette punktet, Frys enten hjernen helt eller hemisect, avhengig av studien design.
- For hemisected hjernen, bruk en ny razor blad for å gjøre et rent kutt gjennom vev å skille halvkuler. Hvis det ikke kreves for studien, fjerne lillehjernen og olfactory pærer på dette stadiet. Hvis lillehjernen kreves for studien, er det foreslått for å skjære et flatt område på den bakre enden av hjernen til å hjelpe hjernen i stående i mold. Hvis studien krever bare vev fra en lokalisert region, kan en gnager hjernen matrise brukes til å blokkere hjernen basert på kjente koordinater.
- Gi hjernen en numerisk navngi system. Tegne et diagram som vist i figur 1. Skriv antall første hjernen plasseres i Megabrain formen i posisjon 2, forlater posisjon 1 som et mellomrom å hjelpe i rask identifisering av retningen som hjernen var frosset.
- Bruker sløv tang eller pinsett, plukke opp hjernen plasseres i posisjon 1. Plasser hjernen med siden kuttes første vendt oppover. Lavere hjernen i Tilpasningsverktøy for Office på riktig plassering, bruke pinsett til å justere sin posisjon til det står uavhengig.
- Gjenta 2.3-2.5 for de gjenværende hjerne/halvkulene å bli frosset i posisjoner 3-10. Unngå å plassere hjernen/halvkuler i en symmetrisk oppsett.
- Se gjennom alle 9 hjerner i Megabrain mold. Når hjernen står uavhengig, oppreist og riktig innrettet i Tilpasningsverktøy for Office (som vist i figur 2B), legge til flere OCT mold (til toppen av hjernen er dekket). Igjen, sikre at det er ingen synlige luftbobler i Tilpasningsverktøy for Office.
- Bruk tang til å holde hjørnet av mold, sikre tang ikke bli delvis neddykket i Tilpasningsverktøy for Office (figur 3A). Pass på å holde mold nivået, redusere mold i isopentane (-45 ° C-50 ° c) slik at bunnen tredje av mold er neddykket. Hold den her for å tillate bobler i Tilpasningsverktøy for Office til å stige til overflaten og fra vev (figur 3B).
- Etter 30 s, lavere hele mold i isopentane og utgivelsen fra tang, forlater Megabrain neddykket i minst 3 min (Figur 3 c). Sikre at mold holdes nivå, slik at hjernen være oppreist og equidistant (figur 3D).
- Etter 3 min innebygde Bruk tang fjerne mold som inneholder den frosne, OCT hjerner (figur 3E) fra isopentane.
- Umiddelbart, bryte mold og innholdet i aluminiumsfolie og Merk den med dyr tall eller Megabrain identifikasjon. Trykk den frosne Megabrain så lite som mulig for å unngå tining vevet.
- Denne Megabrain kan nå overført til 20 ° C fryser og lagres i minst 24 timer.
Merk: Protokollen kan pauses her og Megabrain kan lagres frosset til og kryosnitt finner sted.
3. forberedelser til Megabrain for snitting på kryostaten
- Angi CAB temperaturen på kryostaten til-19 ° C. Kontroller at denne temperaturen er nådd før du fortsetter. Gjennom snitting påse at CAB temperaturen mellom-18 ° C og 20 ° C.
- Ta av Megabrain fra 20 ° C fryseren og legg den i kryostaten. Også plassere en chuck riktig størrelsesdimensjoner og to tynne tippet pensler i kryostaten. La både i Megabrain og chuck i minst 15 minutter å komme til temperaturen på kryostaten kryostaten.
- Riktig merke lysbilder med identifikasjonsnummeret Megabrain og lysbildenummeret. Legg disse lysbildene på et lysbilde varmere (35-45 ° C).
- Pakke Megabrain fra aluminiumsfolie. Bruk et barberblad loddrett kutte hjørner av mold tillate enkel fjerning av blokken av OCT fra formen (figur 4A).
- Dispensere et tynt lag (ca 3 mm tykk) OCT på chuck.
- Raskt, med minimal kontakt mellom fingrene og Tilpasningsverktøy for Office, plass Megabrain på chuck, i retning ønsket. Store tang kan også brukes for dette trinnet for å minimere tining. Før du begynner å delen, la Megabrain montert chuck i kryostaten 15-20 min å tillate Tilpasningsverktøy for Office til å fryse helt.
- Når bakgrunnslaget for OCT har frosset, gjelder et 2 mm tykt lag OCT rundt sidene av Megabrain og tillate at dette skal kjøre ned fra sidene på chuck. Dette bidrar til å sikre Megabrain til chuck. Igjen, før du fortsetter, la Megabrain montert chuck i kryostaten 15-20 min til å tillate Tilpasningsverktøy for Office til å fryse.
- Bruk et barberblad for å fjerne alle overflødig OCT fra sidene og bunnen av chuck (figur 4B).
4. og kryosnitt Megabrain
- Før du starter, kontroller du at et beger som inneholder minst 20 mL 1 x PBS er tilgjengelig.
- Plasser chuck, montert med Megabrain, i chuck hodet på kryostaten (figur 4B).
- Angi kryostaten å kutte på ønsket tykkelse. Gjeldende metoder er optimalisert for 10 µm til 50 µm deler.
- Trimme Tilpasningsverktøy for Office og vev som kreves for å nå ønsket hjernen regionen for vev samling (figur 4C).
- Når du er klar å samle vev, lavere stabiliseringsplaten til den hviler på scenen og slå kryostaten håndtaket for å ta ett enkelt avsnitt. Sakte løfte av stabiliseringsplaten, pass på at den valgte Megabrain ikke er knyttet til stabiliseringsplaten og ikke faller av scenen Figur 4 d).
- Forsiktig bruke malekoster for å rulle delen Megabrain før det er liggende flatt på kryostaten scenen (figur 5A). (Eventuelt hold Tilpasningsverktøy flat bruke malekoster for å hindre rulle).
- Fjerne lysbilde fra lysbildet varmere og hold lysbildet etikettsiden ned over delen Megabrain på scenen at delen å holde seg til lysbildet.
- Raskt bruke en dråpe 1 x PBS avsnittene vev på lysbildet og tillater ikke dette tørke før de har vært børstet flat (se trinn 4,9).
- Bruk en fin tippet pensel dyppet i 1 x PBS børste ut bobler i vevet og brette vevet så den ligger flatt på lysbildet (figur 5B). Ta vare ikke å endre plasseringen av delene hjernen og dermed miste den relative plasseringen til andre vev deler. Manipulere vevet med forsiktighet for å unngå tårer. Hold hjernen deler fra kanten av lysbildet som ekstern plass kreves for dekkglassvæske og PAP penn programmet i noen flekker protokoller.
- Sett lysbildet tilbake på lysbildet varmere og tørt for 45 min. dekselet for å hindre støv seg på vev. Når tørr, lagrer du lysbildene i-80 ° c til fremme bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et positivt sluttresultat denne prosedyren er vev som ligger flatt på lysbildet uten bobler eller tårer, i retning der de ble frosset. Vev deler er avstand fra hverandre og lett identifiserbare på grunn av god plassering av hjernen i Tilpasningsverktøy for Office og god notasjon som vist i figur 1. Forutsatt at hjernevev ble samlet inn fra dyr av samme alder, og at vevet ble riktig justert i Tilpasningsverktøy for Office, skal inndelinger samlet på et lysbilde representere et lignende koronale fly, slik at sammenligning av hjernen regioner mellom dyr. Forutsatt at vevet har frosset godt, med minimal fryse gjenstand, utføres H & E flekken for å vurdere cryoprotection kvalitet9. Immunohistochemistry kan utføres som vist med den flekker vist i figur 6.
Figur 1: representant diagram av en foreslått Megabrain layout. Dette viser notasjonen posisjon av vev fra 9 forskjellige dyr. Tall systemet er utformet som vist; men kan noen nummereringssystemet brukes. "X" er breddeområdet designet for tydelig å vise retningen som vevet var frosset. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: feil og riktig plassert hjerner i mold. (A) hjernen halvkuler dårlig justert i OCT fra toppen og siden. (B) godt justert hjernen halvkuler i OCT fra toppen og siden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: stadier av hjernen frysing. (A) Megabrain før de går inn i-45 ° C isopentane. (B) Megabrain når neddykket i isopentane. (C) Megabrain neddykket fullstendig i isopentane. (D) Megabrain senkes ned i isopentane, viser at hjernen bør holde oppreist og samme avstand fra hverandre under denne prosessen. (E) A frosset Megabrain i en innebygging mold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: viktige stadier i kutte en Megabrain. (A) Megabrain blir fjernet fra innebygging mold i kryostaten. (B) Chuck montert med Megabrain. (C) trimmet Megabrain. (D) Megabrain delen på kryostaten scenen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: pre og post montert Megabrain delen. (A) frosset Megabrain delen (40 µm) på kryostaten scenen. (B) Glass lysbilde montert med Megabrain vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: immunhistokjemi av en Megabrain lysbilde farget med Iba1. (A) vev fra en Megbrain viser uniform flekker mellom forskjellige hjerner i en studie. (B) 20 x mikroskopiske bilder tatt fra somatosensory fat (S1BF)-feltet cortex regionen hver montert hjernen, viser konsekvent ionisert kalsium-bindende kortet molekylet 1 (Iba1) farging av microglia mellom hjerner. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det bør vurderes under denne prosedyren at temperaturen på Megabrain og omegn må overvåkes kontinuerlig for å hindre tining og re frysing av vev. Hjernen kan bare fjernes fra 20 ° C fryseren opp til 3 ganger som hver gang det rørte og venstre i kryostaten, med en varmere varierende temperatur, vevet thaws og refreezes, forårsaker en gelé som tekstur og unormale vevet integritet10. Derfor er det optimale å kutte Megabrain samtidig.
Vev fiksering og cryoprotection er viktige deler av denne protokollen til å minimere crystal isdannelse, redusere eksterne mikrobiell vekst og stoppe enzymatiske reaksjoner, dermed bevare vev integritet10. Hvis hjernen ikke cryoprotected med sukker, kan deretter vann i vevet danne iskrystaller under frysepunktet prosessen som makulere vevet og forårsake hull til skjemaet. Mens vi foreslår føljetong fortynninger av sukrose i SS, kan hjernen plasseres direkte i 30% sukrose lengre (48-72 timer) å oppnå lignende cryoprotection. Men anbefales det sterkt at sukrose løsningene er laget med TBSen variasjoner som bruk av PBS eller vann vil resultere i fattig cryoprotection av Megabrain og dårlig vevet kvalitet. Haematoxylin og Eosin (H & E) flekken kan brukes til å vurdere kvaliteten på cryoprotection og påfølgende fryse gjenstand11. God vevet kvalitet (med minimal hull) er viktig i histologiske studier som hullene kan forstyrre binding av antistoffer, samt redusere vev integriteten til celler med fine prosesser, som kan påvirke analyse av noen flekker. Unngå symmetrisk plassering av hjernen, da dette kan føre til forvirring når du prøver å identifisere det dyr som hver hjernen ble innhentet.
Gjeldende teknikken er optimalisert for framskaffet; men kan det enkelt tilpasses til å kutte sagittal og transverse. Endringene kutte krever aktuelle varianten av hjernen plasseringen i trinn 2.5 gjennom 2.7. Det bør bemerkes at disse tilpasninger kan redusere antall hjernen som kan passe inn i en innebygging mold.
En viktig endring av denne teknikken er mellomrom i posisjonsnummer 1 (som vist i figur 1). Denne plassen er beregnet på tillater enkel identifisering av Megabrain retning, og derfor identifisere det dyr knyttet til hvert hjernen.
Denne teknikken er endret for å tillate vev fra et større antall dyr frosset og kuttet samtidig i Megabrain. Størrelsen på gnager hjernen er avhengig av kjønn, alder og arter derfor; antallet Hjerner som passer i mold kan variere. Det anbefales ikke å skille ulike aldre, kjønn eller behandlingsgrupper i eget Megabrains. Selv om dette kan sikre størrelse ensartethet, kan det også øke partiskhet og subjektivitet under bildebehandling og analyse. Dessuten, er det uunngåelig avvik mellom lysbildene under immunohistochemistry i noen protokoll, som føre til farging inkonsekvens mellom alderen/sex grupper.
En rektangulær, større chuck ble brukt i stedet for en runde, som økt støtte bak Megabrain.
Som mold og innholdet var et større volum enn en entall hjernen i en OCT mold, var mer tid nødvendig å fryse hjernen i isopentane. Gjennom prøving og feiling identifiserte et tidsrom som gitt gode fryse kvalitet (3,5 minutter). Megabrain kan bli liggende i isopentane lenger; men temperaturen må være i størrelsesorden-45 ° C-50 ° c å unngå sprekkdannelse Tilpasningsverktøy for Office.
Det er mange separate biter av vev på Megabrain lysbildet, er det mulig at vev kan tørke ut og dermed blir mer sprø under børsting trinnene. For å bekjempe dette problemet, bør en dråpe PBS settes på hver individuelle hjernen del å holde den fuktige før det er børstet ut.
Teknikken av hemisecting hjernen, for en studie der dette kreves, er avgjørende for å oppnå gode resultater. Når hemisecting hjernen, er det viktig at denne bisection er gjort nettopp for å sikre at alle områder av hjernen er intakt med den riktige halvkulen. Hvis lillehjernen eller olfactory pærer ikke er relevant for studien, kan de bli fjernet. Fjerne denne 'overflødig' vev reduserer vev som må trimmes når og kryosnitt. Fjerne lillehjernen lar hjerne til å stå opp lettere i Tilpasningsverktøy for Office før frysing.
Stund tilværelse penselen ut, holde delene vev fra kanten av lysbildet. Dette gir rom for en rekke PAP penn, en hydrofobe barriere, omgi i vevet, som er et krav for noen immunohistochemistry protokoller. I tillegg trenger plass til dekkglassvæske.
Hvis halvkule/hjernen faller eller vipper under Megabrain frysing, kan ikke delene co planer. Et lignende resultat kan resultere hvis én hjerne er større enn de andre i en enkelt Megabrain. For å overvinne dette, kan lysbilder velges stain der brain(s) i spørsmålet er i området rundt.
En begrensning av denne teknikken er at som alle vev er frosset i en blokk med OCT; Hvis det er tekniske feil, slik som en dårlig fryse på grunn av en feil temperatur, og vev fra flere dyr blir berørt (5-9 dyr hjerner i stedet for bare 1). Dette er mer et problem når du bruker full hjernen og ikke hemisected deler, fordi den gjenværende halvkulen kan være frosset og delt enkeltvis for å få de ønskede delene.
En annen begrensning til denne metoden er at når du justerer kryostaten å kutte Megabrain, en regresjonslinje tilnærming må tas. Dette skyldes alle hjerner på litt forskjellige vinkler til hverandre, mens dette ikke er et problem ved snitting av en særdeles frosne hjerne. Effekten av dette kan minimeres under frysing ved hjerner er oppreist og av samme størrelse.
En av de største fordelene med denne teknikken over frysepunktet hjerner bemerkelsesverdig er at det forkorter den totale tiden tilbrakte frysing og kutte hjernen med opptil 90%, hvis 9 er kuttet i samme tempo som 1 hjerne. Andre nøkkelen fordel av denne teknikken er at det tillater et mindre antall lysbilder som inneholder vev fra nødvendig dyrene å bli farget. Dette øker påliteligheten og enhetlig immunohistochemical flekker, siden alle lysbildene er beiset i samme runde. Det kan være inkonsekvens mellom lysbilder farget samtidig, men en Megabrain kan tillate flere studie hjerner å være representert på ett lysbilde, dermed reduserer variasjon og øke gyldigheten av analysen. Har konsekvent flekker er en viktig fordel i alle histologiske studier og en stor betydning for å bruke denne teknikken. Til slutt, færre lysbilder også pådrar lavere forbruk koster.
Denne teknikken kan enkelt endres for kutte sagittal deler av en gnager hjerne. Det kan også være tilpasset for bruk i og kryosnitt vev fra forskjellige dyr modeller og ulike typer vev som muskel eller leveren. Tilpasninger til protokollen måtte gjøres, inkludert optimalisering av beløpet av løsninger brukes, størrelsen på kryostaten blad/scenen, og volumet av innebygging mold.
Denne teknikken kan også være tilpasset frittflytende teknikker, der protokollen ville forbli den samme inntil trinn 4.6. På dette trinnet må hjerner være atskilt og løftet i separat plate brønner å være farget. Ekstra forsiktighet må tas ikke å forvirre hjernen sektorene i sortering prosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
PCH oppdrag Support fond støtte forskning rapportert i dette manuskriptet. Forfatterne vil gjerne takke Daniel Griffiths for å ta bilder som brukes i tallene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) - white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology? Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).
- Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
- Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).
